CN115919831B - 苯甲酸酯类化合物在抑制尿酸转运体蛋白1的活性及制备治疗高尿酸血症的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，本发明提供了苯甲酸酯类化合物在抑制尿酸转运体蛋白1的活性及制备治疗高尿酸血症的药物中的应用。本发明通过药物靶点筛选出一种高效抑制尿酸转运体蛋白1(URAT1)表达的苯甲酸丁酯，同时，苯甲酸丁酯也抑制了HK‑2对尿酸的重吸收作用。用cck‑8细胞毒性的方法检测苯甲酸丁酯对HK‑2的细胞毒性，结果显示没有任何毒性作用。其次，在体内高尿酸血症小鼠中，苯甲酸丁酯也显著降低了高尿酸血症小鼠的血清尿酸。本发明中的苯甲酸丁酯具有靶点清楚、药效显著、安全易的优点，在治疗高尿酸血症方面具有潜在应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及苯甲酸酯类化合物在抑制尿酸转运体蛋白1的活性及制备治疗高尿酸血症的药物中的应用。
背景技术
随着人们生活质量的提高，以及饮食结构的改变，特别是大量摄入含蛋白质和嘌呤的食物，人们的血尿酸水平往往在较年轻的时候就升高，这使得高尿酸血症逐渐趋向年轻化，高尿酸血症的发病率也逐渐增加。到目前为止，高尿酸血症(HUA)是继高血压、高脂血症和高血糖症之后第四常见的公共卫生问题。
临床上常见高尿酸血症患者多由嘌呤代谢异常和尿酸排泄不足引发，尿酸约有1/3通过肠道排泄，约有2/3的尿酸通过肾脏排泄，约90％尿酸在近曲小管吸收重新回血。因此高尿酸血症的发生也与近曲小管上多种与尿酸转运相关的转运体如尿酸转运体蛋白1(URAT1)、葡萄糖转运体9(GLUT9)等尿酸转运体功能异常息息相关。然而，据报道，一线降尿酸药物如苯溴马隆、别嘌醇会引起致命的不良反应，因此，寻找有效且毒副作用小的尿酸转运体抑制剂迫在眉睫。
发明内容
为克服现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供了苯甲酸酯类化合物在抑制尿酸转运体蛋白1的活性及制备治疗高尿酸血症的药物中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了苯甲酸酯类化合物在抑制尿酸转运体蛋白1的活性中的应用。
优选的，所述苯甲酸酯类化合物包括苯甲酸丁酯。
本发明还提供了苯甲酸酯类化合物在制备抑制尿酸转运体蛋白1的试剂中的应用。
优选的，所述苯甲酸酯类化合物包括苯甲酸丁酯。
本发明还提供了苯甲酸酯类化合物在抑制细胞尿酸重吸收中的应用。
优选的，所述苯甲酸酯类化合物包括苯甲酸丁酯。
本发明还提供了苯甲酸酯类化合物在制备治疗高尿酸血症的药物中的应用。
优选的，所述苯甲酸酯类化合物包括苯甲酸丁酯。
优选的，所述药物的剂型包括注射剂、散剂、颗粒剂、粉剂、丸剂、口服液或片剂。
优选的，所述药物中还含有药学上可接受的辅料。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、本发明通过药物靶点筛选出一种高效抑制尿酸转运体蛋白1(URAT1)表达的苯甲酸丁酯，同时，苯甲酸丁酯也抑制了HK-2对尿酸的重吸收作用。用cck-8细胞毒性的方法检测苯甲酸丁酯对HK-2的细胞毒性，结果显示没有任何毒性作用。其次，在体内高尿酸血症小鼠中，苯甲酸丁酯也显著降低了高尿酸血症小鼠的血清尿酸。
2、针对高尿酸日渐年轻化，发病几率越来越高，相对于一线降尿酸药物如苯溴马隆、别嘌醇会引起致命的不良反应，本发明中的苯甲酸丁酯具有靶点清楚、药效显著、安全易的优点。本发明提供了一个新的尿酸转运体蛋白1(URAT1)的抑制剂，在治疗高尿酸血症方面具有潜在应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为实施例1的苯甲酸对HK-2细胞尿酸转运体蛋白1(URAT1)的抑制作用(注：“+”表示添加了200μg/mL的尿酸；“-”表示没有添加200μg/mL的尿酸)；
图2为实施例2的苯甲酸丁酯对HK-2细胞没有细胞毒性(注：“****”表示差异显著；“ns”表示无差异)；
图3为实施例3的苯甲酸丁酯对HK-2细胞尿酸转运体蛋白1(URAT1)的抑制作用(注：“****”表示差异显著；“+”表示添加了200μg/mL的尿酸；“-”表示没有添加200μg/mL的尿酸)；
图4为实施例4的苯甲酸丁酯对HK-2细胞尿酸重吸收抑制作用(注：“****”表示差异显著)；
图5为实施例5的苯甲酸丁酯显著降低高尿酸血症小鼠血清尿酸(注：“****”表示差异显著)；
图6为本发明苯甲酸酯类化合物的结构式。
具体实施方式
本发明提供了苯甲酸酯类化合物在抑制尿酸转运体蛋白1的活性中的应用。
在本发明中，所述苯甲酸酯类化合物优选包括苯甲酸丁酯。
本发明还提供了苯甲酸酯类化合物在制备抑制尿酸转运体蛋白1的试剂中的应用。
在本发明中，所述苯甲酸酯类化合物优选包括苯甲酸丁酯。
本发明还提供了苯甲酸酯类化合物在抑制细胞尿酸重吸收中的应用。
在本发明中，所述苯甲酸酯类化合物优选包括苯甲酸丁酯。
本发明还提供了苯甲酸酯类化合物在制备治疗高尿酸血症的药物中的应用。
在本发明中，所述苯甲酸酯类化合物优选包括苯甲酸丁酯。
在本发明中，所述药物的剂型优选包括注射剂、散剂、颗粒剂、粉剂、丸剂、口服液或片剂。
在本发明中，所述药物中还优选含有药学上可接受的辅料。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
检测苯甲酸对尿酸转运体1(URAT1)的抑制效果：
(1)准确称量100mg尿酸加入8.4ml灭菌水和1.6mL1M氢氧化钠配成10μg/μL的尿酸溶液，准确称量10mg苯溴马隆溶于1mLDMSO配成10μg/μL，准确称量苯甲酸10mg溶于DMSO并稀释成200μg/μL，100μg/μL，50μg/μL，10μg/μL，1μg/μL，0.1μg/μL，0.01μg/μL，在超净工作台中用0.22μm的滤膜过滤后使用。
(2)将HK-2细胞铺板到12孔板，待细胞密度长到80％左右，将其分为空白组：正常培养基；模型组：含200μg尿酸/mL培养基；阳性药组：含10μg苯溴马隆/mL+200μg尿酸/mL培养基；给药组：浓度依次为200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，10μg/mL，1μg/mL，0.1μg/mL，0.01μg/mL的含苯甲酸+200μg尿酸/mL培养基；溶剂组：含1‰DMSO的培养基+200μg尿酸/mL培养基，加药刺激24h。
(3)WB：倒出所以培养基，12孔板加入100μL强RIPA，裂解30分钟，吸到离心管中，放入离心机12000转离心15分钟，吸出沉淀，加入1/4蛋白loading。在SDS-PAGE胶每孔上样20μL，80V，30分钟，120V，1h，将胶上蛋白转到PVDF膜上，200mA，2h，5％脱脂牛奶封闭1h，1抗(URAT1)过夜，TBST三次5分钟，二抗(R)1h，TBST三次5分钟，显影。
结果如图1所示。由图1可知，在HK-2细胞中添加尿酸后，尿酸转运体表达升高，加入苯甲酸后，苯甲酸对尿酸转运体1(URAT1)有一定抑制效果，但抑制效果不明显，通过结构优化以及构效关系推测苯甲酸酯类化合物可能具有比较好的抑制活性，并且之类化合物在体内可以很好的入血从而发挥作用。
实施例2
药物发挥作用的前提是对细胞没有毒性，所以化合物毒性是首要考虑的问题。检测苯甲酸丁酯对HK-2的细胞毒性，具体步骤如下：
(1)苯甲酸丁酯稀释成200μg/μL，100μg/μL，50μg/μL，10μg/μL，1μg/μL，0.1μg/μL，0.01μg/μL，在超净工作台中用0.22μm的滤膜过滤后使用。
(2)将HK-2细胞铺板到96孔板上，待细胞密度长到60％左右，将其分为空白组：正常培养基100μL；对照组：含10％DMSO培养基100μL；实验组：浓度依次为200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，10μg/mL，1μg/mL，0.1μg/mL，0.01μg/mL的含苯甲酸丁酯的培养基100μL。依次加入96孔板中，恒温培养箱培养24h后，每孔加入培养基1/10的cck-8试剂，恒温培养箱培养反应1.5h，酶标仪上检测。
结果如图2所示。由图2可知，苯甲酸丁酯与HK-2共同孵育24h后进行细胞活力的检测，发现苯甲酸丁酯对HK-2细胞没有细胞毒性，并且还出现了一点促进细胞生长的作用。
实施例3
临床上大部分高尿酸血症患者都是因为尿酸排泄障碍导致的，大多数尿酸(三分之二)在肾脏中排泄，主要由近端小管中的一系列转运蛋白排出，其中尿酸转运体蛋白1(URAT1)尤为重要，它也是一些上市治疗高尿酸血症药物的靶点。所以以尿酸转运体蛋白1(URAT1)为靶点去考察苯甲酸丁酯的抑制效果。检测苯甲酸丁酯对HK-2尿酸转运体蛋白1(URAT1)的抑制作用，具体步骤如下：
(1)准确称量100mg尿酸加入8.4ml灭菌水和1.6mL1M氢氧化钠配成10μg/μL的尿酸溶液，称量10mg苯溴马隆溶于1mLDMSO配成10μg/μL，苯甲酸丁酯稀释成200μg/μL，100μg/μL，50μg/μL，10μg/μL，1μg/μL，0.1μg/μL，0.01μg/μL，在超净工作台中用0.22μm的滤膜过滤后使用。
(2)将HK-2细胞铺板到12孔板，待细胞密度长到80％左右，将其分为空白组：正常培养基；模型组：含200μg尿酸/mL培养基；阳性药组：含10μg苯溴马隆/mL+200μg尿酸/mL培养基；给药组：浓度依次为200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，10μg/mL，1μg/mL，0.1μg/mL，0.01μg/mL的含苯甲酸丁酯+200μg尿酸/mL培养基；溶剂组：含1‰DMSO的培养基+200μg尿酸/mL培养基。加药刺激24h。
(3)WB：倒出所以培养基，12孔板加入100μL强RIPA，裂解30分钟，吸到离心管中，放入离心机12000转离心15分钟，吸出沉淀，加入1/4蛋白loading。在SDS-PAGE胶每孔上样20μL，80V，30分钟，120V，1h，将胶上蛋白转到PVDF膜上，200mA，2h，5％脱脂牛奶封闭1h，1抗(URAT1)过夜，TBST三次5分钟，二抗(R)1h，TBST三次5分钟，显影。
结果如图3所示。由图3可知，在HK-2细胞中添加尿酸后，尿酸转运体表达升高，加入苯甲酸丁酯后，苯甲酸丁酯对尿酸转运体蛋白1(URAT1)有非常好的抑制效果，甚至比阳性药物苯溴马隆抑制效果还要好，并对三次重复实验扫描后发现1μg/mL的苯甲酸丁酯对尿酸转运体蛋白1(URAT1)的抑制效果最佳。
实施例4
检测苯甲酸丁酯对HK-2细胞的尿酸重吸收抑制作用，将HK-2细胞铺板到12孔板，待细胞长至80％左右，将其分为空白组：正常培养基；模型组：含200μg尿酸/mL培养基；阳性药组：含10μg苯溴马隆/mL；给药组：1μg/mL含苯甲酸丁酯培养基。培养24h后，向每个孔中加入80μg/mL含尿酸的培养基，然后分别在5min；10min；15min；30min分别从每个孔中吸出10μL培养基用尿酸试剂盒检测细胞外液尿酸的含量。
结果如图4所示。由图4可知，在苯甲酸丁酯处理HK-2细胞后，显著抑制了HK-2细胞对尿酸的重吸收作用。
实施例5
体外有效不代表体内有效，为验证苯甲酸丁酯在体内是否有效，建立了高尿酸血症小鼠模型。检测苯甲酸丁酯在体内治疗高尿酸血症的效果，具体步骤如下：
准备30只5周km雄鼠，适应性饲养一周，空白组不处理；模型组连续四周灌胃2400mg/kg氧嗪酸钾；阳性组在造模后两周给氧嗪酸钾1h后灌胃10mg/kg苯溴马隆；给药组在造模后两周给氧嗪酸钾1h后灌胃100mg/kg苯甲酸丁酯和200mg/kg苯甲酸丁酯。实验结束后取小鼠的血，检测尿酸含量。
结果如图5所示。由图5可知，在连续灌胃氧嗪酸钾四周后，小鼠血清尿酸明显升高，说明高尿酸小鼠模型构建成功，在灌胃苯甲酸丁酯后，与模型组对比，显著减低了小鼠血清尿酸浓度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.苯甲酸丁酯在制备治疗高尿酸血症的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括注射剂、散剂、颗粒剂、粉剂、丸剂、口服液或片剂。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物中还含有药学上可接受的辅料。
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