CN118045095A - 白芥子苷在制备抗轮状病毒药物中的应用 - Google Patents

白芥子苷在制备抗轮状病毒药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了白芥子苷在制备抗轮状病毒药物中的应用，属于生物技术领域。本发明公开的白芥子苷在制备抗轮状病毒药物中的应用，SNB对RV有一定的直接抑制作用及抗生物合成作用。SNB可通过抑制结构蛋白VP6基因的表达发挥抗RV的作用。

Description

白芥子苷在制备抗轮状病毒药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及白芥子苷在制备抗轮状病毒药物中的应用。
背景技术
轮状病毒(Rotavirus，RV)是呼肠孤科的一种无包膜双链RNA病毒，其基因组有11条双链RNA，分别编码6种结构蛋白(VP1～VP4、VP6与VP7)与6种非结构蛋白(NSP1～NSP6)。RV是引起5岁以下婴幼儿急性胃肠炎腹泻的主要病原体，全球每年约有1.3亿人发生感染，超过20万人死亡，其高度传染性和致病性对整个社会造成极大的危害。目前尚无抗RV特效药，抗RV疫苗具有潜在的肠叠套及夹杂传染性PCV基因的风险，并被报道在发展中国家和低收入地区效果差，其可及性和作用效果有限。且RV毒株的变异性、多样性使其预防毒株的范围有限。因此，防治轮状病毒感染具有重要意义。
白芥子苷(Sinalbin，SNB)是一种从十字花科植物白芥的成熟干燥种子(Theseeds of Sinapis alba L.)中提取的硫苷类化合物。文献研究表明，SNB能够明显降低大鼠肉芽肿增生，对金葡菌、李斯特菌等也有良好的抑制效果，显示出一定的抗炎抗菌活性；此外还具有抗氧化、抗肿瘤等作用。但目前SNB的药理作用缺乏深入的研究，尚未见有SNB抗RV的文献报道。
因此，提供白芥子苷在制备抗轮状病毒药物中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了白芥子苷在制备抗轮状病毒药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
白芥子苷在制备抗轮状病毒药物中的应用，白芥子苷的化学结构式见图1。
白芥子苷在制备抗轮状病毒生物合成药物中的应用。
进一步，所述轮状病毒为RV-WA株。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了白芥子苷在制备抗轮状病毒药物中的应用，SNB对RV有一定的直接抑制作用及抗生物合成作用，没有明显抗RV吸附的作用。SNB可通过抑制结构蛋白VP6基因的表达发挥抗RV的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为SNB化学结构式；
图2附图为本发明RV病毒感染前后的MA104细胞；
其中，A：正常MA104细胞；B：RV感染48h后的MA104细胞；
图3附图为本发明SNB对细胞的毒性结果；N，对照组，即未用药组；
图4附图为本发明SNB抗RV吸附作用；与Ribavirin组比较，*P<0.05；
图5附图为本发明SNB对RV直接抑制作用；与Ribavirin组相比，****P＜0.0001；
图6附图为本发明SNB抗RV生物合成作用；与Ribavirin组比较，**P<0.01，***P<0.001；
图7附图为本发明RV-VP6基因的相对表达量(SNB对RV直接抑制作用，与RV组比较，****p<0.0001)；
图8附图为本发明RV-VP6基因的相对表达量(SNB抗RV生物合成作用，与RV组比较，****p<0.0001)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
胎牛血清、高糖DMEM培养液购自美国GIBCO公司；0.25％胰蛋白酶消化液、含EDTA0.25％胰蛋白酶消化液、抗青链霉素(双抗)购自北京索莱宝公司；MA104细胞株来自中山大学细胞库；RV-Wa株来自第三军医大学免疫研究所；1×PBS磷酸盐缓冲液购自江苏碧云天生物技术研究所。
SNB母液：称取SNB标准品(LotNo：CFS202301，武汉中标科技有限公司)适量，纯度≥98％，在超净台内加高糖DMEM培养液溶解，用一次性无菌针管将药液通过0.22μM滤膜过滤除菌，配置母液为1mM。
Ribavirin液：100mg/mL Ribavirin母液放于4℃保存，用高糖DMEM培养液稀释到1mg/mL作为阳性对照组(现配现用)。
含10％胎牛血清的DMEM培养液：在超净工作台内将5mL胎牛血清和0.5mL双抗依次加入44.5mL的高糖DMEM培养液中，充分混匀后放于标记好的50mL离心管中，封口，4℃保存。
10μg/mL不含EDTA的胰酶：0.25％胰蛋白酶消化液(0.25g胰酶/100mL，2500μg/mL)用高糖DMEM培养液稀释至10μg/mL。
RV生长维持液：0.25％胰蛋白酶消化液(0.25g胰酶/100mL，2500μg/mL)用高糖DMEM培养液稀释至1μg/mL。
统计数据分析：
所有实验均重复三次。实验数据采用均数±标准差(ˉx±s)表示。采用SPSS软件统计数据，两组间比较采用t检验，多组间均数的比较采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异具有统计学差异。得到的数据结果以平均值±标准差的形式表示。数据分析采用统计分析软件Graphpad prism8.0进行Mann–Whitney统计。
实施例1 RV感染MA104细胞
将MA104细胞消化传代后，取出新的细胞培养瓶，加入1mL细胞混悬液和3mL含10％胎牛血清的DMEM培养液，37℃、5％CO2孵育48h，待细胞生长至单层，可用于RV扩增。先将RV-Wa株置于37℃水浴锅中融化，取500μL RV病毒液与500μL 10μg/mL不含EDTA的胰酶充分混匀，37℃、5％CO2孵育30min。随后取出生长至单层的MA104细胞瓶，先用磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7)清洗一次，再用高糖DMEM培养液润洗两次，随后加入孵育好的1mL病毒液，再往细胞培养瓶中加入3mL RV生长维持液。病毒感染后的MA104细胞会发生细胞病变CPE(Cytopathic effect)，当病变程度达到75％时，-20℃冰箱中冻存。重复冻存和融化过程3次后，低温离心，收取上清，即为病毒液。重复上述过程，扩增RV。
RV-Wa株病毒感染前后的MA104细胞见图2，正常MA104细胞形状为三角形或梭形，细胞轮廓明显清晰；感染RV后的MA104细胞，细胞发生明显病变，细胞边界变得模糊，细胞间距离增大，细胞内黑色颗粒增加，最后细胞完全脱落，漂浮。
实施例2 CCK8法检测SNB对MA104细胞的毒性
根据SNB常用药物浓度范围，本实验在0.39-50μM之间进行细胞毒性预实验。取对数生长期的MA104细胞于显微镜下观察，细胞形态均一饱满，边缘清晰且数量达到80％时，进行消化、离心和重悬，混悬液进一步稀释后取10μL于血细胞计数板上计数，计算所需细胞体积。随后在96孔板中细胞铺板，每孔加100μL细胞混悬液，细胞密度为10×104个/mL。待细胞贴壁成单层时给药，对照组只加入等体积高糖DMEM培养液。孵育48h后，CCK-8试剂盒检测SNB的细胞毒性。每孔加入1/10体积的CCK-8溶液，培养箱中孵育，1h后于450nm波长下检测并记录吸光度。细胞的相对存活率公式为：
{(A实验组-A空白)/(A对照组-A空白)×100％}
结果见图3，SNB药物浓度在0.39μM-50μM之间，对细胞没有药物毒性且平均存活率为90％以上。与对照组相比，SNB在0.39μM-50μM时药物组细胞活力无明显差异。因此，本实验选取的SNB的实验药物浓度为0.39μM-50μM。
实施例3CCK8法检测SNB抗RV的三种作用
为了研究SNB是否具有体外抗RV感染的作用，在RV感染MA104细胞模型上从SNB抗RV病毒的吸附、直接抑制和生物合成作用三方面进行。
(1)SNB抗RV吸附作用
在生长至单层的MA104细胞的96孔培养板内加入药液，每个药液重复4孔，每孔100μL。阳性对照组中加入等体积的1mg/mL利巴韦林(Ribavirin)，正常细胞对照组、病毒对照组均只加入等体积高糖DMEM培养液。37℃、5％CO2孵育2h。随后将药液吸出，药物组、阳性对照组及病毒对照组均加入100TCID50的病毒(病毒与10μg/mL胰酶37℃作用30min)，每孔100μL。正常细胞对照组只加入等体积高糖DMEM培养液。37℃、5％CO2孵育2h。将病毒液吸出，除正常细胞对照组外，药物组、阳性对照组及病毒对照组均加入RV生长维持液，每孔100μL，37℃、5％CO2孵育连续观察。培养48h后用CCK-8试剂盒检测。每孔加入1/10体积的CCK-8溶液，培养箱中孵育，1h后于450nm波长下检测并记录吸光度。重复实验3次。
结果见图4，SNB在0.78-25μM时，对RV的作用效果较弱，与Ribrvirin组相比，没有统计学差异。在50μM时作用效果最好，与Ribrvirin相比有统计学差异，但抑制率仅为10.6％左右，表明SNB无明显的抗RV吸附的作用。
(2)SNB对RV的直接抑制作用
将药物与100TCID50的病毒液(病毒与10μg/mL胰酶作用30min)等体积混合作用2h。用PBS将细胞冲洗2次后将其加入到生长至单层MA104细胞的96孔培养板内。阳性对照组中将Ribavirin与RV进行与上述相同的操作，正常细胞对照组、病毒对照组均只加入等体积高糖DMEM培养液。37℃、5％CO2孵育2h，然后将混合液吸出，加入RV生长维持液，每孔100μL，37℃、5％CO2孵育连续观察，培养48h后用CCK-8试剂盒检测。每孔加入1/10体积的CCK-8溶液，培养箱中孵育，1h后于450nm波长下检测并记录吸光度。计算药物的病毒抑制率，重复实验3次。
结果见图5，与Ribrvirin组相比，SNB在12.5μM、25μM、50μM时对RV的抑制率分别为60％，67.5％，70％，统计学无明显差异，表明SNB与Ribavirin对RV的直接抑制活性相当，SNB对RV有直接抑制作用。
(3)SNB抗RV合成作用
将100TCID50病毒液(病毒与10μg/mL胰酶作用30mm)加入到生长至单层的MA104细胞96孔培养板内，每孔100μL，加入之前用PBS将细胞冲洗2次。设细胞正常对照组，加入等体积高糖DMEM培养液。37℃、5％CO2孵育2h，然后将病毒液吸出，分别加入不同浓度药液和1mg/mL Ribavirin，每孔100μL；设病毒对照组，只加入RV生长维持液，每孔100μL。37℃、5％CO2孵育连续观察。连续培养48h后，用CCK-8试剂盒检测。每孔加入1/10体积的CCK-8溶液，培养箱中孵育，1h后于450nm波长下检测并记录吸光度。计算药物的病毒抑制率，重复实验3次。
结果见图6，与Ribavirin组相比，SNB在25μM、50μM时对RV抑制率分别为60％、79％，统计学无明显差异，表明SNB对RV有抗生物合成作用。
实施例4qPCR检测RV结构蛋白VP6基因的表达量
(1)总RNA的提取及定量
①为了进一步验证SNB是否对RV有直接抑制作用及抗合成作用，SNB对RV直接抑制作用48h后、对RV抗合成作用48h后，选择各药物组(12.5μM、25μM、50μM)、Ribavirin组(阳性对照组)、N组(正常细胞对照组)和RV组(病毒对照组)，去上清液，PBS清洗两次，添加1mLTrizol试剂，静置5min，收集于1.5mL的无酶EP管中。向管中加入200μL的氯仿，涡旋震荡15s，后室温静置3min，离心(4℃，12000r/min，15min)，离心后的样品分三层，即无色的上层、白色中间层和红色的下层。
②小心吸取上清液至新的1.5mL无酶的EP管中(体积约500μL)，加入等体积的预冷的异丙醇，上下剧烈震荡混匀，4℃静置10min，离心(4℃，12000r/min，10min)；
③离心后EP管底部可见白色沉淀，去上清保留沉淀，加入配制好的75％乙醇溶液(用无水乙醇和无酶水按照3：1比例配制)1mL，摇晃混匀，离心(4℃，12000r/min，5min)，弃去上清液，室温放置15min-20min，晾干。
④晾干后向EP管中加入20μL DEPC水，轻轻吹打管壁溶解RNA。NanoDrop微量紫外分光光度计测定样品的RNA浓度后可直接用于实验或-80℃保存样品备用。
(2)mRNA的逆转录反应
①去除基因组DNA反应
在冰上按照下列成分配制反应混合液，反应体积为20μL，操作按照Evo M-MLV RTKit with gDNA Clean for qPCR II说明书进行。该实验下所用耗材皆为Axygen无酶耗材。
去基因组DNA反应体系见表1。
表1去基因组DNA反应体系
反应条件：42℃2min；4℃。
*1：RNA量可根据需要添加。在20μL反转录体系中，最多使用1μg total RNA；使用探针法时，最多使用2μg total RNA。
②反转录反应
按照表2进行反应液的配制，进行反转录反应。
表2反转录反应体系
反应条件：37℃15min；85℃5sec；4℃。
(3)Real Time PCR反应
实时定量PCR采用SYBR Green I荧光标记，检测药物组、Ribavirin组、N组和RV组的VP6表达水平，采用Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit II试剂盒，内参选用GAPDH。实验用Axygen专用的Real-time PCR板，按照表3配制实时荧光定量PCR扩增反应体系，反应液配制在冰上进行操作(反应总体系为10μL)。qPCR反应条件见表4；引物序列见表5。
表3 PCR反应体系
表4 qPCR反应条件
表5引物序列
SNB对RV直接抑制作用后MA104细胞的VP6表达结果：
如图7所示，正常组不表达VP6，与RV组相比，Ribavirin组VP6基因表达降低，有统计学差异(p<0.0001)，表明Ribavirin具有抗RV的作用。与RV组相比，SNB组在12.5、25、50μM浓度下VP6表达量均有降低，有统计学差异，且存在剂量效应相关性，其中SNB在50μM时VP6的表达降低最为显著(p<0.0001)，表明SNB可通过直接抑制作用发挥抗RV的作用。
SNB抗RV生物合成作用后MA104细胞的VP6表达结果：
如图8所示，正常组不表达VP6，与RV组相比，Ribavirin组VP6基因表达降低，有统计学差异(p<0.0001)，表明Ribavirin具有抗RV的作用。与RV组相比，SNB组在12.5、25、50μM浓度下VP6表达量均有降低，有统计学差异，且存在剂量效应相关性，其中SNB在50μM时抑制VP6的表达最为显著(p<0.0001)，表明SNB可通过抗RV生物合成抑制VP6的基因表达发挥抗RV的作用。
结论：SNB对RV有一定的直接抑制作用及抗生物合成作用，没有明显抗RV吸附的作用。SNB可通过抑制结构蛋白VP6基因的表达发挥抗RV的作用。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (3)

1.白芥子苷在制备抗轮状病毒药物中的应用。
2.白芥子苷在制备抗轮状病毒生物合成药物中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述轮状病毒为RV-WA株。
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