CN117298096B - 异土木香内酯在抗大口黑鲈虹彩病毒活性中的应用 - Google Patents
异土木香内酯在抗大口黑鲈虹彩病毒活性中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117298096B CN117298096B CN202311606595.0A CN202311606595A CN117298096B CN 117298096 B CN117298096 B CN 117298096B CN 202311606595 A CN202311606595 A CN 202311606595A CN 117298096 B CN117298096 B CN 117298096B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- isoalantolactone
- iridovirus
- largehead
- jewfish
- lmbv
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- CVUANYCQTOGILD-QVHKTLOISA-N isoalantolactone Chemical compound C1CCC(=C)[C@@H]2C[C@@H]3C(=C)C(=O)O[C@@H]3C[C@]21C CVUANYCQTOGILD-QVHKTLOISA-N 0.000 title claims abstract description 83
- CVUANYCQTOGILD-UHFFFAOYSA-N isoalantolactone Natural products C1CCC(=C)C2CC3C(=C)C(=O)OC3CC21C CVUANYCQTOGILD-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 82
- 241000701372 Iridovirus Species 0.000 title claims abstract description 26
- 241000321429 Epinephelus itajara Species 0.000 title claims abstract description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 title abstract description 14
- 241001125889 Micropterus salmoides Species 0.000 claims abstract description 29
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 21
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 14
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 7
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 claims 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 16
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 16
- 230000034994 death Effects 0.000 abstract description 7
- 231100000517 death Toxicity 0.000 abstract description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 5
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 abstract description 4
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 abstract description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 3
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 241000269800 Percidae Species 0.000 abstract 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000000431 effect on proliferation Effects 0.000 abstract 1
- 241000748649 Largemouth bass virus Species 0.000 description 44
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 12
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 101710121996 Hexon protein p72 Proteins 0.000 description 10
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 10
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 8
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000009194 climbing Effects 0.000 description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 6
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 5
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000269799 Perca fluviatilis Species 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 2
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 2
- 241000269794 Lateolabrax Species 0.000 description 2
- 241000269795 Lateolabrax japonicus Species 0.000 description 2
- 241000291280 Micropterus floridanus Species 0.000 description 2
- 244000179970 Monarda didyma Species 0.000 description 2
- 235000010672 Monarda didyma Nutrition 0.000 description 2
- 244000000001 Virome Species 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 2
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 2
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000000277 virosome Substances 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGAJNILINWUWOP-UHFFFAOYSA-N Eudesmane Natural products COC(=O)C(=C)C1C(O)C2C(=O)CCC(O)C2(C)CC1OC(=O)C(=C)CO VGAJNILINWUWOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000258149 Hemicentrotus Species 0.000 description 1
- 241000442274 Heteropappus Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- HATRDXDCPOXQJX-UHFFFAOYSA-N Thapsigargin Natural products CCCCCCCC(=O)OC1C(OC(O)C(=C/C)C)C(=C2C3OC(=O)C(C)(O)C3(O)C(CC(C)(OC(=O)C)C12)OC(=O)CCC)C HATRDXDCPOXQJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003444 anaesthetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000004500 asepsis Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 208000010932 epithelial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- DYEQPYSFRWUNNV-APIJFGDWSA-N eudesmane Chemical compound C1CC[C@@H](C)[C@@H]2C[C@H](C(C)C)CC[C@]21C DYEQPYSFRWUNNV-APIJFGDWSA-N 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229930009674 sesquiterpene lactone Natural products 0.000 description 1
- -1 sesquiterpene lactone compound Chemical class 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000005727 virus proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
- A61K31/365—Lactones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
- Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Virology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于水产养殖技术领域，涉及水产动物病害的防治，具体涉及异土木香内酯在抗大口黑鲈虹彩病毒活性中的应用。本发明经过实验证实了异土木香内酯对大口黑鲈虹彩病毒的增殖具有明显的抑制作用，抑制效果呈浓度依赖性。另外，动物实验结果显示异土木香内酯可以有效降低大口黑鲈虹彩病毒感染鲈鱼的死亡率和病毒滴度。本发明对于大口黑鲈虹彩病毒的防治提供了一种候选药物，为水产养殖业的健康发展提供技术支持和研究成果。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖技术领域，涉及水产动物病害的防治，具体涉及异土木香内酯在抗大口黑鲈虹彩病毒活性中的应用。
背景技术
异土木香内酯（Isoalantolactone）是一种存在于菊科植物土木香（IhulaheleniumL.）的根的化合物，是一种桉叶烷型倍半萜内酯类物质，化学式为C15H20O2，分子量为232.32，具有驱虫、抗菌、抗炎和抗肿瘤等多种生物活性。
虹彩病毒是大口黑鲈鱼苗培育和商品鱼生产中危害最为严重的病原之一。一旦暴发，致使大口黑鲈死亡率达60%以上。免疫防控、药物防控和生态防控是水产养殖病害防控的三大手段，而目前，疫苗研究尤其是大口黑鲈虹彩病毒疫苗研究和应用还十分有限。因此，药物防控成为该病害防控最直接、最有效的手段。基于此，提供能够有效抑制大口黑鲈虹彩病毒的活性分子及候选药物是本领域技术人员亟须解决的技术问题。
发明内容
大口黑鲈感染虹彩病毒目前尚无有效的治疗药物，为解决这一技术问题，本发明提供异土木香内酯在抗大口黑鲈虹彩病毒活性中的应用。所述异土木香内酯具有以下结构：
。
进一步，异土木香内酯对大口黑鲈虹彩病毒的MCP和L1F_F9L基因的表达具有显著抑制效果。同时，异土木香内酯还能够降低大口黑鲈虹彩病毒的滴度。另外，对于感染大口黑鲈虹彩病毒的EPC细胞（黑头软口鲦上皮瘤细胞系）具有保护效果。
进一步，通过异土木香内酯对在体的大口黑鲈虹彩病毒抗性研究，发现异土木香内酯可以有效减少感染大口黑鲈的死亡率；饲喂含异土木香内酯的饲料可以抑制大口黑鲈体内LMBV的增殖。
进一步，异土木香内酯制备成药学上可以接受的盐使用。
另外，本发明还提供一种鱼类虹彩病毒的抗性药物，异土木香内酯作为所述抗性药物的活性成分。
与现有技术相比，本发明“异土木香内酯在抗大口黑鲈虹彩病毒活性中的应用”具有以下有益效果：
本发明采用EPC细胞确定了LMBV的半数组织培养感染剂量，之后利用MTT比色法检测了异土木香内酯对EPC细胞的毒性作用。实验结果证实，异土木香内酯对MCP蛋白和L1F_F9L蛋白的抑制曲线基本相似，异土木香内酯的最大安全浓度（10mg/L）可以有效降低MCP蛋白和L1F_F9L蛋白的相对表达量，对LMBV增殖的抑制率均超过95%；其中，异土木香内酯对MCP蛋白的抑制效果最佳，抑制率可达到99.66±0.18%；LMBV的滴度在异土木香内酯处理后显著降低；经过异土木香内酯处理后，感染LMBV的EPC细胞在96h内均未观察到CPE，并且仍维持较好的细胞形态；动物试验表明饲喂异土木香内酯可以抑制大口黑鲈体内LMBV的增殖。本发明提供的化合物，对于大口黑鲈虹彩病毒的预防和治疗提供了多种候选药物，对于鱼类养殖产业具有重要的贡献价值。
附图说明
图1为异土木香内酯对MCP蛋白的抑制率曲线。
图2为异土木香内酯对L1F_F9L蛋白的抑制率曲线。
图3为异土木香内酯对LMBV的病毒滴度的影响。**表示P＜0.01。
图4为异土木香内酯作用下感染LMBV的EPC细胞形态学显微图。
图5为异土木香内酯作用下感染LMBV的EPC细胞核与细胞膜染色结果图。
图6为对照组、病毒组、处理组和药物对照组大口黑鲈的存活率变化图。
图7为饲喂12mg/kg异土木香内酯对大口黑鲈体内病毒滴度的影响图。
图8为饲喂12mg/kg异土木香内酯对大口黑鲈肝脏中LMBV的MCP基因相对表达量的影响。
图9为饲喂12mg/kg异土木香内酯对大口黑鲈脾脏中LMBV的MCP基因相对表达量的影响。
图10为饲喂12mg/kg异土木香内酯对大口黑鲈肾脏中LMBV的MCP基因相对表达量的影响。
其中，Max response表示最大抑制率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行说明，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述各实施例中所述实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试验用品和原料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。
实施例1
本实施例提供了异土木香内酯体外抗大口黑鲈虹彩病毒活性测定。
病毒材料：大口黑鲈虹彩病毒（Largemouth bass virus，LMBV）毒株（GenBank：OM417602）从广东佛山鲈鱼养殖场的病鱼中分离、鉴定和纯化。
实验用细胞系：黑头软口鲦上皮瘤细胞系（Epithelioma papulosum cyprinicell，EPC）来源于中国水产科学研究院长江水产研究所。
待测药液的配制方法：准确称取20mg异土木香内酯，置于1.5mL离心管中，加1mL二甲基亚砜（DMSO）溶解，即得浓度为20mg/mL的待测药液，4℃冰箱保存备用。
细胞培养、病毒增殖及滴度检测：
配置含有100IU/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素、10%胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）的M199细胞培养液。从液氮罐或-80℃冰箱中取出冻存的EPC细胞，放入37℃水浴锅中进行融化，轻微晃动冻存管加速融化，75%酒精擦拭冻存管。将细胞加入至10mL的M199培养基内，1000rpm离心6min，弃上清。之后加入含10% FBS的M199培养液5mL，吹打混匀，移入25cm2规格的细胞培养瓶进行细胞复苏（25±0.5℃，5%浓度CO2），观察细胞的生长状态，每2~3天传代一次。
LMBV病毒悬液保存于液氮罐，使用前于4℃下缓慢融解。融解后用无血清的M199培养基配置浓度为103×TCID50浓度的LMBV病毒液，加入到25℃条件下培养24h的EPC细胞中，感染2h，在此期间摇晃细胞培养瓶5次。病毒孵育结束后，用5% FBS的M199培养基替换病毒液，继续培养48~96h，观察EPC细胞的细胞病变效应（cytopathic effect，CPE），待细胞80%发生细胞病变时，收集细胞培养瓶中的病毒，分装于1.5mL离心管内，保存于液氮中。
EPC细胞胰酶消化后，1000rpm离心5min，弃上清，加入2mL含10% FBS的M199培养基，台盼蓝染色计数后，将细胞稀释至1×104/0.1mL接种于96孔细胞培养板中，25℃培养过夜。待细胞生长至80%以上时，向96孔细胞培养板中接种不同稀释浓度（1×101、1×102……1×1010）的LMBV病毒液100μL/孔，每个浓度8个重复，每间隔24h观察记录每个浓度的病变孔数。实验重复3次。LMBV的半数组织培养感染剂量（Tissue culture infective dose，TCID50）依据Karber法进行计算。
（2）异土木香内酯抗病毒活性检测
进行抗病毒活性测定前，利用MTT比色法检测异土木香内酯对EPC细胞的毒性作用。以1×104/孔的接种量将EPC细胞接种于96孔细胞培养板中，25℃培养24h。用细胞培养基将20mg/mL（即20g/L）的异土木香内酯稀释至160mg/L、80mg/L、40mg/L、20mg/L、10mg/L、5mg/L和1mg/L。弃去96孔细胞培养板中培养基，用0.1M的PBS缓冲液清洗3次，加入不同浓度的异土木香内酯，25℃培养48h。再用0.1M的PBS缓冲液洗涤细胞3次，每孔中加入PBS缓冲液90μL，再向每孔加入10μL MTT溶液（5mg/mL）。培养4h后，弃去上清，加入150μL的二甲基亚砜，37℃摇床震荡10min，使结晶充分溶解。利用全波段酶标仪在490nm处检测各样品孔的吸光值。根据以下公式得出细胞存活率：
细胞存活率=（异土木香内酯组平均D490nm值-空白组D490nm值）/（细胞组D490nm值-空白组D490nm值）×100%。
根据试验结果，判定异土木香内酯对EPC细胞的毒性作用，然后设定一系列药物浓度梯度（0.625mg/L、1.25mg/L、3mg/L、5mg/L、8mg/L和10mg/L），测定异土木香内酯抗LMBV的有效活性浓度。具体操作步骤如下。
将密度为1×105/孔的EPC细胞接种于12孔细胞培养板内，待细胞生长至80~90%。吸出培养基，M199培养基漂洗2~3次，加入103×TCID50的LMBV稀释液（由M199培养基稀释），于培养箱内25℃孵育2h。
用细胞维持液将母液浓度为20mg/mL的异土木香内酯稀释至检测浓度。病毒孵育2h后，吸弃上清，0.1M的PBS缓冲液漂洗细胞2~3次，加入新鲜配制的异土木香内酯稀释液或细胞维持液（0.5‰的DMSO作为对照组），25℃培养48h；空白组即不含DMSO和异土木香内酯的细胞维持液。
孵育48h后，吸弃培养液，用0.1M的PBS缓冲液洗涤EPC细胞2~3次，用含EDTA、浓度为0.25%的胰蛋白酶消化细胞，1000rpm离心5min，弃去上清后向收集的细胞内加入Trizol试剂提取各样品总RNA。
总RNA提取具体方法如下：
A.将含EPC细胞的Trizol液转移至1.5mL无菌无酶的EP管中，用无菌枪头反复吹打直至管底无沉淀；
B.每1mL Trizol加入200μL三氯甲烷，涡旋剧烈振荡15s使溶液充分乳化，室温静置3min，12000×g、4℃离心15min；
C.小心吸取上层水相400μL转移至新的无菌无酶EP管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管使液体充分混匀，室温静置10min，12000×g、4℃离心10min；
D.吸弃上清液，沿管壁缓慢加入1mL 75%的乙醇，上下颠倒离心管以洗涤RNA沉淀，7500×g、4℃离心5min后再次吸弃上清；
E.室温干燥RNA沉淀5min后，加入20μL无RNA酶的ddH2O溶解RNA，利用核酸浓度测定仪检测RNA纯度及浓度后，RNA样品置于-80℃保存备用。
使用Vazyme HiScript Q Select RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）反转录试剂盒对各样品总RNA进行反转录PCR，具体方法如表1。
表1.反转录PCR反应体系
将表中样品吹打混匀后，42℃反应2min；在第1步的反应体系中直接加入5×Select qRT SuperMix Ⅱ 2μL，轻轻吹打混匀；50℃反应15min，85℃反应2min。
以EPCβ-actin为内参基因、反转录产物为模板，利用实时定量PCR检测异土木香内酯的抗病毒活性，比较LMBV在不同浓度异土木香内酯处理后的复制情况。内参基因（EPCβ- actin）、LMBV主要衣壳蛋白基因（MCP）、膜蛋白（L1F_F9L）基因引物序列如表2所示。
表2.引物序列
以cDNA模板，使用Vazyme AceQ® qPCR SYBR® Green Master Mix试剂盒进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）扩增，反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火30s，循环40次；熔解曲线分析，65℃至95℃，每步5s。仪器为Bio-Rad CFX96 Real-Time PCRDetection System。反应体系如表3所示，利用2-△△Ct法分析数据。
表3.实时定量PCR反应体系
为进一步确认异土木香内酯的抗LMBV活性，通过4'，6-二脒基-2-苯基吲哚荧光染料（DAPI）和细胞膜绿色荧光探针（DiO）荧光染色分析异土木香内酯对感染细胞细胞核和细胞膜的保护效果，具体操作如下：
A.细胞培养和病毒感染
将密度为1×105/孔的EPC细胞接种于含细胞爬片的6孔细胞培养板中，待细胞在爬片上生长至单层。吸弃上清液，0.1M的PBS缓冲液漂洗3次，加入103×TCID50LMBV稀释液，25℃孵育2h。
B.异土木香内酯处理
用M199细胞维持液将母液浓度为20mg/mL的异土木香内酯稀释至10mg/L，待LMBV孵育2h后，回收病毒液，0.1M的PBS缓冲液漂洗3次，加入新鲜配制的异土木香内酯稀释液或细胞维持液（0.5‰的DMSO作为对照组），25℃继续培养48h。
C.细胞样品固定
孵育结束后，吸弃上清液，用0.1M的PBS缓冲液漂洗爬片3次，加入4%多聚甲醛200μL孵育20min以固定细胞。
D.荧光染色
细胞固定后，0.1M的PBS缓冲液漂洗爬片3次，加入200μL的DiO细胞膜染色工作液（5μM），室温避光孵育20min，吸弃上清液，0.1M的PBS缓冲液爬片洗涤3次（2min/次）。随后加入DAPI染色液，室温避光孵育30min。染色结束后，吸弃DAPI染色液，0.1M的PBS缓冲液漂洗爬片3次。
E.封片
滴加20μL抗荧光淬灭剂于干净载玻片上，用镊子取出细胞爬片，将爬片细胞面朝下盖在载玻片上，轻压爬片避免气泡出血并挤出多余荧光淬灭剂，将爬片边缘使用吸水纸擦拭干净。室温避光干燥20min，封片。使用正置荧光显微镜观察。
F.正置荧光显微镜（Leica-DM5000）观察
DiO的最大激发波长为484nm，最大发射波长为501nm，显绿色。DAPI的最大激发波长为340nm，最大发射波长为488nm；DAPI与双链DNA结合后，最大激发波长为364nm，最大发射波长为454nm，显蓝色。
实验结果：
MTT法检测结果显示异土木香内酯的浓度为10mg/L时，对EPC细胞的增殖无影响，后续实验以此浓度为最大安全浓度。根据异土木香内酯的浓度与LMBV抑制率之间的正相关关系，得到其半数抑制浓度（Half maximal inhibitory concentration，IC50）及其95%置信区间为1.93（1.73~2.14）mg/L。
异土木香内酯对LMBV病毒的MCP和L1F_F9L蛋白基因表达水平的抑制效果如图1、图2所示，结果显示异土木香内酯对MCP蛋白和L1F_F9L蛋白的抑制曲线基本相似，异土木香内酯的最大安全浓度（10mg/L）可以有效降低MCP蛋白和L1F_F9L蛋白的相对表达量，对LMBV增殖的抑制率均超过95%。其中，异土木香内酯对MCP蛋白的抑制效果最佳，抑制率可达到99.66±0.18%。同时，如图3所示，LMBV的滴度也在异土木香内酯处理后显著降低，LMBV的滴度在24h、48h、72h和96h的TCID50分别为103.65±0.24、105.83±0.18、106.68±0.16和107.33±0.12/0.1mL。而经过异土木香内酯处理后，LMBV滴度在24h、48h、72h和96h的TCID50分别降低至101.39±0.12、103.63±0.06、105.12±0.24和105.88±0.16/0.1mL。
异土木香内酯对感染LMBV的EPC细胞的保护效果如图4所示。倒置显微镜观察结果显示，正常的EPC细胞呈单层密集排列的状态。103×TCID50LMBV感染48h后，EPC细胞出现了明显的细胞病变（Cytopathic effect，CPE）现象，具体为正常细胞数量显著减少、大量如渔网状的空斑、细胞收缩变圆且边缘折光度增加；在96h细胞大量死亡、漂浮，出现大量的细胞碎片。经过异土木香内酯处理后，感染LMBV的EPC细胞在96h内均未观察到CPE，并且仍维持较好的细胞形态。
DAPI和DiO染色结果如图5所示，通过荧光显微镜可观察到，LMBV感染EPC细胞48h后细胞核出现细胞核界线模糊并伴随明显的溶解趋势，染色质出现皱缩，细胞核逐步边缘化甚至破裂，细胞内出现凋亡小体等典型的细胞凋亡特征。相比之下，异土木香内酯处理后的感染细胞与对照组观察结果相似，细胞核被正常染色，形态大小一致，染色质也未出现皱缩现象，表明异土木香内酯对LMBV的感染具有良好的抗病毒效果。
实施例2
本实施例提供了异土木香内酯对在体的大口黑鲈虹彩病毒抗性测定。
病毒材料：大口黑鲈虹彩病毒（Largemouth bass virus，LMBV）毒株（GenBank：OM417602）从广东佛山鲈鱼养殖场的病鱼中分离、鉴定和纯化。
实验动物：大口黑鲈，从重庆渝西水产市场购买，体重范围1.59±0.09g，体长范围4.74±0.16cm，购买数量为500尾。
1.确定合适的LMBV感染大口黑鲈浓度
设置LMBV浓度分别为10、102、103、104和105×TCID50/0.1mL，采用腹腔注射的方式将上述不同浓度的病毒稀释液注射感染大口黑鲈，每尾鱼注射10μL。对照组注射等体积的PBS缓冲液，每组40尾鱼。在50L水的水箱中饲养，保持水温25±0.5℃，溶解氧>5mg/L，每24h观察并记录大口黑鲈存活状况，选择14天时大口黑鲈的存活率为50%的LMBV浓度作为后续病毒感染浓度。经实验获知，当病毒感染浓度为104×TCID50/0.1mL时，大口黑鲈的死亡率为52.5%。
2.异土木香内酯的在体毒性分析
将药物母液分别稀释至6mg/kg、12mg/kg、24mg/kg、50mg/kg和100mg/kg五组，与鲈鱼商业颗粒饲料（购于中国浙江东裕丰饲料有限公司）混合均匀，进行日常饲喂（每组40尾）。对照组饲喂不含药物的颗粒饲料。每24h观察并记录大口黑鲈死亡情况。根据7天后大口黑鲈的存活情况可知，异土木香内酯的添加量为12mg/kg时对大口黑鲈的存活率没有影响。
3.异土木香内酯抗病毒活性检测
A.存活率检测
设置以下各个实验组，并对各组进行如下处理：
对照组：注射10μL的PBS缓冲液，饲喂不含药物的颗粒饲料；
病毒组：注射10μL的104×TCID50/0.1mL病毒悬液10μL，饲喂不含药物的颗粒饲料；
处理组：注射10μL的104×TCID50/0.1mL病毒悬液10μL，饲喂含12mg/kg异土木香内酯的颗粒饲料；
药物对照组：注射10μL的PBS缓冲液，饲喂含12mg/kg异土木香内酯的颗粒饲料。
每24h观察并记录大口黑鲈存活情况，直至第14天。
图6为对照组、病毒组、处理组和药物对照组大口黑鲈的存活率变化图。结果显示，病毒组在第3天至第9天内出现大量死亡，累计死亡率为55%。而经异土木香内酯处理后，大口黑鲈的累计死亡率为22.5%，相较于病毒感染组降低了32.5%，表明异土木香内酯可以有效减少感染大口黑鲈的死亡率。
B.病毒滴度检测
TCID50/0.1mL LMBV的大口黑鲈日常饲喂12mg/kg的异土木香内酯作为药物处理组，每组40尾鱼。在感染后的第3、6和9天分别采集3尾大口黑鲈，使用MS-222（间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐，鱼用麻醉剂）进行麻醉，以其10倍体重的剂量加入M199培养基，在冰浴条件下进行匀浆。10000×g、4℃离心15min收集上清，使用0.22μm的滤膜对病毒液进行过滤，检测全鱼提取的LMBV悬液的滴度。
图7为异饲喂土木香内酯对患病鲈鱼体内的病毒滴度的检测。LMBV感染后大口黑鲈体内病毒滴度在第3、6和9天分别为103.57±0.33、104.86±0.31和105.82±0.12×TCID50/0.1mL。而经异土木香内酯饲喂后大口黑鲈体内病毒滴度显著降低，分别为102.83±0.16、102.31±0.06和101.88±0.24×TCID50/0.1mL。此外，随着病毒感染时间增加，异土木香内酯饲喂后病毒滴度降低，说明异土木香内酯可以有效降低病鱼体内的病毒滴度。
C.定量PCR（RT-qPCR）检测
大口黑鲈腹腔注射10μL的LMBV稀释液（104×TCID50）为病毒组，注射104×TCID50/0.1mL LMBV的大口黑鲈日常饲喂含12mg/kg的异土木香内酯作为药物处理组，每组40尾鱼。在病毒感染后的第1、4和7天分别采集3尾大口黑鲈，取其肝脏、脾脏和肾脏组织提取总RNA，反转录为cDNA。利用RT-qPCR检测肝脏、脾脏和肾脏组织中LMBV的MCP基因相对表达量，MCP定量引物和大口黑鲈内参基因序列见表4。
表4.引物序列
图8、图9、图10分别为在肝脏、脾脏和肾脏中病毒组和处理组MCP基因相对表达量。结果显示在肝脏、脾脏和肾脏中，处理组在第1、4和7天均比病毒组MCP基因的相对表达量更低。病毒组大口黑鲈体内病毒相对表达量是异土木香内酯饲喂组的2.21~22.80倍，表明饲喂异土木香内酯可以抑制大口黑鲈体内LMBV的增殖。
以上所述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。在依据本发明构思的条件下本领域普通技术人员进行的相关推演和替换，在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (3)
1.异土木香内酯作为唯一活性成分在制备大口黑鲈虹彩病毒防治药物中的应用，其特征在于，所述异土木香内酯抑制大口黑鲈虹彩病毒的增殖。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述异土木香内酯抑制大口黑鲈虹彩病毒衣壳蛋白的复制。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述异土木香内酯降低大口黑鲈虹彩病毒感染鲈鱼的死亡率和病毒滴度。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311606595.0A CN117298096B (zh) | 2023-11-29 | 2023-11-29 | 异土木香内酯在抗大口黑鲈虹彩病毒活性中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311606595.0A CN117298096B (zh) | 2023-11-29 | 2023-11-29 | 异土木香内酯在抗大口黑鲈虹彩病毒活性中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117298096A CN117298096A (zh) | 2023-12-29 |
| CN117298096B true CN117298096B (zh) | 2024-03-29 |
Family
ID=89255621
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311606595.0A Active CN117298096B (zh) | 2023-11-29 | 2023-11-29 | 异土木香内酯在抗大口黑鲈虹彩病毒活性中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117298096B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20040107185A (ko) * | 2003-06-13 | 2004-12-20 | 이상국 | 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 포함하는 암 또는염증질환 예방 및 치료용 조성물 |
| CA2603676A1 (en) * | 2005-01-07 | 2006-07-13 | Roskamp Research Llc | Compounds for inhibiting beta-amyloid production and methods of identifying the compounds |
| CN104739825A (zh) * | 2015-02-25 | 2015-07-01 | 上海交通大学医学院附属第三人民医院 | 异土木香内酯在制备抗慢性粒细胞性白血病药物中的应用 |
| CN112522274A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-03-19 | 华南农业大学 | 一种识别大口黑鲈虹彩病毒的ssDNA核酸适配体及其应用 |
-
2023
- 2023-11-29 CN CN202311606595.0A patent/CN117298096B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20040107185A (ko) * | 2003-06-13 | 2004-12-20 | 이상국 | 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 포함하는 암 또는염증질환 예방 및 치료용 조성물 |
| CA2603676A1 (en) * | 2005-01-07 | 2006-07-13 | Roskamp Research Llc | Compounds for inhibiting beta-amyloid production and methods of identifying the compounds |
| CN104739825A (zh) * | 2015-02-25 | 2015-07-01 | 上海交通大学医学院附属第三人民医院 | 异土木香内酯在制备抗慢性粒细胞性白血病药物中的应用 |
| CN112522274A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-03-19 | 华南农业大学 | 一种识别大口黑鲈虹彩病毒的ssDNA核酸适配体及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Characterization of a ranavirus isolated from cultured largemouth bass (Micropterus salmoides) in China;Deng G, Li S, Xie J, et al;Aquaculture;全文 * |
| Targeting apoptosis pathways in cancer with alantolactone and isoalantolactone;Rasul A, Khan M, Ali M, et al.;The Scientific World Journal;全文 * |
| 天名精萜类化学成分及其细胞毒活性研究;汪蕾;田丽;程凡;邹坤;Peter Proksch;;中草药(03);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117298096A (zh) | 2023-12-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ariel et al. | Propagation and isolation of ranaviruses in cell culture | |
| CN103667176A (zh) | 鲤疱疹病毒ⅱ型敏感的异育银鲫脑组织细胞系及其建立方法和应用 | |
| CN107385033B (zh) | piRNA-5938及其反义核酸在诊断、治疗缺血性心脏疾病中的应用 | |
| Kelly et al. | Characterization of Herpes virus vitreum isolated from hyperplastic epidermal tissue of walleye, Stizostedion vitreum vitreum (Mitchill) | |
| CN115089600B (zh) | 麦冬皂苷d在制备抗轮状病毒药物中的应用 | |
| CN111073863B (zh) | 猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联弱毒疫苗及其制备方法 | |
| CN110468069B (zh) | 一种干酪乳杆菌yfi-5及其在抗鲤疱疹病毒ii型中的应用 | |
| CN117298096B (zh) | 异土木香内酯在抗大口黑鲈虹彩病毒活性中的应用 | |
| CN113717939A (zh) | 真鲷脑细胞系及其构建方法与应用 | |
| CN114129549B (zh) | 酚类化合物在鱼类病害防控中的应用 | |
| CN103555653B (zh) | 一种红鳍东方魨卵巢细胞系体外构建方法及其应用 | |
| CN115919843A (zh) | Z-藁本内酯在抗轮状病毒中的应用 | |
| CN104894223B (zh) | 人copb2基因的用途及其相关药物 | |
| CN110423714A (zh) | 一种乳酸菌复合菌剂及其在抗鲤疱疹病毒ii型中的应用 | |
| CN113599412A (zh) | 党参黄芪组合物在制备预防和治疗晚期肿瘤相关症状的药物中的用途 | |
| CN116115610B (zh) | 一种小分子抑制剂bci121在鱼类抗病毒中的应用 | |
| CN111411087A (zh) | 一种鲤疱疹病毒ii型弱毒株及其应用 | |
| CN106474154A (zh) | 一种肺干细胞培养基、注射液及其制备方法 | |
| CN117205213B (zh) | 白鲜碱在制备鱼类病毒性神经坏死病药物中的用途 | |
| CN116570583B (zh) | 丹酚酸b在制备抗轮状病毒制剂中的应用 | |
| CN113750083B (zh) | 二甲双胍在制备治疗手足口病的药物中的应用 | |
| CN115350181B (zh) | 一种小分子化合物在制备抗病毒感染的药物中的应用 | |
| CN114452280B (zh) | 苍术酮在制备胶质瘤治疗药物中的应用 | |
| CN116919972A (zh) | 去氧胆酸在制备抗水生病毒感染的药物或添加剂中的应用 | |
| CN110327453A (zh) | 一种抗wssv的春雷霉素残渣蛋白联合中草药制剂及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20240222 Address after: 518000 Virtual University Park B406, R4 building, No. 19, Gaoxin South 4th Road, Yuehai street, Nanshan District, Shenzhen, Guangdong Applicant after: Shenzhen Research Institute of Northwest University of agriculture and forestry science and technology Country or region after: China Applicant after: GUANGXI ACADEMY OF SCIENCES Address before: 518000 Virtual University Park B406, R4 building, No. 19, Gaoxin South 4th Road, Yuehai street, Nanshan District, Shenzhen, Guangdong Applicant before: Shenzhen Research Institute of Northwest University of agriculture and forestry science and technology Country or region before: China |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |