CN110327453A - 一种抗wssv的春雷霉素残渣蛋白联合中草药制剂及其应用 - Google Patents

一种抗wssv的春雷霉素残渣蛋白联合中草药制剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗WSSV的春雷霉素残渣蛋白联合中草药制剂及其应用，从春雷霉素残渣中分离蛋白样多肽类物质，然后与金银花、连翘、板蓝根、黄芪、菟丝子和大青叶互配，制备出抗对虾白斑综合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV,WSSV）互配制剂，用于对虾WSSV的防治。春雷霉素残渣蛋白联合中草药饲喂对虾的细胞免疫因子分别为THC为（3.83±0.129）×107 cells·mL‑1、PO为（333±10.6）U·100mL‑1，SOD为（383±10.9）U·100mL‑1和ALP为（45.83±4.11）U·100mL‑1，饲喂春雷霉素残渣蛋白联合中草药饲喂对虾组的THC含量具有显著性差异(P＜0.05)、PO、SOD和ALP各自的值显著高于对照组(P＜0.05)，感染WSSV对虾16d后，饲喂雷霉素残渣蛋白联合中草药饲喂组的对虾死亡率为最低。

Description

一种抗WSSV的春雷霉素残渣蛋白联合中草药制剂及其应用
技术领域
本发明属于生物发酵和水产养殖技术领域，具体涉及一种抗WSSV的春雷霉素残渣蛋白联合中草药制剂及其应用。
背景技术
对虾属节肢动物门(Arthropoda)，甲壳纲(Crustacea)，十足目((Decapoda)，游泳亚目(Natantia)，对虾科(Penaeidae)（张伟权，1990），对虾科是全世界水产养殖的主要种类，该种类包括6个属，29个种。其中，凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）、斑节对虾（Penaeus monodon）和中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）是我国养殖的三大主要对虾品种。当今，我国是世界上对虾产量最高、养殖面积最大的国家，其次为泰国、印度尼西亚、越南、印度、巴西、菲律宾、厄瓜多尔、墨西哥等国家。我国沿海鱼虾水产养殖模式采用集约高效的养殖模式，如对虾养殖模式高位池或地膜养殖模式。随着我国对虾养殖业的大力发展，环境污染严重、水质恶化、暴发性病害也频繁发生。鱼虾暴发性病害主要包括虾的白班综合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）。
自WSSV被发现以来，国内外研究人员对各自的基因组、各自的宿主、各自的传播途径、各自的药物筛选、抗WSSV的品种选育和抗WSSV的相关基因的克隆与表达进行比较系统的研究。从现有的报道结果可以看出，这些研究对预防和控制对虾的WSSV还有待继续深入。主要因为由以下几个方面决定的：一是对虾细胞体外培养还没有突破，这势必限制了对虾抗WSSV的细胞疫苗或转基因工程疫苗的进一步研究和开发；二是我国大多数养殖场只注重对鱼虾养殖进水系统处理，而对鱼虾养殖废水未进行任何处理直接排放到临海水域；三是我国传统的对鱼虾养殖进水处理也普遍采用砂滤模式，砂滤尽管对水体中浮游动植物起到一定的过滤作用，但从实际的效果来看，对WSSV及其它病原微生物的过滤效果并不理想；四是在对鱼虾养殖过程中大量使用化学消毒剂和抗生素，这些残留的消毒剂和抗生素未经任何处理随养殖废水排放邻海区域给邻海水域环境带来很大的负面影响；五是尽管我国对预防WSSV药物筛选对WSSV的预防与控制，但其中的中草药预防WSSV的药效有限。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种抗WSSV的春雷霉素残渣蛋白联合中草药制剂及其应用，克服了传统的中草药预防WSSV的药效不显著的缺点，另一方面也为春雷霉素残渣资源化利用提供新的思路与途径。
本发明采用如下技术方案：
一种抗WSSV的春雷霉素残渣蛋白联合中草药制剂，由春雷霉素残渣蛋白、金银花、连翘、板蓝根、黄芪、菟丝子和大青叶组成。
进一步地，以质量比计，金银花为5～15份，连翘为10～20份，板蓝根为20～35份，黄芪为15～25份，大青叶为25～35份，菟丝子为5～15份。
进一步地，以质量比计，金银花10份，连翘15份，板蓝根25份，黄芪20份，大青叶15份，菟丝子10份，粗蛋白5份。
进一步地，所述的春雷霉素残渣蛋白与中药的质量配比为40：1～10:1。
进一步地，所述的春雷霉素残渣蛋白经过蛋白多肽分离与纯化的步骤，具体如下：
①小金色链霉菌在发酵罐进行发酵，其接种量为10-15%，发酵温度为28-30℃，发酵罐搅拌器的转速为100-150r/min，葡萄糖添加量为20-40L/h，在线氨水补量使得pH为6.2-6.5，然后在500～700L/min灭菌空气的条件下进行160-200h发酵，然后停止发酵，发酵液经草酸酸化使其pH为3.5-4.0，再经陶瓷膜过滤，滤过液为制备春雷霉素原药的预备滤液，其中截留物为春雷霉素残渣；
②滤渣经10000-15000rpm离心10-15min去除不溶物，在上清液中缓慢加入(NH4)2SO4至30-80%饱和度，于4-6℃条件下缓慢搅拌，静置6-10小时后，经3000-5000rpm离心10-15min去除不溶物，向上清液中补加(NH4)2SO4至80%饱和度，在4-6℃条件下缓慢搅拌，静置数小时后，经3000-5000rpm离心10-15min，收集蛋白沉淀；
③用透析袋，将收集的蛋白沉淀物进行脱盐，以5%的柱床体积上样量进行Sephadex-75过柱纯化，流速0.2-0.6mL/min，用30-40mmol/LTris-HCl进行洗脱，收集洗脱液，收集浓缩液，浓缩液冷冻干燥获粗蛋白，另外取浓缩液10-20μL至200μL的Ep管中，加入5μL蛋白上样缓冲液，混匀，沸水浴煮沸10-20min使其充分变性，加样开始电泳分析，SDS - PA GE电泳条件：配胶：6-10%的浓缩胶，10-20%的分离胶，电压：浓缩恒压70-90V，分离恒压140-160V。
本发明还保护所述的制剂在抗WSSV中的应用，按比例称取金银花、连翘、板蓝根、黄芪、菟丝子和大青叶，研磨成粉末后，加入蒸馏水封闭熬制，待冷却室温后，离心过滤取上清液，然后与一定质量配比的从春雷霉素残渣分离的蛋白混合得到所述的制剂，再将制剂均匀喷晒到虾料上，低温干燥制备。
进一步地，所述的制剂与虾料的质量比为1:10，所述的低温干燥为60-80℃下干燥。
更进一步地，所述的应用包括以下的步骤：室内准备2.5m3的塑料圆桶10个，每桶装有曝气头，用0.5‰高锰酸钾对桶和曝气头及连接充气管进行消毒，用超滤膜过滤+紫外消毒的海水清洗每个桶，然后装入1.5m3的该海水，每桶放入消毒的健康对虾30尾，每日饲喂三次，每天换水一次，饲喂不同饲料组暂养7d后，实验组对虾肌肉注射WSSV母液10μL，观察日期为15d。
更进一步地，所述的健康对虾为45日龄，每尾对虾PCR检测WSSV、TSV为阴性。
更进一步地，每次饲喂对虾饲料为对虾体重的5%。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明从春雷霉素残渣中分离蛋白样多肽类物质，然后与金银花、连翘、板蓝根、黄芪、菟丝子和大青叶互配，制备出抗对虾白斑综合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV，WSSV ）互配制剂，用于对虾WSSV的防治。与传统的鱼虾养殖使用中草药预防WSSV对比，提高对虾的成活率和产量，减少对虾养殖消毒剂和抗生素防治病害的使用量，进一步提高造成对虾产品品质；单独饲喂蛋白饲料组的对虾死亡率为60%，饲喂中草药组对虾死亡率60%，而饲喂蛋白+中草药组的对虾死亡率为56%（16d）。
2、与传统的对虾养殖使用中草药预防WSSV对比，减少对虾养殖的滥用抗生素防治对对虾养殖周边水体环境的污染。
3、本发明有效的控制对虾WSSV危害，同时为春雷霉素残渣资源化利用提供了一种新思路和新方法。
4、本发明的春雷霉素残渣联合中草药抗WSSV制备操作简单方便，符合现代水产养殖生态要求。实验结果表明，春雷霉素残渣蛋白联合中草药饲喂对虾的细胞免疫因子分别为THC为（3.83±0.129）×107 cells·mL-1、PO为（333±10.6）U·100mL-1，SOD为（383±10.9）U·100mL-1和ALP为（45.83±4.11）U·100mL-1，饲喂春雷霉素残渣蛋白联合中草药饲喂对虾组的THC含量具有显著性差异(P＜0.05)、PO、SOD和ALP各自的值显著高于对照组(P＜0.05)，感染WSSV对虾16d后，饲喂雷霉素残渣蛋白联合中草药饲喂组的对虾死亡率为最低。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，而不构成对本发明的限制。
采用的技术手段如下：
1、WSSV荧光定量PCR检测
FQ-PCR检测WSSV具体步聚如下：
①首先准备WSSV荧光引物及探针序列如下 ：Taqman 探针在5´端标记FAM荧光报告基因，3´标记的TAMRA为荧光淬灭基因作为引物。其中Taqman 探针序列：WSSV1：5´-CCACCAATTCTACTCATGTACCAAA，WSSV2：5´-TCCTTGCAATGGGCAAAATC-3´，WSSV3：5´-FAMCTGGGTTACGAGTCTAA-TAMRA-3´。
②对于PCR反应体系，2×Taqam 探针主要反应混合液12 .5µL , Taqam 探针0 .3µL (0 .3 ～ 0.5µm.L -1 )、上游引物0.5µL（0.5µm .L -1）、下游引物0.5µL（0.5µm .L-1）、模版2µL、TaqE0.2µL、超纯水9µL、总量25µL。
③然后对游离 WSSV粗提液制备，从WSSV 的虾池中挑选出具有WSSV典型症状的凡纳滨对虾数尾，经PCR检测，WSSV呈阳性。对于病虾，将其头部，胸部和肝胰腺去掉后，在冰浴条件下剪碎。按每克组织加入100m L PBS缓冲液，缓冲液pH约为7.6，在冰浴中电动匀浆1h将组织液经匀浆经200 目筛绢网过滤，再经0 .45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，此滤液就为游离的WSSV 粗提液。
④对WSSV病毒的DNA制备，将上一步做出的的粗提液量取300µL，向粗提液中加入30 µL蛋白酶K（20mg/m L），振荡混匀后放入55℃水浴中孵育至少3个小时，消化好的粗提液13000×g离心10min，然后取上清2µL作PCR模版。
⑤将待扩增的DNA片段转入p UC18质粒，构成重组质粒p UC18-WSSV，经重组质粒增殖后提出目的DNA，经定量计算作标准。然后在93℃2min预变性，60℃1min退火延伸，共40个循环。单点荧光检测在60℃进行。
2、人工WSSV感染对虾
①室内准备2.5m3的塑料圆桶20个，每桶装有曝气头，用0.5‰高锰酸钾对桶和曝气头及连接充气管进行消毒，用超滤膜过滤+紫外消毒的海水清洗每个桶，然后装入1.5m3的该海水，每桶放入消毒的健康对虾30尾（45日龄，每尾对虾PCR检测WSSV、TSV为阴性），每日饲喂三次（每次饲喂对虾饲料为对虾体重的5%），每天换水一次，饲喂不同饲料组暂养7d后，实验组对虾肌肉注射WSSV稀释液100μL，观察日期为15d。
②游离 WSSV粗提液制备，从WSSV 的虾池中挑选出具有WSSV典型症状的凡纳滨对虾数尾，经PCR检测，WSSV呈阳性。对于病虾，将其头部，胸部和肝胰腺去掉后，在冰浴条件下剪碎。按每克组织加入100m L PBS缓冲液，缓冲液pH约为7.6，在冰浴中电动匀浆1h将组织液经匀浆经200 目筛绢网过滤，再经0 .45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，此滤液就为游离的WSSV 粗提母液，然后取该母液1mL ，用PBS缓冲液10稀释该母液，10-4稀释液为对虾肌肉注射液，实验组（饲喂中草药组、饲喂春雷残渣分离蛋白+中草药组）每尾对虾肌肉注射10- 4WSSV稀释液0.1mL，对照组饲喂恒兴牌对虾饲料。
3、实验对虾免疫因子测定
①实验试剂如下：
ACD抗凝剂：柠檬酸钠1.32g，柠檬酸0.48g，葡萄糖1.47g，加水定容至100ml，灭菌备用；
0.1mol/ L ，pH 6.0 的磷酸钾盐缓冲液：13.2mL的1molL-1的K2HPO4混合86.8ml的1molL-1的KH2PO4；
0.01 mol/ L 的L-dopa（邻苯二酚）：L-dopa由sigma公司生产；
pH=7.4的PBS缓冲液：800mL蒸馏水溶解8gNaCl，0.2gKCl，1.4gNa2HPO4和0.24g KH2PO4，用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水定容至1L，高温高压灭菌20min用；
酸性磷酸酶（ALP）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；过氧化物酶（南京建成生物工程研究所）；考马斯亮兰蛋白测量试剂盒（南京建成生物工程研究所）。
②测试方法，参照南京建成生物工程研究所上述细胞免疫因子测试说明书进行，具体如下：
PO测试：
以L-dopa 为底物，采用改进的Ashida方法(何南海，2004；雷质文等，2001；Ashida，1971；沈锦玉，1997)按以下步骤进行测定：
（1）配置0.01 mol/ L 的L-dopa和0.1mol/LpH6.0的磷酸钾盐缓冲液；
（2）96孔酶标板中，每空加入300μL的0.1mol/LpH6.0的磷酸钾盐缓冲液；
（3）每空加入10μL0.01mol/L的L-dopa 及10μL 血清置于室温下混匀；
（4）置于MODEL550 Microplate reader 中，要求室内温度28 ℃左右，固定吸收波长490nm ，按照每2 min 测量1次，测量10次，测其血清酶动力学OD 值；
（5）以OD490对反应时间作图，以实验条件下的每分钟OD 值增加0.001定义为1个酶活力单位。
SOD测试
本实验用超氧化物歧化酶测定试剂盒测定（王彦波等，2003） (南京建成生物工程研究所生产) 。SOD 活力定义为:每毫升反应液中SOD 抑制率达50 %时所对应的SOD 的量为1个亚硝酸盐单位(NU) 。A SOD =(A C - A D)/A C÷50 % ×d式中：A SOD为SOD 活力，单位NU/ mL ；A C 为对照管吸光度；A D 为测定管吸光度；d 为稀释倍数。
ALP活力的测定方法
本实验用碱性磷酸酶检测试剂盒测定（王彦波等，2003）(南京建成生物工程研究所生产)，各试剂以及血清的使用量为试剂盒标准用量的1/ 10。
THC的测试
采用考马斯亮兰染色法（Broadford法）对血清总蛋白进行定量（Nickerson , et al.，1971；Pérez-Jar, et al.，2006）。
实施例1
经过前述的蛋白多肽分离与纯化的步骤，对残渣的蛋白与残渣的其他物质如金属离子、脂类、糖类、纤维素类进行分离，得到春雷霉素残渣蛋白，经检测，所述的春雷霉素残渣蛋白中，以质量比计：
28.4kDa：40～50%
31.0kDa：20～30%
14.4kDa：10～20%，
58.9kDa：10～20%。
上述的春雷霉素残渣蛋白作为春雷霉素残渣蛋白组。
中草药组的组分为：金银花10份，连翘15份，板蓝根25份，黄芪20份，大青叶15份，菟丝子10份，粗蛋白5份。
春雷霉素残渣蛋白与中草药互配组的成分为：上述的春雷霉素残渣蛋白和上述中草药组以20：1的质量比混合。
然后将所得春雷霉素残渣蛋白与中草药互配组、春雷霉素残渣蛋白组和中草药组进行WSSV感染实验。
实施例2
确定春雷霉素残渣的蛋白含量，采用以下步骤：
①标准蛋白溶液的配制:精确称取牛血清白蛋白500mg，用蒸馏水定容至50mL，配成10mg/mol 的溶液1L。取1mL该溶液，用去离子水稀释至10mL，配成1.00mg/mL的标准蛋白溶液。②考马斯亮蓝G-250溶液的配制：精确称取考马斯亮蓝G-250为100mg，溶于50mL95%的乙醇，再加入120mL85%的磷酸，稀释定容至1000mL备用。③标准曲线的绘制：从标准蛋白（初始浓度为1.00mg/mL）依次倍稀释为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.00mg/mL蛋白浓度，混合均匀后，向各管中加入5mL考马斯亮蓝溶液，摇匀，并放置5min左右，用1cm光径的比色皿，在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。通过测试春雷霉素残渣经离心分离等系列步聚所得春雷霉素残渣中的蛋白含量为387mg/kg。
实施例3
为了比较不同饲喂组经WSSV注射后各组的死亡率情况，从WSSV 的虾池中挑选出具有WSSV典型症状的凡纳滨对虾数尾，经PCR检测，WSSV呈阳性。
对于病虾，将其头部，胸部和肝胰腺去掉后，在冰浴条件下剪碎。按每克组织加入100m L PBS缓冲液，缓冲液pH约为7.6，在冰浴中电动匀浆1h将组织液经匀浆经200目筛绢网过滤，再经0 .45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，此滤液就为游离的WSSV 粗提母液，然后取该母液1mL，用PBS缓冲液10稀释该母液，10-4稀释液为对虾肌肉注射液，实验组为饲喂中草药7d后、饲喂春雷残渣分离蛋白+中草药组7d后、饲喂春雷霉素残渣7d后；每组设立三个平行样组，每个平行样组为45日龄的30尾对虾装入一个养殖桶；各桶水温为25±0.5℃，DO为4mg/L；消毒过滤海水，每桶海水装量1500L，每天换水一次和清除残饵及对虾排泄物一次；观察实验对虾存活情况（16d），每尾对虾肌肉注射10-4WSSV稀释液0.1mL，对虾存活数量具体结果见下表3.1。
表3.1 感染WSSV各组在实验天数下的对虾存活数量
由表3.1可知，未感染WSSV组对虾死亡率为0%，饲喂中草药组、饲喂春雷霉素残渣分离蛋白组感染和饲喂中草药+春雷霉素残渣蛋白各组对虾感染WSSV第6d的死亡率分别为60%、60%和56%，而对照组死亡率为83.3%，经检验饲喂蛋白组、饲喂中草药组与饲喂中草药+残渣蛋白组的死亡率比较差异显著（p<0.05），三组与感染对照组的死亡率比较差异及（p<0.01），感染16d后，饲喂中草药组、饲喂春雷霉素残渣分离蛋白组感染和饲喂中草药+春雷霉素残渣蛋白各组对虾感染WSSV的死亡率分别为68.9%、70%和63.3%，感染WSSV16d，经两两比较，饲喂春雷霉素残渣分离蛋白组与中草药组的死亡率差异不显著（p>0.05），饲喂春雷霉素残渣分离蛋白组与饲喂中草药+春雷霉素残渣蛋白组的死亡率差异显著（0.01<p<0.05），饲喂中草药组与饲喂中草药+春雷霉素残渣蛋白组的死亡率差异显著（0.01<p<0.05）。
实施例4
为了比较不同饲喂组感染WSSV各组在不同实验天数存活和死亡对虾组织中的WSSV复制与拷贝情况，从WSSV 的虾池中挑选出具有WSSV典型症状的凡纳滨对虾数尾，经PCR检测，WSSV呈阳性。
对于病虾，将其头部，胸部和肝胰腺去掉后，在冰浴条件下剪碎。按每克组织加入100m L PBS缓冲液，缓冲液pH约为7.6，在冰浴中电动匀浆1h将组织液经匀浆经200 目筛绢网过滤，再经0 .45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，此滤液就为游离的WSSV 粗提母液，然后取该母液1mL ,用PBS缓冲液10稀释该母液，10-4稀释液为对虾肌肉注射液，实验组为饲喂中草药7d后、饲喂春雷残渣分离蛋白+中草药组7d后、饲喂春雷霉素残渣7d后；每组设立三个平行样组，每个平行样组为45日龄的30尾对虾装入一个养殖桶;各桶水温为25±0.5℃，DO为4mg/L；消毒过滤海水，每桶海水装量1500L，每天换水一次和清除残饵及对虾排泄物一次；观察实验对虾存活情况（16d），每尾对虾肌肉注射10-4WSSV稀释液0.1mL，感染WSSV对虾后，存活对虾各组织在第2、4、8和16d的WSSV数量情况见下表4.1。
表4.1感染WSSV对虾后各组存活对虾在不同组织的WSSV数量变化
由表4.1可知，由于感染WSSV后，WSSV在各组对虾中复制与繁殖，在感染WSSV的2-4d内，病毒呈几何复制至第4d，各组对虾体内病毒复制数为最大，在感染WSSV随后期间各组对虾组织的病毒数差异不显著（p>0.05），感染第4d，相同组织的WSSV数量比较发现：饲喂春雷残渣分离蛋白+中草药组的存活对虾与饲喂中草药组或饲喂残渣蛋白组的数量要低，经检验差异显著（p<0.05）;感染第8d，相同组织的WSSV数量比较发现：饲喂春雷残渣分离蛋白+中草药组的存活对虾与饲喂中草药组或饲喂残渣蛋白组的数量要低，经检验差异显著（p<0.05）。在感染2-8d期间，对存活对虾WSSV数量比较可知，饲喂恒兴牌饲料组比其余三组实验组都要高，饲喂恒兴牌饲料组的WSSV数量比其余三组中任一一组比较，差异显著（p<0.05）。
感染16d后，除了饲喂恒兴牌饲料组的存活对虾肝胰腺检测出少量WSSV外，其余各组未检测出，说明对虾有先天的免疫系统，对虾本身具备初步抵抗WSSV先天性免疫功能。
实施例5
为了考察凡纳滨对虾的THC、PO、SOD和ALP的变化情况，实验组（饲喂中草药7d后、饲喂春雷残渣分离蛋白+中草药组7d后、饲喂春雷霉素残渣蛋白7d后；每组设立三个平行样组，每个平行样组为45日龄的30尾对虾装入一个养殖桶;各桶水温为25±0.5℃，DO为4mg/L；消毒过滤海水，每桶海水装量1500L，每天换水一次和清除残饵及对虾排泄物一次）；对照组（饲喂恒兴牌饲料组）的饲养条件与实验组相同，结果表明：单独饲喂蛋白饲料组的对虾THC为（3.51±0.26）×107 cells·mL-1、PO为（303±12.5）U·100mL-1，SOD为（371±14.6）U·100mL-1和ALP为（40.92±4.89）U·100mL-1；饲喂中草药组对虾THC为（3.71±0.18）×107 cells·mL-1、PO为（316±11.7）U·100mL-1，SOD为（369±13.5）U·100mL-1和ALP为（41.83±3.81）U·100mL-1；饲喂蛋白+中草药组的对虾THC为（3.83±0.129）×107 cells·mL-1、PO为（333±10.6）U·100mL-1，SOD为（383±10.9）U·100mL-1和ALP为（45.83±4.11）U·100mL-1，对照组的对虾THC为（2.05±0.41）×107 cells·mL-1、PO为（162±10.8）U·100mL-1，SOD为（339±11.4）U·100mL-1和ALP为（25.83±1.85）U·100mL-1。可见，实验组的THC、PO、SOD和ALP数据均显著高于对照组，尤其是饲喂春雷残渣分离蛋白+中草药制剂组。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围。

Claims (10)

1.一种抗WSSV的春雷霉素残渣蛋白联合中草药制剂，其特征在于，由春雷霉素残渣蛋白、金银花、连翘、板蓝根、黄芪、菟丝子和大青叶组成。
2.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，以质量比计，金银花为5～15份，连翘为10～20份，板蓝根为20～35份，黄芪为15～25份，大青叶为25～35份，菟丝子为5～15份。
3.根据权利要求2所述的制剂，其特征在于，以质量比计，金银花10份，连翘15份，板蓝根25份，黄芪20份，大青叶15份，菟丝子10份，粗蛋白5份。
4.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述的春雷霉素残渣蛋白与中药的质量配比为40：1～10:1。
5.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述的春雷霉素残渣蛋白经过蛋白多肽分离与纯化的步骤，具体如下：
①小金色链霉菌在发酵罐进行发酵，其接种量为10-15%，发酵温度为28-30℃，发酵罐搅拌器的转速为100-150r/min，葡萄糖添加量为20-40L/h，在线氨水补量使得pH为6.2-6.5，然后在500～700L/min灭菌空气的条件下进行160-200h发酵，然后停止发酵，发酵液经草酸酸化使其pH为3.5-4.0，再经陶瓷膜过滤，滤过液为制备春雷霉素原药的预备滤液，其中截留物为春雷霉素残渣；
②滤渣经10000-15000rpm离心10-15min去除不溶物，在上清液中缓慢加入(NH4)2SO4至30-80%饱和度，于4-6℃条件下缓慢搅拌，静置6-10小时后，经3000-5000rpm离心10-15min去除不溶物，向上清液中补加(NH4)2SO4至80%饱和度，在4-6℃条件下缓慢搅拌，静置数小时后，经3000-5000rpm离心10-15min，收集蛋白沉淀；
③用透析袋，将收集的蛋白沉淀物进行脱盐，以5%的柱床体积上样量进行Sephadex-75过柱纯化，流速0.2-0.6mL/min，用30-40mmol/LTris-HCl进行洗脱，收集洗脱液，收集浓缩液，浓缩液冷冻干燥获粗蛋白，另外取浓缩液10-20μL至200μL的Ep管中，加入5μL蛋白上样缓冲液，混匀，沸水浴煮沸10-20min使其充分变性，加样开始电泳分析，SDS - PA GE电泳条件：配胶：6-10%的浓缩胶，10-20%的分离胶，电压：浓缩恒压70-90V，分离恒压140-160V。
6.权利要求1-5中任一项所述的制剂在抗WSSV中的应用，其特征在于，按比例称取金银花、连翘、板蓝根、黄芪、菟丝子和大青叶，研磨成粉末后，加入蒸馏水封闭熬制，待冷却室温后，离心过滤取上清液，然后与一定质量配比的从春雷霉素残渣分离的蛋白混合得到所述的制剂，再将制剂均匀喷晒到虾料上，低温干燥制备。
7.权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的制剂与虾料的质量比为1:10，所述的低温干燥为60-80℃下干燥。
8.权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用包括以下的步骤：室内准备2.5m3的塑料圆桶10个，每桶装有曝气头，用0.5‰高锰酸钾对桶和曝气头及连接充气管进行消毒，用超滤膜过滤+紫外消毒的海水清洗每个桶，然后装入1.5m3的该海水，每桶放入消毒的健康对虾30尾，每日饲喂三次，每天换水一次，饲喂不同饲料组暂养7d后，实验组对虾肌肉注射WSSV母液10μL，观察日期为15d。
9.权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的健康对虾为45日龄，每尾对虾PCR检测WSSV、TSV为阴性。
10.权利要求8所述的应用，其特征在于，每次饲喂对虾饲料为对虾体重的5%。
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