CN115837074B - 一种鲑鳟鱼传染性造血器官坏死病和传染性胰脏坏死病二联佐剂疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鲑鳟鱼传染性造血器官坏死病和传染性胰脏坏死病二联佐剂疫苗及其制备方法。本发明提供的二联疫苗由传染性造血器官坏死病疫苗和传染性胰脏坏死病疫苗按照体积比为1：(1‑9)的比例混合而成；所述传染性造血器官坏死病疫苗由传染性造血器官坏死病毒灭活液和MontanideTM GEL 02 PR佐剂组成；所述传染性胰脏坏死病疫苗由传染性胰脏坏死病毒灭活液和MontanideTM GEL 02 PR佐剂组成。本发明所提供的二联佐剂疫苗能同时帮助宿主有效抵抗IHNV和IPNV的感染，且保护期长达4个月，并且该二联疫苗安全性良好。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种鲑鳟鱼传染性造血器官坏死病和传染性胰脏坏死病二联佐剂疫苗及其制备方法。
背景技术
鲑鳟鱼(Salmon and trout)是指以鲑科鱼类为主要代表的一批优质冷水性鱼类，主要包括大西洋鲑(Salmosalar)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、王鲑(Oncorhynchustshawytscha)、银鲑(Oncorhynchus kisutch)等，是国际主流养殖和贸易品种。我国鲑鳟鱼主养品种为虹鳟，主要以淡水养殖为主，养殖区域广泛分布在中国东北、西北、西南等冷水资源较发达的地区，在带动当地经济发展、促进渔民增收方面发挥了积极的作用。鲑鳟鱼养殖符合我国“提质增效、绿色发展”的现代渔业发展要求。近些年，我国内陆引进了大型循环水养殖设施，沿海地区也开发了现代海洋牧场养殖虹鳟，鲑鳟鱼产养殖业迅速转型升级。但是我国鲑鳟鱼养殖业正面临重大病害难题，产业发展严重受阻。
目前威胁我国养殖鲑鳟的疫病主要为2种病毒病，即传染性造血器官坏死病(infectious hematopoietic necrosis，IHN)和传染性胰脏坏死病(infectiouspancreatic necrosis，IPN)。IHN为世界动物卫生组织名录二类疫病。根据环境、宿主、毒株等不同，这两种病最高可造成虹鳟、大西洋鲑等鲑鳟幼鱼90％以上的死亡率，是我国鲑鳟鱼产业发必须解决的首要难题。但是，全球范围内并无针对这两种病的二联疫苗。课题组前期开展了IHN灭活疫苗(参见中国专利CN113144185A和 CN113122510A)和IPN灭活疫苗(参见中国专利申请CN113583968A)的研发工作，初步研制了具有发展潜力的目标产品。
发明内容
本发明的目的是提供一种鲑鳟鱼传染性造血器官坏死病和传染性胰脏坏死病二联佐剂疫苗及其制备方法。
第一方面，本发明要求保护一种传染性造血器官坏死病和传染性胰脏坏死病二联疫苗。
本发明要求保护的传染性造血器官坏死病和传染性胰脏坏死病二联疫苗，由传染性造血器官坏死病疫苗和传染性胰脏坏死病疫苗按照体积比为1：(1-9)的比例混合而成。
其中，所述传染性造血器官坏死病疫苗由传染性造血器官坏死病毒灭活液和MontanideTM GEL 02 PR佐剂组成；所述传染性胰脏坏死病疫苗由传染性胰脏坏死病毒灭活液和MontanideTM GEL 02 PR佐剂组成。
进一步地，在所述传染性造血器官坏死病疫苗中，MontanideTM GEL 02 PR佐剂的体积百分含量为10％-20％(即所述传染性造血器官坏死病毒灭活液的体积百分含量为80-90％)。在所述传染性胰脏坏死病疫苗中，MontanideTM GEL 02 PR佐剂的体积百分含量为10％-20％(即所述传染性胰脏坏死病毒灭活液的体积百分含量为80-90％)。
更进一步地，在所述传染性造血器官坏死病疫苗中，所述传染性造血器官坏死病毒灭活液和MontanideTM GEL 02 PR佐剂的体积比可为9:1。在所述传染性胰脏坏死病疫苗中，所述传染性胰脏坏死病毒灭活液和MontanideTM GEL 02 PR佐剂的体积比可为9:1。
进一步地，所述传染性造血器官坏死病疫苗和所述传染性胰脏坏死病疫苗的体积比具体可为1:1或1:4或者1:9。
进一步地，所述传染性造血器官坏死病毒灭活液可为传染性造血器官坏死病毒经甲醛灭活后所得。所述传染性胰脏坏死病毒灭活液可为传染性胰脏坏死病毒经甲醛灭活后所得。利用甲醛对所述传染性胰脏坏死病毒进行灭活时，甲醛的终浓度可为 0.25％-2.5％(如0.25％)体积百分含量。
进一步地，所述传染性造血器官坏死病毒灭活液在灭活前的病毒滴度可为107TCID50/0.1ml。所述传染性胰脏坏死病毒灭活液在灭活前的病毒滴度可为107TCID50/0.1ml。
进一步地，所述传染性造血器官坏死病疫苗和所述传染性胰脏坏死病疫苗均可按照如下第二方面中相关方法制备得到。
更进一步地，所述传染性造血器官坏死病和传染性胰脏坏死病二联疫苗可按照如下第二方面所述方法制备得到。
第二方面，本发明要求保护一种制备传染性造血器官坏死病和传染性胰脏坏死病二联疫苗的方法。
本发明要求保护的制备传染性造血器官坏死病和传染性胰脏坏死病二联疫苗的方法，可包括如下步骤：
(A)制备传染性造血器官坏死病毒灭活液；然后将所述传染性造血器官坏死病毒灭活液和MontanideTM GEL 02 PR佐剂混合，得到传染性造血器官坏死病疫苗；
(B)制备传染性胰脏坏死病毒灭活液；然后将所述传染性胰脏坏死病毒灭活液和MontanideTM GEL 02 PR佐剂混合，得到传染性胰脏坏死病疫苗；
(C)将(A)中制得的所述传染性造血器官坏死病疫苗和(B)中制得的所述传染性胰脏坏死病疫苗按照体积比为1：(1-9)的比例混合，得到传染性造血器官坏死病和传染性胰脏坏死病二联疫苗。
进一步地，在所述传染性造血器官坏死病疫苗中，MontanideTM GEL 02 PR佐剂的体积百分含量为10％-20％(即所述传染性造血器官坏死病毒灭活液的体积百分含量为80-90％)。在所述传染性胰脏坏死病疫苗中，MontanideTM GEL 02 PR佐剂的体积百分含量为10％-20％(即所述传染性胰脏坏死病毒灭活液的体积百分含量为80-90％)。
更进一步地，在所述传染性造血器官坏死病疫苗中，所述传染性造血器官坏死病毒灭活液和MontanideTM GEL 02 PR佐剂的体积比可为9:1。在所述传染性胰脏坏死病疫苗中，所述传染性胰脏坏死病毒灭活液和MontanideTM GEL 02 PR佐剂的体积比可为9:1。
进一步地，所述传染性造血器官坏死病疫苗和所述传染性胰脏坏死病疫苗的体积比具体可为1:1或1:4或者1:9。
在步骤(A)中，所述传染性造血器官坏死病毒灭活液可为传染性造血器官坏死病毒经甲醛灭活后所得。在步骤(B)中，所述传染性胰脏坏死病毒灭活液可为传染性胰脏坏死病毒经甲醛灭活后所得。
在步骤(A)中，所述传染性造血器官坏死病毒灭活液在灭活前的病毒滴度可为107TCID50/0.1ml。在步骤(B)中，所述传染性胰脏坏死病毒灭活液在灭活前的病毒滴度可为107TCID50/0.1ml。
在步骤(A)中，所述制备传染性造血器官坏死病毒灭活液可按照如下进行：取病毒滴度为107TCID50/0.1ml的传染性造血器官坏死病毒液，加入甲醛使其终浓度为 5mM，迅速混匀；将加完甲醛的病毒液置于摇床，24℃条件下，100r/min灭活24h，用终浓度为1mM的亚硫酸氢钠溶液终止灭活，即得传染性造血器官坏死病毒灭活液。
在步骤(B)中，所述制备传染性胰脏坏死病毒灭活液可按照如下进行：取病毒滴度为107TCID50/0.1ml的传染性胰脏坏死病毒液，加入甲醛使其终浓度为 0.25％-2.5％(如0.25％)体积百分含量，混匀；置于摇床，24-26℃(室温)，100r/min 灭活12h，终止灭活，即得传染性胰脏坏死病毒灭活液。
第三方面，本发明要求保护传染性造血器官坏死病毒灭活液、传染性胰脏坏死病毒灭活液和MontanideTM GEL 02 PR佐剂在制备传染性造血器官坏死病和传染性胰脏坏死病二联疫苗中的应用；所述传染性造血器官坏死病和传染性胰脏坏死病二联疫苗由传染性造血器官坏死病疫苗和传染性胰脏坏死病疫苗按照体积比为1：(1-9)的比例混合而成。
进一步地，在所述传染性造血器官坏死病疫苗中，MontanideTM GEL 02 PR佐剂的体积百分含量为10％-20％(即所述传染性造血器官坏死病毒灭活液的体积百分含量为80-90％)。在所述传染性胰脏坏死病疫苗中，MontanideTM GEL 02 PR佐剂的体积百分含量为10％-20％(即所述传染性胰脏坏死病毒灭活液的体积百分含量为80-90％)。
更进一步地，在所述传染性造血器官坏死病疫苗中，所述传染性造血器官坏死病毒灭活液和MontanideTM GEL 02 PR佐剂的体积比可为9:1。在所述传染性胰脏坏死病疫苗中，所述传染性胰脏坏死病毒灭活液和MontanideTM GEL 02 PR佐剂的体积比可为9:1。
进一步地，所述传染性造血器官坏死病疫苗和所述传染性胰脏坏死病疫苗的体积比具体可为1:1或1:4或者1:9。
进一步地，所述传染性造血器官坏死病毒灭活液可为传染性造血器官坏死病毒经甲醛灭活后所得。所述传染性胰脏坏死病毒灭活液可为传染性胰脏坏死病毒经甲醛灭活后所得。
更进一步地，利用甲醛对所述传染性胰脏坏死病毒进行灭活时，甲醛的终浓度可为0.25％-2.5％(如0.25％)体积百分含量。
进一步地，所述传染性造血器官坏死病毒灭活液在灭活前的病毒滴度可为107TCID50/0.1ml。所述传染性胰脏坏死病毒灭活液在灭活前的病毒滴度为107TCID50/0.1ml。
在上述各方面中，本发明所述二联疫苗可用于预防IHNV和IPNV宿主感染传染性造血器官坏死病毒和/或传染性胰脏坏死病毒，用于预防和/或治疗IHNV和IPNV宿主因感染传染性造血器官坏死病毒和/或传染性胰脏坏死病毒所致疾病。
本发明还要求保护所述疫苗在预防和/或治疗IHNV和IPNV宿主因感染传染性造血器官坏死病毒和/或传染性胰脏坏死病毒所致疾病中的应用。
本发明还要求保护一种预防和/或治疗IHNV和IPNV宿主因感染传染性造血器官坏死病毒和/或传染性胰脏坏死病毒所致疾病的方法，包括如下步骤：使用本发明所述疫苗实现对IHNV和IPNV宿主因感染传染性造血器官坏死病毒和/或传染性胰脏坏死病毒所致疾病的预防和/或治疗。
其中，所述IHNV和IPNV宿主可为鱼类，如鲑鳟鱼(Salmon and trout)，具体如虹鳟。
在本发明的具体实施方式中，所述传染性造血器官坏死病毒具体为传染性造血器官坏死病毒LN15分离株。所述传染性胰脏坏死病毒具体为传染性胰脏坏死病毒GS2020-1分离株。
在本发明中，将MontanideTM GEL 02 PR佐剂替换为组成成分相同或相似的其他佐剂也应当属于本发明的保护范围。MontanideTM GEL 02 PR佐剂中含有聚氧乙烯 C12-C18烷基醚。
本发明选择了4种佐剂，利用佐剂产品说明书推荐的方法分别与IHNV灭活液和IPNV灭活液进行配伍，制备佐剂灭活疫苗，免疫虹鳟，通过测定不同时间点的疫苗相对免疫保护效果筛选出针对单独的IHNV和IPNV最佳的疫苗佐剂。然后将针对单独的IHNV和IPNV最佳的疫苗佐剂按照不同比例混合，筛选效果最佳的二联佐剂疫苗，并对二联疫苗进行安全性检验。最终所得二联佐剂疫苗能同时帮助宿主有效抵抗IHNV 和IPNV的感染，且保护期长达4个月，并且该二联疫苗安全性良好。
附图说明
图1为IHN佐剂疫苗相对免疫保护效力分析。误差线上不同字母代表差异显著 (P<0.05)。
图2为IPN佐剂疫苗免疫保护效力分析。误差线上不同字母代表差异显著 (P<0.05)。
图3为二联疫苗抗IHNV保护效力分析。误差线上不同字母代表差异显著 (P<0.05)。
图4为二联疫苗免疫后7天虹鳟组织切片。
图5为二联疫苗免疫后14天虹鳟组织切片。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、传染性造血器官坏死病和传染性胰脏坏死病二联疫苗的制备及效果检测
一、材料与方法
1、材料
传染性造血器官坏死病毒LN15分离株(infectious hematopoieticnecrosisvirus,IHNV)记载于“Xu L,Zhao J,Liu M,et al.Phylogeography andevolution of infectious hematopoietic necrosis virus in China[J].Molecularphylogenetics and evolution,2019,131:19-28.”一文；传染性胰脏坏死病毒 GS2020-1分离株(infectious pancreatic necrosis virus，IPNV)本实验室分离保存，该毒株记载在如下文献中：Duan K Y,Zhao J Z,Ren G M,et al.Molecular Evolution ofInfectious Pancreatic Necrosis Virus in China[J].Viruses,2021, 13(3):488.。上述两个病毒毒株按照国家生物安全的有关规定公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明试验使用，不得他用。
大鳞大麻哈鱼胚胎细胞(CHSE-214细胞)由本实验室保存，该细胞记载在如下文献中：Xu L M,Zhao J Z,Liu M,et al.Bivalent DNA vaccine induces significantimmune responses against infectious hematopoietic necrosis virus andinfectious pancreatic necrosis virus in rainbow trout[J].Scientific reports,2017,7(1):5700。公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明试验使用，不得他用。
2、IHN佐剂疫苗的制备
IHN甲醛灭活液的制备：取新鲜的IHNV病毒液(107TCID50/0.1ml)，加入甲醛(终浓度为5mM)，迅速混匀。将加完甲醛的病毒液置于摇床，24℃条件下，100r/min灭活24h活液分别与无菌的佐剂(经高温高压灭菌锅116℃灭菌20min)进行配伍(表 1)，制备均质溶液，获得IHN佐剂疫，加入亚硫酸氢钠溶液(终浓度为1mM)终止灭活，获得IHNV灭活液。将该IHNV灭苗。
3、IPN佐剂疫苗的制备
(1)IPNV灭活条件的确定
向新鲜的IPN病毒液(107TCID50/0.1ml)中加入甲醛使其终浓度分别为0.025％、0.075％、0.25％、2.5％(体积比)，置于室温(25±1℃)条件下，摇床100r/min，分别孵育12、24、36、48h进行灭活处理。加入亚硫酸氢钠溶液(终浓度为1mM) 终止灭活，收获IPNV灭活液，在细胞水平上检测灭活效果。具体操作如下：取上述 IPNV灭活液接种于长满CHSE-214细胞的6孔细胞培养板上(3×105个细胞/孔)，每孔1ml IPNV灭活液。然后将细胞置于15℃二氧化碳培养箱中培养7d，若7d内并未出现细胞病变，则将细胞置于-80℃冰箱反复冻融2次，然后12000r/min 4℃离心15min收集上清液。将该上清液按照上述方法接种CHSE-214细胞进行盲传，连续盲传至第3代，每天观察细胞病变情况，确定IPNV的灭活条件。
(2)IPN佐剂疫苗的制备
利用最佳灭活条件，制备IPNV灭活液。将该灭活液与灭菌(高温高压灭菌锅116℃灭菌20min)后的各佐剂按照表1进行配比，混匀，形成均质溶液，获得IPN佐剂疫苗。
表1、佐剂信息
4、最佳IHN佐剂疫苗的筛选
虹鳟(平均体重10±1g)来自辽宁本溪艾格莫林实业有限公司。PBS注射组作为阴性对照组。疫苗组包括：添加佐剂的灭活疫苗和不加佐剂的灭活疫苗(裸苗)。佐剂为四种(表1)：双相GR208佐剂(标记为A1)、MontanideTM ISA 763 A VG(标记为A2)、MontanideTMGEL 02 PR(标记为B)、4％Al(OH)3凝胶(标记为C)。采用的剂量为50μL每尾。采用的免疫方式为腹腔注射免疫。免疫后将虹鳟置于室内循环水系统(水温13±1℃)养殖。在免疫后30d，对虹鳟进行腹腔注射攻毒，攻毒剂量为 50μL 100TCID50的IHNV病毒原液，每种处理60尾，连续观察21d，统计各组虹鳟累积死亡数，计算各组疫苗相对免疫保护率。计算公式为：相对免疫保护率＝[1-(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100％。根据相对保护率结果，确定最佳疫苗及其最佳免疫剂量。
5、最佳IPN佐剂疫苗的筛选
免疫虹鳟(平均体重10±1g)来自辽宁本溪艾格莫林实业有限公司。PBS注射组作为阴性对照组。疫苗组包括：添加佐剂的灭活疫苗和裸苗(不加佐剂的灭活疫苗)。佐剂为四种(表1)：双相GR208佐剂(标记为A1)、MontanideTM ISA 763 A VG(标记为A2)、MontanideTMGEL 02 PR(标记为B)、4％Al(OH)3凝胶(标记为C)。采用的免疫剂量50μL每尾，免疫方式为腹腔注射免疫。免疫后将虹鳟置于室内流水养殖圆缸(2米直径，水深80cm，水温13±2℃)养殖。在免疫后30d，以10μl/尾的剂量将IPNV(1×106TCID50/0.1ml)对虹鳟(体重为7±1g)进行腹腔注射攻毒，每个处理10尾。于攻毒后3d，分别取5尾鱼的内脏组织(肝、脾及头肾)，以1:10 (g:ml)的比例用PBS缓冲液进行匀浆，然后12000g/min 4℃离心15min收获上清液。上清液经无菌过滤后进行10倍稀释(10-1～10-10)，然后接种于培养在96孔细胞培养板上的CHSE-214细胞上，7d后按Reed-Muench法计算组织中病毒滴度。比较PBS注射组(对照组)虹鳟组织中IPNV滴度与疫苗免疫组虹鳟组织中IPNV滴度差异来分析疫苗的免疫保护效力。
6、二联疫苗的制备及免疫
选择最佳IHN佐剂疫苗和IPN佐剂疫苗制备二联疫苗。首先按照IHN佐剂疫苗和IPN佐剂疫苗1:1、1:4、1:9(v/v)的比例充分混匀，制备出3种二联疫苗，分别命名为H1P1、H1P4、H1P9；同时按照IPN佐剂疫苗和IHN佐剂疫苗1:4、1:9(v/v)的比例充分混匀，再制备出2种二联疫苗，分别命名为P1H4、P1H9；共制备出5种二联疫苗。选择100μL每尾的剂量，对虹鳟(平均体重10±1g)进行腹腔注射。免疫后将虹鳟置于室内流水养殖圆缸(2米直径，水深80cm，水温13±2℃)养殖。
7、二联疫苗抗IHNV效力分析
于免疫后1、2、4个月，分别对虹鳟进行腹腔注射攻毒，攻毒剂量为50μL 100 TCID50的IHNV病毒原液，每个处理60尾，连续观察21d，统计各组虹鳟累积死亡数，计算各组疫苗相对免疫保护率。计算公式为：相对免疫保护率＝[1-(免疫组死亡率/ 对照组死亡率)]×100％。
8、二联疫苗抗IPNV效力分析
于免疫后1、2、4个月，分别以10μl/尾的剂量将IPNV(1×106TCID50/0.1ml) 对虹鳟(n＝10)进行腹腔注射攻毒。于攻毒后3d，分别取5尾鱼的内脏组织(肝、脾及头肾)，以1:10(g:ml)的比例用PBS缓冲液进行匀浆，然后12000g/min 4℃离心15min收获上清液。上清液经无菌过滤后进行10倍稀释(10-1～10-10)，然后接种于培养在96孔细胞培养板上的CHSE-214细胞上，7d后按Reed-Muench法计算组织中病毒滴度。
9、二联疫苗的安全性检验
采用一次单剂量(100μL)、二次单剂量(间隔7天，每次100μL)、一次超剂量(300μL)的二联佐剂疫苗，对虹鳟(平均体重10±1g)进行腹腔注射免疫，每组20尾。以PBS注射的虹鳟为阴性对照。免疫后每天观察虹鳟精神状态及接种部位有无异常，摄食是否正常，是否出现死亡等症状。于免疫后7d和14d分别从各组中随机挑选5尾虹鳟，进行解剖及肉眼观察，同时取肝、脾、肾脏，制作HE染色石蜡切片，利用显微镜观察组织切片。
二、结果与分析
1、最佳IHN灭活疫苗
选择不同的商业化佐剂，按照说明书要求，与病毒灭活液配伍，制备出佐剂灭活疫苗，免疫虹鳟。在免疫时发现，A2佐剂疫苗粘稠度过高，无法进行注射免疫，因此后续研究不包括该佐剂疫苗。在免疫后1个月，进行攻毒试验，计算各疫苗的相对免疫保护率。结果显示，各组疫苗均具有显著的免疫保护效力，其中佐剂B灭活疫苗组无任何虹鳟死亡，相对免疫保护效力高达100％，显著高于其他各组疫苗(P<0.05)，其余各组佐剂疫苗的相对免疫保护率在60％以上。因此，选择IHN佐剂B疫苗进行二联疫苗的制备。参见图1。
2、IPNV灭活条件的确定
利用不同浓度的甲醛对病毒进行不同时间的灭活处理，收获灭活病毒液，利用CHSE-214细胞进行灭活效果检验。结果如表2所示，当甲醛终浓度为0.025％、和0.075％(体积比)时，即使经过48h孵育，在CHSE-214细胞上依旧能观察到病变，说明该浓度未能将IPNV彻底灭活；当甲醛终浓度为0.25％和2.5％(体积比)时，12h即可将IPNV完全灭活，在细胞上观察不到任何细胞病变，说明该浓度可将IPNV彻底灭活。考虑到尽可能降低疫苗产品中外源物质含量，本发明选择终浓度为0.25％(体积比) 的甲醛溶液，置于室温(25±1℃)条件下，摇床100r/min，孵育12h，来制备IPN 病毒灭活液。
表2、甲醛最佳灭活剂量的筛选
注:“+++”为首次接毒后便可观察到细胞病变；“---”代表各代细胞均未发生病变。
3、最佳IPN佐剂疫苗
将IPN病毒灭活液，分别与4种佐剂进行配伍，制备出佐剂灭活疫苗，分别命名为A1灭活疫苗、A2灭活疫苗、B灭活疫苗、C灭活疫苗。不加任何佐剂的灭活液命名为裸苗。采用50μL每尾的剂量对虹鳟进行腹腔注射免疫，在免疫过程中发现，A2灭活疫苗粘稠度过高，颗粒过大，无法进行注射操作，因此未对A2灭活疫苗进行进一步研究。于免疫后30d进行攻毒，攻毒后3d，测定各组虹鳟组织中病毒载量。结果如图2所示，与阴性对照组相比，各疫苗免疫组虹鳟组织中病毒滴度均显著下降，其中B佐剂灭活疫苗组病毒滴度降低最多，病毒滴度仅为对照组的十万分之一(图2)。因此，本发明选择IPN佐剂B疫苗制备二联疫苗。
4、二联疫苗抗IHNV免疫保护效力
对制备的5种组合的二联疫苗进行抗IHNV保护效力分析。结果显示，在免疫后 1、2个月时，各组疫苗均具有极高的相对免疫保护率，最高达100％，各组间无显著差异；在免疫后4个月时，各组疫苗仍然具有较高的保护率，最高达85％以上，此时 H1P9疫苗组免疫保护率显著低于其余两组(P<0.05)，但是仍然高达78％以上(图3)。该结果说明，上述5种组合二联疫苗均能对IHNV产生良好的保护作用。
5、二联疫苗抗IPNV免疫保护效力
对制备的5种组合的二联疫苗进行抗IPNV保护效力分析。结果显示，在免疫后 1、2月，各组疫苗均能显著降低IPNV滴度(P<0.05)，且H1P9组二联疫苗具有更强的抗病毒效果，病毒滴度仅为对照组的万分之一(表3)；在免疫后4个月时，无法从H1P1、H1P4、H1P9免疫组中检测到任何病毒的存在，而此时P1H4、P1H9疫苗组与阴性对照无显著差异，已无抗IPNV效果。在以上任何时间点，阴性对照组中均检测出大量的病毒。该结果说明，H1P1、H1P4、H1P9组合的二联疫苗均能显著抵抗IPNV，其中H1P4、H1P9组合具有更好抗IPNV效果。
表3、免疫后不同时期攻毒后虹鳟组织中的病毒载量
6、二联疫苗免疫保护效力综合判定
本发明设计的5种组合的二联疫苗均能对IHNV产生良好的保护作用(图3)，而仅有H1P1、H1P4、H1P9组合的二联疫苗能显著抵抗IPNV。因此，本发明判定H1P1、 H1P4和H1P9为最佳二联疫苗组合，即按照1:1或1:4或1:9的比例混合IHN佐剂B 疫苗和IPN佐剂B疫苗。
7、二联疫苗的安全性
对二联疫苗进行了免疫动物安全性研究。采用不同剂量对虹鳟进行免疫，然后对虹鳟的行为状态及组织生理变化进行了观察。通过观察发现，各组免疫虹鳟均摄食正常，精神状态正常，无任何不良反应，无任何死亡情况。于免疫后第7d和14d分别从各组中随机挑选5尾虹鳟，解剖观察。结果显示各器官均正常，没有明显的损伤。对各时期的肝、脾、肾组织进行石蜡切片HE染色观察，结果发现与对照组相比，各剂量组的虹鳟组织均无病理变化(图4至图5)。该结果表明，该二联疫苗对虹鳟具有理想的安全性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (22)
1.一种传染性造血器官坏死病和传染性胰脏坏死病二联疫苗，由传染性造血器官坏死病疫苗和传染性胰脏坏死病疫苗按照体积比为1：(1-9)的比例混合而成；
所述传染性造血器官坏死病疫苗由传染性造血器官坏死病毒灭活液和MontanideTMGEL 02PR佐剂组成；
所述传染性胰脏坏死病疫苗由传染性胰脏坏死病毒灭活液和MontanideTM GEL 02PR佐剂组成；
所述传染性造血器官坏死病毒为传染性造血器官坏死病毒LN15分离株；
所述传染性胰脏坏死病毒为传染性胰脏坏死病毒GS2020-1分离株。
2.根据权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于：在所述传染性造血器官坏死病疫苗中，MontanideTM GEL 02PR佐剂的体积百分含量为10％-20％；和/或
在所述传染性胰脏坏死病疫苗中，MontanideTM GEL 02PR佐剂的体积百分含量为10％-20％。
3.根据权利要求2所述的二联疫苗，其特征在于：在所述传染性造血器官坏死病疫苗中，所述传染性造血器官坏死病毒灭活液和MontanideTM GEL 02PR佐剂的体积比为9:1；和/或
在所述传染性胰脏坏死病疫苗中，所述传染性胰脏坏死病毒灭活液和MontanideTMGEL02PR佐剂的体积比为9:1。
4.根据权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于：所述传染性造血器官坏死病疫苗和所述传染性胰脏坏死病疫苗的体积比为1:1或1:4或者1:9。
5.根据权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于：所述传染性造血器官坏死病毒灭活液为传染性造血器官坏死病毒经甲醛灭活后所得；和/或
所述传染性胰脏坏死病毒灭活液为传染性胰脏坏死病毒经甲醛灭活后所得。
6.根据权利要求5所述的二联疫苗，其特征在于：利用甲醛对所述传染性胰脏坏死病毒进行灭活时，甲醛的终浓度为0.25％-2.5％体积百分含量。
7.根据权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于：所述传染性造血器官坏死病毒灭活液在灭活前的病毒滴度为107TCID50/0.1ml；和/或
所述传染性胰脏坏死病毒灭活液在灭活前的病毒滴度为107TCID50/0.1ml。
8.一种制备传染性造血器官坏死病和传染性胰脏坏死病二联疫苗的方法，包括如下步骤：
(A)制备传染性造血器官坏死病毒灭活液；然后将所述传染性造血器官坏死病毒灭活液和MontanideTM GEL 02PR佐剂混合，得到传染性造血器官坏死病疫苗；
(B)制备传染性胰脏坏死病毒灭活液；然后将所述传染性胰脏坏死病毒灭活液和MontanideTM GEL 02PR佐剂混合，得到传染性胰脏坏死病疫苗；
(C)将(A)中制得的所述传染性造血器官坏死病疫苗和(B)中制得的所述传染性胰脏坏死病疫苗按照体积比为1：(1-9)的比例混合，得到传染性造血器官坏死病和传染性胰脏坏死病二联疫苗；
所述传染性造血器官坏死病毒为传染性造血器官坏死病毒LN15分离株；
所述传染性胰脏坏死病毒为传染性胰脏坏死病毒GS2020-1分离株。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：在所述传染性造血器官坏死病疫苗中，MontanideTM GEL 02PR佐剂的体积百分含量为10％-20％；和/或
在所述传染性胰脏坏死病疫苗中，MontanideTM GEL 02PR佐剂的体积百分含量为10％-20％。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：在所述传染性造血器官坏死病疫苗中，所述传染性造血器官坏死病毒灭活液和MontanideTM GEL 02PR佐剂的体积比为9:1；和/或
在所述传染性胰脏坏死病疫苗中，所述传染性胰脏坏死病毒灭活液和MontanideTMGEL02PR佐剂的体积比为9:1。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述传染性造血器官坏死病疫苗和所述传染性胰脏坏死病疫苗的体积比为1:1或1:4或者1:9。
12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤(A)中，所述传染性造血器官坏死病毒灭活液为传染性造血器官坏死病毒经甲醛灭活后所得；和/或
步骤(B)中，所述传染性胰脏坏死病毒灭活液为传染性胰脏坏死病毒经甲醛灭活后所得。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：利用甲醛对所述传染性胰脏坏死病毒进行灭活时，甲醛的终浓度为0.25％-2.5％体积百分含量。
14.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤(A)中，所述传染性造血器官坏死病毒灭活液在灭活前的病毒滴度为107TCID50/0.1ml；和/或
步骤(B)中，所述传染性胰脏坏死病毒灭活液在灭活前的病毒滴度为107TCID50/0.1ml。
15.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤(A)中，所述制备传染性造血器官坏死病毒灭活液按照如下进行：取病毒滴度为107TCID50/0.1ml的传染性造血器官坏死病毒液，加入甲醛使其终浓度为5mM，混匀；置于摇床，24℃，100r/min灭活24h，终止灭活，即得传染性造血器官坏死病毒灭活液；和/或
步骤(B)中，所述制备传染性胰脏坏死病毒灭活液按照如下进行：取病毒滴度为107TCID50/0.1ml的传染性胰脏坏死病毒液，加入甲醛使其终浓度为0.25％-2.5％体积百分含量，混匀；置于摇床，24-26℃，100r/min灭活12h，终止灭活，即得传染性胰脏坏死病毒灭活液。
16.传染性造血器官坏死病毒灭活液、传染性胰脏坏死病毒灭活液和MontanideTMGEL02PR佐剂在制备传染性造血器官坏死病和传染性胰脏坏死病二联疫苗中的应用；所述传染性造血器官坏死病和传染性胰脏坏死病二联疫苗由传染性造血器官坏死病疫苗和传染性胰脏坏死病疫苗按照体积比为1：(1-9)的比例混合而成；
所述传染性造血器官坏死病毒为传染性造血器官坏死病毒LN15分离株；
所述传染性胰脏坏死病毒为传染性胰脏坏死病毒GS2020-1分离株。
17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于：在所述传染性造血器官坏死病疫苗中，MontanideTM GEL 02PR佐剂的体积百分含量为10％-20％；和/或
在所述传染性胰脏坏死病疫苗中，MontanideTM GEL 02PR佐剂的体积百分含量为10％-20％。
18.根据权利要求16所述的应用，其特征在于：在所述传染性造血器官坏死病疫苗中，所述传染性造血器官坏死病毒灭活液和MontanideTM GEL 02PR佐剂的体积比为9:1；和/或
在所述传染性胰脏坏死病疫苗中，所述传染性胰脏坏死病毒灭活液和MontanideTMGEL02PR佐剂的体积比为9:1。
19.根据权利要求16所述的应用，其特征在于：所述传染性造血器官坏死病疫苗和所述传染性胰脏坏死病疫苗的体积比为1:1或1:4或者1:9。
20.根据权利要求16所述的应用，其特征在于：所述传染性造血器官坏死病毒灭活液为传染性造血器官坏死病毒经甲醛灭活后所得；和/或
所述传染性胰脏坏死病毒灭活液为传染性胰脏坏死病毒经甲醛灭活后所得。
21.根据权利要求16所述的应用，其特征在于：利用甲醛对所述传染性胰脏坏死病毒进行灭活时，甲醛的终浓度为0.25％-2.5％体积百分含量。
22.根据权利要求16所述的应用，其特征在于：所述传染性造血器官坏死病毒灭活液在灭活前的病毒滴度为107TCID50/0.1ml；和/或
所述传染性胰脏坏死病毒灭活液在灭活前的病毒滴度为107TCID50/0.1ml。
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| CN113144185A (zh) * | 2021-04-12 | 2021-07-23 | 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 | 一种传染性造血器官坏死病疫苗及其病毒在胖头鱥上皮细胞上扩增的方法 |
| CN113583968A (zh) * | 2021-07-27 | 2021-11-02 | 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 | 传染性胰脏坏死病疫苗及其病毒在大鳞大麻哈鱼胚胎细胞上扩增的方法 |
-
2022
- 2022-02-24 CN CN202210175989.4A patent/CN115837074B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113144185A (zh) * | 2021-04-12 | 2021-07-23 | 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 | 一种传染性造血器官坏死病疫苗及其病毒在胖头鱥上皮细胞上扩增的方法 |
| CN113583968A (zh) * | 2021-07-27 | 2021-11-02 | 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 | 传染性胰脏坏死病疫苗及其病毒在大鳞大麻哈鱼胚胎细胞上扩增的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Eakapol Wangkagharta等.Immune response and protective efficacy of two new adjuvants, Montanide™ ISA 763B VG and Montanide™ GEL02, administered with a Streptococcus agalactiae ghost vaccine in Nile tilapia (Oreochromis niloticus).Fish and Shellfish Immunology.2021,第116卷摘要. * |
| Liming Xu等.Bivalent DNA vaccine induces significant immune responses against infectious hematopoietic necrosis virus and infectious pancreatic necrosis virus in rainbow trout.Scientific RepoRts.2017,第7卷摘要. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115837074A (zh) | 2023-03-24 |
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