CN113144185A - 一种传染性造血器官坏死病疫苗及其病毒在胖头鱥上皮细胞上扩增的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种传染性造血器官坏死病疫苗及其病毒在胖头鱥上皮细胞上扩增的方法。本发明提供了一种制备传染性造血器官坏死病疫苗的方法，包括如下步骤：1)将传染性造血器官坏死病毒按照MOI值为0.0001接种于胖头鱥上皮细胞，培养，收集上清液，得到增殖传染性造血器官坏死病毒；2)用增殖传染性造血器官坏死病毒制备传染性造血器官坏死病疫苗。本发明的实验证明了，以MOI＝0.0001的浓度将IHNV接种EPC细胞，所需收毒时间短、病毒滴度高且稳定。以该增殖方案大规模扩增病毒并用BPL及甲醛制备灭活疫苗，结果显示疫苗对虹鳟的免疫效果好，相对免疫保护效率最高可达84％。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种传染性造血器官坏死病疫苗及其病毒在胖头鱥上皮细胞上扩增的方法。
背景技术
传染性造血器官坏死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV)属弹状病毒科(Rhabdoviridae)，诺拉弹状病毒属(Novirhabdovirus)，为单股负链RNA病毒，是传染性造血器官坏死病(Infectious hematopoietic necrosis，IHN)的病原。
前期研究发现在IHNV传代培养的过程中，当接种剂量过大时，会出现错误包装形成大量的IHNV缺陷病毒，而缺陷病毒不具备繁殖能力，随着传代次数的增加，缺陷病毒会快速累积，最终导致IHNV无法继续进行体外传代；当接种剂量过小时，病毒增殖所需时间较长，延长了生产周期，增加了污染概率，提高了疫苗生产成本。因此，建立稳定的IHNV体外增殖方案是制备该病灭活疫苗的首要条件。但是，目前并无IHNV体外增殖方案系统研究的相关报道。
因此，选用一种合适的接种方案是目前对IHNV的体外增殖的关键。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种制备传染性造血器官坏死病疫苗的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)将传染性造血器官坏死病毒按照MOI值为0.01～0.00001接种于胖头鱥上皮细胞，培养，收集上清液，得到增殖传染性造血器官坏死病毒；
2)用增殖传染性造血器官坏死病毒制备传染性造血器官坏死病疫苗。
上述方法中，所述培养的时间为3～5天。
上述方法中，所述培养的温度为15℃。
上述方法中，所述培养的时间优选为3天、所述培养的温度优选为15℃，所述MOI值优选为0.0001。
上述方法中，所述用增殖传染性造血器官坏死病毒制备传染性造血器官坏死病疫苗为将上述增殖传染性造血器官坏死病毒灭活，得到传染性造血器官坏死病灭活疫苗。
由上述的方法制备的传染性造血器官坏死病疫苗也是本发明保护的范围。
本发明另一个目的是提供一种体外增殖传染性造血器官坏死病毒的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：将传染性造血器官坏死病毒按照MOI值为0.01～0.00001接种于胖头鱥上皮细胞，培养，收集上清液，实现在胖头鱥上皮细胞上增殖传染性造血器官坏死病毒。
上述方法中，所述培养的时间为3～5天。
上述方法中，所述培养的温度为15℃。
上述方法中，所述培养的时间优选为3天、所述培养的温度优选为15℃，所述MOI值优选为0.0001。
上述培养在六孔细胞培养板上进行，且每孔中细胞数约为2×106个。
本发明还提供了一种传染性造血器官坏死病灭活疫苗，为将上述方法制备的体外增殖传染性造血器官坏死病毒灭活，得到传染性造血器官坏死病灭活疫苗。
本发明的实验证明，本发明选择OIE推荐的胖头鱥上皮细胞(Epitheliomapapulosum cyprini，EPC)作为体外增殖细胞系，分别利用不同接种浓度的IHNV感染EPC细胞，连续进行病毒传代。通过测定不同代次病毒的滴度，参考收获病毒时间，筛选出一种病毒滴度稳定、收毒时间短、接种剂量小的IHNV在EPC细胞上的最佳增殖方案。然后利用该方案大量培养IHNV，进行灭活制备灭活疫苗并进行免疫效力分析。以MOI＝0.0001的浓度将IHNV接种EPC细胞，所需收毒时间短、病毒滴度高且稳定。以该增殖方案大规模扩增病毒并用BPL及甲醛制备灭活疫苗，结果显示疫苗对虹鳟的免疫效果好，相对免疫保护效率最高可达84％。
附图说明
图1为不同MOI接种EPC获得的IHNV的滴度。
图2为不同MOI接种的IHNV在EPC细胞上的细胞病变。
图3为不同MOI接种的IHNV的生长曲线。
图4为攻毒虹鳟累计存活率；A:BPL灭活疫苗B:甲醛灭活疫苗。
图5为相对免疫保护率；A:BPL灭活疫苗B:甲醛灭活疫苗；不同小写字母代表差异显著p<0.05。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
MEM培养基(gibco公司，货号：C110905500BT)
感染复数(Multiplicity of infection,MOI)指感染时病毒与细胞数量的比值。
实施例1、IHNV病毒液的制备
一、EPC细胞的复苏与培养
从液氮罐中取出冻存的EPC(美国典型培养物保藏中心，ATCC@CRL-2872TM)迅速放入30℃恒温水浴锅中，不时摇晃使其完全融化。在无菌条件下移入15ml离心管中，于1000g下离心2min，弃去上清，加入1ml细胞培养液(MEM培养基+体积百分含量10％胎牛血清+质量体积百分含量(g:ml)1％双抗)轻轻吹匀。将吹匀的细胞液移入T-25细胞培养瓶中，补加4ml细胞培养液，吹匀后放入25℃二氧化碳恒温细胞培养箱中静置培养，每天在倒置显微镜下观察细胞状态。待T-25细胞培养瓶内长满单层EPC细胞，用1ml 0.25％胰蛋白酶消化贴壁细胞，根据实验所需进行细胞传代、铺6孔细胞培养板或96孔细胞培养板。
二、IHNV在EPC细胞上最佳接种方案的研究
1、不同浓度IHNV感染EPC细胞
将IHNV分离株HLJ15(Xu L,Zhao J,Liu M,et al.Phylogeography andevolution of infectious hematopoietic necrosis virus in China[J].Molecularphylogenetics and evolution,2019,131:19-28.)分别按MOI为0.1、0.01、0.001、0.0001和0.00001感染六孔细胞培养板上的单层EPC细胞，每天观察细胞病变情况并记录细胞病变达80％以上的时间点。
具体接种方案如下：
1)用细胞维持液(MEM细胞培养基+体积百分含量2％胎牛血清)将IHNV病毒液(原代IHNV的滴度为107.42TCID50/0.1ml)分别稀释为不同浓度的病毒培养液(置于冰上)。
2)取6孔板，每孔中单层EPC细胞的量为2×106个，再分别将1ml不同浓度的病毒培养液接种到每孔的单层EPC细胞上，使MOI值分别为0.1、0.01、0.001、0.0001和0.00001。15℃二氧化碳恒温培养箱内孵育1h后，弃去含有病毒的培养液，每孔更换为2mL细胞维持液，于15℃静置培养，每天观察细胞病变情况。
3)当细胞病变达80％以上时(静置培养3～5天时间)，收获病毒于-80℃冰箱反复冻融2次后，以12000r/min离心10min(4℃)，取上清液为第一代IHNV。
4)将第一代IHNV作为感染液以同样的方法传代，传至第10代时结束病毒连续传代。将每次传代收获的上清液分装后保存于﹣80℃冰箱备用。
2、不同浓度IHNV感染EPC细胞检测
1)IHNV滴度测定
在无菌条件下，将上述1以MOI分别为0.1、0.01、0.001、0.0001和0.00001感染EPC细胞后获得的各代病毒液，分别用细胞维持液进行连续10倍稀释，从102至1012，最终得到11个稀释梯度的病毒液(置于冰上)。
将稀释的病毒液按稀释度由高到低接种到单层EPC的96孔细胞培养板(每孔1×105个细胞)上，每个稀释度接种一竖排，共8孔，每孔接种0.1ml稀释的病毒液，细胞维持液为阴性对照。将细胞培养板置于15℃静置培养，连续观察7天，记录病变及未病变孔数。
按Reed-Muench法计算以不同接种方案获得的不同代次IHNV的TCID50。
结果显示，当MOI为0.1时，随着传代次数的增加，TCID50逐渐下降，传至第6代时再无任何细胞病变，TCID50降为0(图1A)；而当MOI为0.01、0.001、0.0001和0.00001时，在传代的过程中病毒滴度均有少量下降，但随着传代次数的增多逐渐趋于稳定，稳定时IHNV滴度依次为107.42、107.42、107.5和107.40TCID50/0.1ml。该结果说明当以MOI为0.1进行连续传代时，IHNV无法持续在EPC细胞中进行增殖；当以MOI为0.01、0.001、0.0001和0.00001进行连续传代时，IHNV滴度均能稳定的保持在较高水平，但是MOI为0.0001时，获得的IHNV滴度均高于其他MOI(图1B)。因此，MOI＝0.1的接种浓度不适合用于IHNV在EPC细胞上的体外连续传代，MOI＝0.0001的接种浓度更适合用于IHNV在EPC细胞上的体外连续传代。
2)病毒收获时间比较
按照MOI为0.01、0.001、0.0001和0.00001将稀释的病毒液接种于含有单层EPC细胞的6孔细胞培养板，每孔1ml稀释的病毒液，每孔2×106个EPC细胞于15℃二氧化碳培养箱静置培养，观察细胞发生病变情况。接种当天记作接种后第0天。
结果如图2所示，以不同MOI接种的细胞开始出现病变的时间没有明显差别，均在接种后2天出现典型细胞病变(图2)，但是细胞病变达到80％所需的时间存在明显的差异。当MOI为0.01、0.001和0.0001时，接种后3～4天细胞病变率即可达80％以上，接种后5天细胞几乎全部脱落；当MOI为0.00001时，接种后4天细胞病变达50％左右，接种后5天细胞病变率才可达80％以上(图2)。
上述结果表明，采用MOI为0.01、0.001和0.0001的接种浓度接种IHNV时，在EPC细胞上具有相对较短的收毒时间。
3)IHNV生长曲线的绘制
取出1)中IHNV以MOI为0.01、0.001、0.0001和0.00001感染EPC细胞上传代时获得的第2代、第5代和第10代病毒液，分别按照各自MOI接种于6孔细胞培养板的单层EPC细胞上，每孔约2×106个EPC细胞，每孔接种1ml病毒液，于15℃二氧化碳培养箱孵育1h，弃去含有病毒的培养液，更换为2ml细胞维持液。
在接种后第1天、第2天、第3天和第4天收获病毒，冻存于﹣80℃冰箱。
按照1)的方法对收获的病毒进行滴度测定，绘制各组IHNV生长曲线。
结果如图3所示，将以不同MOI接种EPC细胞后获得的第2代、第5代及第10代IHNV接种于单层EPC细胞，接种后5天内，每天收获病毒液进行滴度测定，并绘制生长曲线。结果发现，当MOI为0.01、0.001和0.0001时，IHNV的滴度在接种后3天即趋于稳定，总体上表现为在接种后第1～3天呈对数增长，第3～4天缓慢增长并达到峰值，第3～5天的IHNV滴度依次为107.42、107.50和107.52TCID50/0.1ml(MOI＝0.01)；107.34、107.49和107.49TCID50/0.1ml(MOI＝0.001)及107.44、107.55和107.55TCID50/0.1ml(MOI＝0.0001)。当MOI为0.00001时，IHNV滴度在接种后5天才到达峰值(图3)，第3～5天的IHNV滴度依次为106.95、107.28和107.42TCID50/0.1ml。该结果表明，以MOI为0.01、0.001和0.0001接种IHNV时，病毒增殖达到平台期需要的时间相对较短，在接种后3天即可达到107以上，更适合用于IHNV的大规模培养。
综合考虑病毒滴度、传代稳定性及病毒收获时间的长短等因素，本发明推荐收毒时间最短、病毒滴度最高、传代最稳定的最小接种剂量——MOI＝0.0001为IHNV在EPC细胞上连续传代的最佳接种剂量。
因此IHNV在EPC细胞上的最佳增殖方案为：接种浓度为MOI＝0.0001，15℃培养3天即可收获病毒。
3、IHNV病毒液的体外增殖
用细胞维持液(MEM细胞培养基+2％胎牛血清)将IHNV病毒液(第十代病毒液)稀释得到稀释病毒培养液(置于冰上)。
再将稀释病毒培养液接种到T-225细胞培养瓶单层EPC细胞上(使MOI值为0.0001)，于15℃二氧化碳恒温培养箱内培养3天后，收获病毒于-80℃冰箱反复冻融2次后，以12000r/min离心10min(4℃)，取上清液为扩增后IHNV病毒液。
按照上述2中的滴度检测方法检测扩增后IHNV病毒液，结果，扩增后IHNV病毒液的滴度为107.52TCID50/0.1ml。
实施例2、IHNV灭活疫苗的制备及其应用
一、IHNV灭活疫苗的制备
IHN-BPL灭活苗：将β-丙内酯(BPL)加入80ml的实施例1的3得到的扩增后IHNV病毒液，使BPL的终浓度为3mM，混匀后置于24℃摇床，100r/min进行灭活24h，加入硫代硫酸钠溶液(终浓度为20mM)终止灭活，得到IHN-BPL灭活苗；
IHN-甲醛灭活苗：将甲醛加入80ml的实施例1的3得到的扩增后IHNV病毒液，使甲醛的终浓度为5mM，混匀后置于24℃摇床，100r/min进行灭活24h，加入亚硫酸氢钠溶液(终浓度为1mM)终止灭活，得到IHN-甲醛灭活苗。
二、IHNV灭活疫苗的相对免疫保护率检测
1、免疫
将上述一制备的IHN-BPL灭活苗分别以每尾5μl、10μl、20μl的剂量腹腔注射分别免疫虹鳟(虹鳟质量为5±1g，共3组，每组20尾)；
将上述一制备的IHN-甲醛灭活苗分别以10μl、25μl、50μl的剂量腹腔注射分别免疫虹鳟(虹鳟质量为5±1g，共3组，每组20尾)。
以PH值为6.5的PBS作对照(共3组，每组20尾)。
2、攻毒
在免疫后第7天，将IHNV病毒原液(原代IHNV滴度为107.42TCID50/0.1ml)按照100倍TCID50进行稀释，然后每尾虹鳟腹腔注射50μl该IHNV病毒稀释液进行攻毒。记录攻毒后21天内虹鳟累积死亡数，计算IHN灭活疫苗的相对免疫保护率。
结果如图4所示，所制备的IHN灭活疫苗对虹鳟均具有显著的保护作用，不同免疫剂量组的累积死亡率均显著低于对照组。
相对免疫保护率＝(对照组死亡率-免疫组死亡率)/对照组死亡率。
相对免疫保护率结果如图5所示，IHN-BPL灭活疫苗不同免疫剂量组之间相对免疫保护率不存在显著差异，最高可达84％(图5A)。IHN-甲醛灭活苗免疫剂量为25μl时相对免疫保护率与其他免疫剂量组间差异显著，相对免疫保护率为78.4％(图5B)。
Claims (10)
1.一种制备传染性造血器官坏死病疫苗的方法，包括如下步骤：
1)将传染性造血器官坏死病毒按照MOI值为0.01～0.00001接种于胖头鱥上皮细胞，培养，收集上清液，得到增殖传染性造血器官坏死病毒；
2)用增殖传染性造血器官坏死病毒制备传染性造血器官坏死病疫苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述培养的时间为3-5天。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述培养的温度为15℃。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述培养的时间为3天、所述培养的温度为15℃，所述MOI值为0.0001。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：
所述用增殖传染性造血器官坏死病毒制备传染性造血器官坏死病疫苗为将所述增殖传染性造血器官坏死病毒灭活，得到传染性造血器官坏死病灭活疫苗。
6.由权利要求1-5中任一所述的方法制备的传染性造血器官坏死病疫苗。
7.一种体外增殖传染性造血器官坏死病毒的方法，包括如下步骤：将传染性造血器官坏死病毒按照MOI值为0.01～0.00001接种于胖头鱥上皮细胞，培养，收集上清液，实现在胖头鱥上皮细胞上增殖传染性造血器官坏死病毒，得到体外增殖传染性造血器官坏死病毒。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述培养的时间为3-5天；
或，所述培养的温度为15℃。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述培养的时间为3天、所述培养的温度为15℃，所述MOI值为0.0001。
10.一种传染性造血器官坏死病灭活疫苗，为将权利要求7-9任一所述方法制备的体外增殖传染性造血器官坏死病毒灭活，得到传染性造血器官坏死病灭活疫苗。
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