CN111411087A - 一种鲤疱疹病毒ii型弱毒株及其应用 - Google Patents

一种鲤疱疹病毒ii型弱毒株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于疫苗制备技术领域，具体提供了一种鲤疱疹病毒II型弱毒株及其应用，本发明所述的鲤疱疹病毒II型为鲤疱疹病毒II型DX2019株，保藏编号：CCTCC NO：V201980。利用该菌株制备的疫苗可以预防由鲤疱疹病毒II型引起的疾病，免疫保护效果达到92%以上，不会对机体产生应激反应，可应用于鲫造血器官坏死症的预防，降低鲫鱼养殖池塘鲫造血器官坏死症的发病率，提高鲫鱼的存活率。

Description

一种鲤疱疹病毒II型弱毒株及其应用
技术领域
本发明属于疫苗制备技术领域，具体为一种鲤疱疹病毒II型弱毒株及其应用。
背景技术
鲫鱼是我国重要的淡水养殖品种。据统计，2018年全国鲫鱼总产量为277万吨。但是，随着鲫鱼养殖规模的逐渐扩大，集约化程度的不断提高以及养殖水环境的持续恶化，鲫鱼的病害问题日益突出，给养殖业造成重大经济损失。目前，病毒性疾病已成为威胁我国鲫鱼养殖业健康发展的主要因素之一。
鲤疱疹病毒II型(cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)感染养殖鲫鱼引起的鲫造血器官坏死症是我国新发现的一种感染养殖鲫鱼的病毒性疾病，其传染性强，致死率高，给我国鲫鱼养殖业造成巨大的经济损失。近年来，我国鲫造血器官坏死症连年暴发，且呈全国性蔓延趋势，对鲫鱼养殖业的发展构成严重威胁。
对鲫鱼进行疫苗免疫可以有效预防鲫造血器官坏死症的发生和流行。与其他种类疫苗相比，细胞培养活疫苗有如下优点：①接种次数及用量较少。细胞培养活疫苗只需接种1次；②免疫效果好。接种活疫苗后，在动物体内停留一个时期，可增殖产生大量抗原，从而产生良好的免疫应答效果，而机体所获得的免疫力较强而持久，不仅可以产生全身免疫，而且可以产生局部免疫。因此，鲫造血器官坏死症活疫苗无疑是一种优选的预防鲫造血器官坏死症发生的产品。
本发明提供中所描述的鲤疱疹病毒II型是从湖北荆州某鲫鱼-白鲢混养池塘的白鲢肾组织分离中分离的自然弱毒株，对鲫鱼不存在毒力，但能刺激鲫鱼产生抗鲤疱疹病毒II型抗体，即安全，又有效。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种鲤疱疹病毒II型弱毒株，所述弱毒株的保藏编号为： CCTCC NO：V201980。
本发明的另一个目的在于提供了一种鲤疱疹病毒II型DX2019株的应用，该毒株为鲤疱疹病毒II型的自然弱毒株，利用该毒株可用于制备鲫造血器官坏死症活疫苗，制得的疫苗无致病性、免疫原性好、刺激抗体迅速。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：
鲤疱疹病毒II型DX2019(CyHV-2DX2019)株的分离、筛选和鉴定：
本发明提供的弱毒株是申请人于2016年10月从湖北荆州某鲫鱼-白鲢混养池塘的白鲢肾组织分离，经各项鉴定证明为鲤疱疹病毒II型，所述毒株已于2019年10月30日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：鲤疱疹病毒II型CyHV-2-DX2019株，保藏编号：CCTCC NO：V201980，地址：中国武汉武汉大学。
鲤疱疹病毒II型CyHV-2DX2019(本发明或称为DX2019株)连续10代接种鲫脑组织细胞系(GiCB细胞)，每代连续观察14d，细胞未出现典型病变效应。接毒后第15d，收获细胞培养物，提取病毒DNA，用数字PCR仪确定病毒浓度，病毒浓度≥5×105copies/ml。
将鲤疱疹病毒II型(DX2019株)连续10代，其中取6-10代病毒分别接种鲫鱼，连续观察14d。结果显示，6-10代病毒接种鲫鱼后，鲫鱼行为、食欲等生理指标均正常，未表现出任何临床症状，剖检观察接种鲫鱼内脏无病变，说明鲤疱疹病毒II型DX2019株无毒力返强现象，可用于疫苗研究。
因此，本发明还提出了所述的鲤疱疹病毒II型DX2019株在制备疫苗中的应用，其中，所述的疫苗为由鲤疱疹病毒II型感染引起的疾病的疫苗；例如制备成鲫造血器官坏死症活疫苗，其特征在于其有效成分包括本发明所述的鲤疱疹病毒II型DX2019株。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明首次分离得到鲤疱疹病毒II型弱毒株，利用该弱毒株制备成疫苗，注射后对鲫鱼无致病性，能较好的刺激机体产生抗鲤疱疹病毒II型抗体。
2.本疫苗可以预防鲤疱疹病毒II型引起的疾病，免疫保护效果达92％以上，不会对鱼体产生应激反应，可应用于鲫鱼养殖塘对鲫造血器官坏死症的预防，降低养殖场鲫造血器官坏死症的发病率，提高鲫鱼存活率。
具体实施方式
本发明实施例中试验方法和条件如无特别说明，均为常规方法。这些实施例仅用于说明本发明，本发明的保护范围不受这些实施例的限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
鲤疱疹病毒II型CyHV-2DX2019的分离鉴定
(1)鲤疱疹病毒II型的检测
本发明的鲤疱疹病毒II型CyHV-2DX2019弱毒株取自于湖北荆州某鲫鱼-白鲢混养池塘的白鲢，将该白鲢肾组织置于无菌培养皿中，用无菌眼科剪剪碎，加入10倍体积(V/W)的磷酸缓冲液(PBS)，转入玻璃匀浆器内，并在冰浴条件下研磨成组织匀浆液。提取组织匀浆液DNA，用引物CyHV2Hel-F：5’-GGACTTGCGAAGAGTTTGATTTCTAC-3’和 CyHV2Hel-R：5’-CCATAGTCACCATCGTCTCATC-3’进行扩增。扩增产物跑胶结果显示，检测样品在360bp处有特异条带，与鲤疱疹病毒II型阳性结果条带大小一致。将扩增产物测序后比对发现，扩增产物的基因序列与利用该引物扩增CyHV-2序列一致，证明了白鲢肾组织中含有鲤疱疹病毒II型。
(2)鲤疱疹病毒II型CyHV-2DX2019株的分离
将步骤(1)中的组织匀浆液转移至50ml离心管中，在-80℃冷冻后于室温融化，如此反复冻融3次，随后在4℃条件下，4000r/min离心30min。取上清液经0.22μm滤器过滤，获得组织均浆过滤液。
在T-25塑料培养瓶中，用含有10％胎牛血清的M199培养基培养鲫脑组织细胞系(CCTCC NO:C2013179)。待细胞长成汇合单层后(12～18h)，吸出培养基，每瓶加入0.5ml 上述组织均浆过滤液，加入终浓度为10μg/μl聚凝胺，28℃吸附1h，期间每隔15～20min 轻微晃动培养瓶一次，使接种液均匀吸附。待吸附结束后，吸弃组织匀浆滤液，添加血清浓度为2％的M199维持液，28℃培养。同时向对照组细胞添加0.5ml无血清的M199培养基模拟感染，其它操作同感染试验组。光学显微镜下逐日观察细胞病变效应。连续观察14d，未出现典型细胞病变效应。
接种组织匀浆滤液后第15d收获细胞培养物。在-80℃冷冻后于室温融化，如此反复冻融3次，随后在4℃条件下，4000r/min离心30min。取0.5ml上清液，加入到已长成细胞单层的鲫脑组织细胞瓶中，加入终浓度为10μg/μl聚凝胺，28℃吸附1h，期间每隔15～20 min轻微晃动培养瓶一次，使接种液均匀吸附。待吸附结束后，吸弃接种液，添加血清浓度为2％的M199维持液，28℃培养。光学显微镜下逐日观察细胞病变效应。连续观察14d，未出现典型细胞病变效应。按以上接毒方法，盲传接毒细胞置第10代。每代都连续观察14 d，均未出现典型细胞病变效应。
(3)鲤疱疹病毒II型CyHV-2DX2019株的鉴定
将盲传的第10代接毒细胞，连续观察14d后，收获细胞培养物，提取细胞DNA，用引物CyHV2Hel-F：5’-GGACTTGCGAAGAGTTTGATTTCTAC-3’和CyHV2Hel-R： 5’-CCATAGTCACCATCGTCTCATC-3’进行扩增。扩增产物跑胶结果显示，检测样品在360bp 处有特异条带，与鲤疱疹病毒II型阳性结果条带大小一致。将扩增产物测序后比对发现，扩增产物的基因序列与利用该引物扩增CyHV-2序列一致。证明了第10代接毒的细胞中依然含有鲤疱疹病毒II型CyHV-2DX2019。用数字PCR仪确定病毒浓度，病毒浓度≥5×105 copies/ml。
至此，申请人获得了一株能在鲫脑组织细胞系中增殖，但不引起细胞出现典型细胞病变效应的鲤疱疹病毒II型弱毒株。所述毒株已于2019年10月30日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：鲤疱疹病毒II型CyHV-2-DX2019株，保藏编号：CCTCC NO：V201980，地址：中国武汉武汉大学。
实施例2：
鲤疱疹病毒II型CyHV-2DX2019株的对鲫鱼致病性实验
取180尾鲫鱼，平均体重(150.0±4.0)g，平均体长(25.0±2.5)cm。实验前，鲫鱼需进行病毒核酸检测，确认鲤疱疹病毒II型为阴性才能用于实验。按照试验毒株将鲫鱼随机分组6组，每组30尾，通过腹腔注射方法分别接种第6-10代测试毒株(CyHV-2DX2019株 )的新鲜培养物，0.2ml/尾，病毒液病毒浓度≥5×105copies/ml，对照组以同样注射方式接种PBS，连续观察14d。
结果显示，接种了不同代次病毒的鲫鱼行为、食欲等生理指标均正常，未表现出任何临床症状，剖检观察接种鲫鱼内脏无病变。攻毒14d后，提取攻毒组鱼体肾脏DNA，用引物CyHV2Hel-F：5’-GGACTTGCGAAGAGTTTGATTTCTAC-3’和CyHV2Hel-R： 5’-CCATAGTCACCATCGTCTCATC-3’进行扩增。扩增产物跑胶结果显示，检测样品在360bp 处有特异条带，与鲤疱疹病毒II型阳性结果条带大小一致。将扩增产物测序后比对发现，扩增产物的基因序列与利用该引物扩增CyHV-2序列一致。说明鲤疱疹病毒II型DX2019 株无毒力返强现象，可用于制备鲫造血器官坏死症活疫苗。
实施例3：
鲫造血器官坏死症活疫苗的制备
将实施例1中，盲传的第10代及后续代次的接毒细胞，连续观察14d后，收获细胞培养物。在-80℃冷冻后于室温融化，如此反复冻融3次，随后在4℃条件下，4000r/min离心30min。取上清液提取病毒DNA，利用数字PCR检测病毒含量。将病毒浓度≥5×105copies/ml的上清液，用PBS稀释100倍，制备成鲫造血器官坏死症活疫苗，疫苗含鲤疱疹病毒II型DX2019株的浓度≥5×103copies/ml。
实施例4：
鲫造血器官坏死症活疫苗的应用
(1)鲫造血器官坏死症活疫苗最小免疫量的研究
将实施例3制备的鲫造血器官坏死症活疫苗，按不同的免疫剂量腹腔注射0.1ml/尾、 0.2ml/尾、0.3ml/尾、0.4ml/尾免疫病毒核酸检测呈阴性的鲫鱼，对照组注射0.2ml/尾PBS ，每组注射鲫鱼30尾。实验鱼平均体重(150.0±4.0)g，平均体长(25.0±2.5)cm。免疫后第28d，对实验组和对照组进行攻毒试验，每尾鲫鱼腹腔注射滴度为1×106TCID50mL-1的未灭活鲤疱疹病毒2型武汉株(CyHV-2-WH)(《鲤疱疹病毒2型武汉株的分离与鉴定》，徐进等 )0.2ml，连续观察14d，记录感染发病和死亡情况。计算相对免疫保护率(relative percentsurvival,RPS)。
RPS＝[1-(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100％
结果显示(表1)，鲫造血器官坏死症活疫苗对鲫鱼攻毒保护率分别为46.42％、92.85％、96.43％、96.43％(表1)。由上述结果可见，采用鲫造血器官坏死症活疫苗对鲫鱼进行免疫，0.2ml/尾即可达到较好的保护目的，考虑生产中疫苗运输、保存、注射、动物健康状态等因素对疫苗免疫效力的影响，建议鲫鱼(规格：平均体重150.0±4.0g，平均体长25.0±2.5cm )的免疫剂量为0.2ml/尾比较合适，而且为确保鲫鱼有好的免疫保护效果，在环境比较差的鲫鱼养殖场及鲫造血器官坏死症多发季节适当增加免疫剂量也是可行的选择。
表1最小免疫剂量实验相对免疫保护率
Figure RE-GDA0002444173540000051
(2)鲫造血器官坏死症活疫苗免疫期试验报告
用实施例3制备的鲫造血器官坏死症活疫苗分别进行免疫期试验，按0.2ml/尾腹腔注射病毒核酸检测呈阴性的鲫鱼，平均体重(150.0±4.0)g，平均体长(25.0±2.5)cm，对照组注射0.2ml/尾PBS，实验组每组注射鲫鱼240尾，对照组注射鲫鱼240尾。
分别于免疫后第2d、4d、7d、14d、21d、28d、60d、90d、120d、180d、240d、 300d进行血清抗体水平的检测。
免疫后第28d、60d、90d、120d、180d、240d、300d，对实验组和对照组在每个时间点各取鲫鱼30尾进行攻毒试验，每尾鲫鱼腹腔注射滴度为1×106TCID50mL-1的未灭活鲤疱疹病毒2型武汉株(CyHV-2-WH)0.2ml，连续观察14d，记录感染发病和死亡情况。计算相对免疫保护率。
结果表明：实验鲫鱼在免疫后7日已开始产生免疫应答，21日后免疫力建立完全，免疫后300d攻毒结果显示，疫苗的相对免疫保护率为53.57％，即攻毒疫苗的免疫保护可持续到10个月(表2-3)。但为了安全可靠，又因各鲫鱼养殖池塘的鱼群实际情况不同，环境、养殖条件等会影响免疫效果，因此，鲫造血器官坏死症活疫苗的免疫期定为9个月。
表2疫苗保护期实验血清抗体效价
Figure RE-GDA0002444173540000061
表3疫苗保护期实验相对免疫保护率
Figure RE-GDA0002444173540000062
(3)鲫造血器官坏死症活疫苗保存期试验报告
实施例3制备的3批鲫造血器官坏死症活疫苗分别进行保存期试验研究，结果显示，疫苗在2℃～8℃保存3个月、6个月、9个月、12个月、15个月，性状检验无变化。安全检验试验，鲫鱼均未出现注苗引起的局部反应及全身反应，同时免疫效果也基本不变。可见疫苗在2℃～8℃下可保存15个月。但在实际生产中，考虑考虑到生产、运输、使用过程中各种不良因素的影响，规定2℃～8℃条件下该疫苗的保存期为12个月。

Claims (4)

1. 一种分离的鲤疱疹病毒II型弱毒株，所述鲤疱疹病毒II型弱毒株为鲤疱疹病毒II型CyHV-2 DX2019，保藏编号为CCTCC NO：V201980。
2.权利要求1所述的鲤疱疹病毒II型弱毒株在制备由于鲤疱疹病毒II型引起的疾病的疫苗中的应用。
3.权利要求1所述的鲤疱疹病毒II型弱毒株在制备鲫造血器官坏死症疫苗中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，所述的疫苗为权利要求1所述弱毒株的活疫苗。
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