CN110283793B - 一种分离和培养猪伪狂犬病病毒的方法 - Google Patents

一种分离和培养猪伪狂犬病病毒的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用PIEC细胞分离和培养猪伪狂犬病病毒的方法，属于兽医生物技术领域，所述方法利用PIEC分离和培养猪伪狂犬病病毒，在经过数轮噬斑纯化和增殖以后，PRV的病毒滴度可以达到108.5～109.0TCID50/mL。为猪伪狂犬病病毒疫苗的研制、生物学特异性研究、致病机制等奠定了基础和提供了技术支撑。

Description

一种分离和培养猪伪狂犬病病毒的方法
技术领域
本发明属于兽医生物技术领域，具体涉及一种分离和培养猪伪狂犬病病毒的方法。
背景技术
伪狂犬病病毒(PRV)是引起牛、羊、猪、犬和猫等多种家畜和野生动物发热、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要症状的疱疹病毒。猪伪狂犬病病毒又称猪疱疹病毒Ⅰ型、传染性延髓麻痹病毒、奇痒症病毒、奥叶兹基氏病病毒。由于本病的临床症状类似狂犬病，故用了“伪狂犬病”这一病名。猪伪狂犬病病毒可引起妊娠母猪流产、死胎，公猪不育，新生仔猪大量死亡，育肥猪呼吸困难、生长停滞等，是危害全球养猪业的重大传染病之一。PRV为双链DNA病毒，基因组大小为150kb左右，病毒粒子为圆形，直径150～180nm，核衣壳直径为105～110nm。PRV具有广泛的组织嗜性，能在多种组织培养细胞内增殖，如兔肾细胞和猪肾细胞等。PRV在这些细胞上可引起明显的细胞病变，细胞肿胀变圆，开始呈散在的灶状，随后逐渐扩展，直至全部细胞萎缩脱落，同时有大量多核巨细胞形成。但是，兔肾细胞和猪肾细胞等细胞系在我国使用已有数十年的历史，细胞的形态因使用代次过高已经发生明显的变化，再加上猪圆环病毒、支原体等外源性病原常常被引入这些细胞系中，导致这些传代细胞难以用于猪伪狂犬病病毒的分离和培养。而且一旦这些细胞渗入外源性病毒后，在培养过程中PRV的病毒滴度没有达到预定滴度时细胞就开始死亡脱落，导致PRV的病毒滴度始终不高。因此，迫切需要改进PRV的分离和培养方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种利用PIEC细胞分离和培养猪伪狂犬病病毒的方法，该方法培养的猪伪狂犬病病毒滴度较高，可以达到109.0TCID50/mL以上。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种分离和培养猪伪狂犬病病毒的方法，所述方法的步骤如下：
1)采集临床上诊断为疑似猪伪狂犬病病毒感染的猪病料，用含有抗生素的无菌DMEM液进行研磨，再反复冻融数次，然后4℃、8000～12000rpm离心5～30min，取上清液提取总DNA，然后进行PCR扩增，检测为PRV阳性的病料上清液用无菌滤器进行过滤除菌，得到滤清液备用；
2)用步骤1)获得的病料滤清液接种猪髋动脉传代细胞系，猪髋动脉传代细胞系以下简称PIEC，3天后，将接种病毒的PIEC细胞至-70℃反复冻融，然后低温离心，吸取上清液备用，所述上清液为第1代次上清液；
3)用步骤2)获得的病料第1代次上清液再次接种已经长成单层的PIEC细胞，3天后，将接种病毒的PIEC细胞至-70℃反复冻融，然后低温离心，吸取上清液备用，所述上清液为第2代次上清液；
4)用步骤3)获得的病料第2代次上清液再次接种已经长成单层的PIEC细胞，3天后，将接种病毒的PIEC细胞至-70℃反复冻融3次，然后低温离心，吸取上清液备用，所述上清液为第3代次上清液；
5)用步骤3)获得的病料第3代次上清液再次接种已经长成单层的PIEC细胞，3天后，将接毒的PIEC细胞至-70℃反复冻融3次，然后低温离心，吸取上清液备用，所述上清液为第4代次上清液；
6)用步骤5)获得的病料第4代次上清液再次接种新的已经长成单层的PIEC细胞，3天后，将接种病毒的PIEC细胞至-70℃反复冻融3次，然后低温离心，再吸取第5代次上清液接种新的单层PIEC细胞，如此类推，连续盲传5～10代次；
7)观察第5～10代次的细胞，如果细胞呈现明显的包括拉网、融合、聚堆、合胞体、变圆、脱落、死亡在内的细胞病变，则将该代次的上清液提取DNA，用检测猪伪狂犬病病毒的荧光PCR方法进行鉴定；
8)对步骤7)用荧光PCR方法检测为PRV阳性的该代次上清液，继续进行病毒的噬斑纯化试验；经3轮噬斑纯化后，挑选数个单独的病毒噬斑进行大量增殖，然后继续用检测猪伪狂犬病病毒的PCR方法或荧光PCR方法进行鉴定；
9)将经过步骤8)噬斑纯化的PRV病毒接种PIEC细胞继续进行增殖，待90％的PIEC细胞出现病变后，收获病毒，即将接种PRV病毒的PIEC细胞反复冻融3次，然后在4℃离心，10000rpm 5min，再吸取上清液做种毒；
10)将步骤9)收获的每一个病毒噬斑扩繁的PRV种毒进行连续10倍倍比稀释成0～9次10个稀释度，用PIEC细胞进行病毒的TCID50测定，其病毒滴度不低于109.0TCID50/mL。
进一步，所述步骤1)中所述的无菌DMEM含有氨苄青霉素钠和链霉素各2000IU，研磨时DMEM溶液体积与病料的重量比为5:1，研磨温度0～4℃；然后将研磨液置-70℃反复冻融3次；所述的无菌滤器0.22μm。
进一步，步骤8)所述的噬斑纯化具体包括如下步骤：
(1)将猪PIEC传代细胞系培养成单层细胞后，将步骤7)检测为PRV阳性的上清液进行连续10倍倍比稀释0～9次10个稀释度后，每个稀释度以0.01～0.2mL/cm2细胞的量接种单层PIEC细胞，摇匀后置37℃感作30min～2h；
(2)吸取步骤(1)感作后的病毒液，用PBS液洗涤2～3次后，将37℃含体积比2％胎牛血清的2×DMEM与55～60℃低熔点琼脂糖等量混合后，均匀铺于长成单层的PIEC细胞上，厚度为2～4mm，在37℃、5％CO2培养箱中培养；
(3)步骤(2)培养72h后挑选培养的单个噬斑。
本发明与现有技术相比的有益效果：
本发明创造性地利用PIEC分离和培养猪伪狂犬病病毒，在经过数轮噬斑纯化和增殖以后，PRV的病毒滴度可以达到108.5～109.0TCID50/mL，为猪伪狂犬病病毒疫苗的研制、生物学特异性研究、致病机制等奠定了基础和提供了技术支撑。
附图说明
图1所示PCR检测结果。其中，从左至右依次为：泳道M：DL2000DNA Marker，泳道1-4分别为：PCR阳性样品原液、10倍稀释液、100倍稀释液和1000倍稀释液目的条带(346bp)，泳道5-8阴性对照的扩增结果。
图2所示为正常无病变的PIEC细胞(×200)。
图3所示为猪伪狂犬病病毒在PIEC上的CPE(×200)。
图4所示为猪伪狂犬病病毒噬斑纯化图片。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下述实施例中涉及的试剂若无特别说明，均为市售获得。
实施例1猪伪狂犬病病毒SD2011-03株的分离和培养
1)病料采集：选取用PCR方法证明为猪伪狂犬病病毒阳性的发病猪的扁桃体、脾脏、淋巴结或脑干组织。2)病料处理：用5mL含有抗生素的无菌DMEM液研磨约1g左右的病料，研磨温度0～4℃；然后将研磨液置-70℃反复冻融3次，4℃离心10000rpm离心5分钟，取上清，弃去沉淀，取上清液进行总RNA的提取，进行RT-PCR扩增，阳性样品可以扩增得到一条大小为346bp的特异性条带，如图1所示。检测为阳性的病料上清液再用0.22μm的无菌滤器过滤除菌，制备上清液-70℃以下保存备用。
3)将步骤2)处理的猪伪狂犬病病毒阳性病料的上清液取1mL接种于已长成单层的PIEC细胞(T25细胞瓶)，37℃孵育1h，用灭菌PBS液洗涤后换成含有体积比2％新生牛血清的DMEM维持液7～10mL，逐日观察细胞病变(CPE)，连续观察2～3日。3天后，若无明显的CPE，将接毒的PIEC细胞至-70℃反复冻融3次，然后在4℃离心，10000rpm 5min，再吸取第1代上清液。
4)将步骤3)吸取上清液1mL接种于已长成单层的PIEC细胞(T25细胞瓶)，37℃孵育1h，用灭菌PBS液洗涤后换成含有2％新生牛血清的DMEM维持液7～10mL，逐日观察细胞病变(CPE)，连续观察2～3日，3天后，若无明显的CPE，如图2所示，将接毒的PIEC细胞至-70℃反复冻融3次，然后在4℃离心，10000rpm 5min，再吸取第2代上清液。如此连续盲传5～10代。
5)观察第5～10代次的细胞，如果细胞呈现明显的包括拉网、融合、聚堆、合胞体、变圆、脱落、死亡在内的细胞病变，如图3所示，则将该代次的上清液提取RNA，用检测猪伪狂犬病病毒的PCR方法进行鉴定；
6)对步骤5)用PCR方法检测为PRV阳性的该代次上清液，继续进行病毒的噬斑纯化试验；如图4所示，噬斑纯化的具体步骤如下：
(1)用6孔细胞板培养PIEC细胞成不低于90％的单层细胞，将收获的PRV病毒做10倍倍比稀释，稀释倍数分别为10～109，每孔接种不同稀释度的病毒0.5ml，摇匀后置37℃感作1h；
(2)吸弃病毒液，用灭菌PBS液2ml/孔，洗涤2～3次后，将37℃含体积比4％新生牛血清的2×DMEM与等体积浓度为4％(质量体积比)的60℃低熔点琼脂糖均匀混合后铺于已经长成单层的PIEC细胞上，厚度约为2～4mm，约2ml/孔，在37℃、5％CO2培养箱中培养，每5h观察一次，36～72h后挑选单个噬斑，接种于PIEC细胞上扩大培养。
7)将经过步骤6)噬斑纯化的PRV病毒接种PIEC细胞继续进行增殖，待90％的PIEC细胞出现病变后，收获病毒，即将接PRV的PIEC细胞至-70℃反复冻融3次，然后在4℃离心，10000rpm 5min，再吸取上清液做种毒。
10)将步骤9)收获的PRV种毒进行连续10倍倍比稀释成0～9次10个稀释度，用PIEC细胞进行病毒的TCID50测定。
11)经测定，选取的5个单独的病毒噬斑的效价为108.5～109.0TCID50/mL，远高于制造疫苗的标准105.0TCID50/mL。
实施例2猪伪狂犬病病毒的PCR鉴定
该方法在本发明中只作为推荐使用方法，不属于本发明的限定和保护范畴。
1)每一代次的上清液均需提取DNA，提取DNA的试剂盒均为市售产品，本发明对此不予以限定。
2)提好的DNA用针对猪伪狂犬病病毒的PCR方法进行鉴定，所用扩增试剂盒均为市售，所用引物为上游引物为F1：GCTCTGCGTGCTGTGCTCC；所用下游引物为R1：GGGTCCATTCGTCACTTCCG；二者扩增片段的大小为346bp，扩增体系为：2×Premix混合物12.5μL，上下游引物各位10pmol，模板2μL，补水至25μL。反应条件为：95℃2m，95℃20s，58℃30s℃，72℃30s，共35个循环，72℃7m，扩增产物用2％的琼脂糖电泳进行鉴定。
综上所述，本发明所提出的猪伪狂犬病毒的分离方法，简单方便，大大缩短病毒鉴定时间，既可以获得病毒含量、纯化水平高的病毒，也可以实现对隐形感染活体猪实现病毒的分离。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种分离和培养猪伪狂犬病病毒的方法，其特征在于所述方法的步骤如下：
1)采集临床上诊断为疑似猪伪狂犬病病毒感染的猪病料，用含有抗生素的无菌DMEM液进行研磨，再反复冻融数次，然后4℃、8000～12000rpm离心5～30min，取上清液提取总DNA，然后进行PCR扩增，检测为PRV阳性的病料上清液用无菌滤器进行过滤除菌，得到滤清液备用；
2)用步骤1)获得的病料滤清液接种猪髋动脉传代细胞系（PIEC），3天后，将接种病毒的PIEC细胞至-70℃反复冻融，然后低温离心，吸取上清液备用，所述上清液为第1代次上清液；
3)用步骤2)获得的病料第1代次上清液再次接种已经长成单层的PIEC细胞，3天后，将接种病毒的PIEC细胞至-70℃反复冻融，然后低温离心，吸取上清液备用，所述上清液为第２代次上清液；
4)用步骤3)获得的病料第2代次上清液再次接种已经长成单层的PIEC细胞，3天后，将接种病毒的PIEC细胞至-70℃反复冻融3次，然后低温离心，吸取上清液备用，所述上清液为第３代次上清液；
5)用步骤4)获得的病料第3代次上清液再次接种已经长成单层的PIEC细胞，3天后，将接毒的PIEC细胞至-70℃反复冻融3次，然后低温离心，吸取上清液备用，所述上清液为第４代次上清液；
6)用步骤5)获得的病料第4代次上清液再次接种新的已经长成单层的PIEC细胞，3天后，将接种病毒的PIEC细胞至-70℃反复冻融3次，然后低温离心，再吸取第5代次上清液接种新的单层PIEC细胞，如此类推，连续盲传5～10代次；
7)观察第5～10代次的细胞，如果细胞呈现明显的包括拉网、融合、聚堆、合胞体、变圆、脱落、死亡在内的细胞病变，则将该代次的上清液提取DNA，用检测猪伪狂犬病病毒的荧光PCR方法进行鉴定；
8) 对步骤7）用荧光PCR方法检测为PRV阳性的该代次上清液，继续进行病毒的噬斑纯化试验；经3轮噬斑纯化后，挑选数个单独的病毒噬斑进行大量增殖，然后继续用检测猪伪狂犬病病毒的PCR方法进行鉴定；
所述的噬斑纯化具体包括如下步骤：
（1）将猪PIEC传代细胞系培养成单层细胞后，将步骤7）检测为PRV阳性的上清液进行连续10倍倍比稀释0～9次10个稀释度后，每个稀释度以0.01～0.2mL/cm2细胞的量接种单层PIEC细胞，摇匀后置37℃感作30min～2h；
（2）吸弃步骤（1）感作后的病毒液，用PBS液洗涤2～3次/孔后，将37℃含体积比2％胎牛血清的2×DMEM与55～60℃低熔点琼脂糖等量混合后，均匀铺于长成单层的PIEC细胞上，厚度为2～4mm，在37℃、5％CO2培养箱中培养；
（3） 步骤（２）培养72h后挑选培养的单个噬斑；
9）将经过步骤8）噬斑纯化的PRV病毒接种PIEC细胞继续进行增殖，待90%的PIEC细胞出现病变后，收获病毒，即将接种PRV病毒的PIEC细胞反复冻融3次，然后在4℃离心，10000rpm5min，再吸取上清液做种毒；
10）将步骤9）收获的每一个病毒噬斑扩繁的PRV种毒进行连续10倍倍比稀释成0～9次10个稀释度，用PIEC细胞进行病毒的TCID50测定，其病毒滴度不低于109.0TCID50/mL。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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