CN110283793A - 一种分离和培养猪伪狂犬病病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用PIEC细胞分离和培养猪伪狂犬病病毒的方法,属于兽医生物技术领域,所述方法利用PIEC分离和培养猪伪狂犬病病毒,在经过数轮噬斑纯化和增殖以后,PRV的病毒滴度可以达到108.5~109.0TCID50/mL。为猪伪狂犬病病毒疫苗的研制、生物学特异性研究、致病机制等奠定了基础和提供了技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于兽医生物技术领域,具体涉及一种分离和培养猪伪狂犬病病毒的方法。
背景技术
伪狂犬病病毒(PRV)是引起牛、羊、猪、犬和猫等多种家畜和野生动物发热、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要症状的疱疹病毒。猪伪狂犬病病毒又称猪疱疹病毒Ⅰ型、传染性延髓麻痹病毒、奇痒症病毒、奥叶兹基氏病病毒。由于本病的临床症状类似狂犬病,故用了“伪狂犬病”这一病名。猪伪狂犬病病毒可引起妊娠母猪流产、死胎,公猪不育,新生仔猪大量死亡,育肥猪呼吸困难、生长停滞等,是危害全球养猪业的重大传染病之一。PRV为双链DNA病毒,基因组大小为150kb左右,病毒粒子为圆形,直径150~180nm,核衣壳直径为105~110nm。PRV具有广泛的组织嗜性,能在多种组织培养细胞内增殖,如兔肾细胞和猪肾细胞等。PRV在这些细胞上可引起明显的细胞病变,细胞肿胀变圆,开始呈散在的灶状,随后逐渐扩展,直至全部细胞萎缩脱落,同时有大量多核巨细胞形成。但是,兔肾细胞和猪肾细胞等细胞系在我国使用已有数十年的历史,细胞的形态因使用代次过高已经发生明显的变化,再加上猪圆环病毒、支原体等外源性病原常常被引入这些细胞系中,导致这些传代细胞难以用于猪伪狂犬病病毒的分离和培养。而且一旦这些细胞渗入外源性病毒后,在培养过程中PRV的病毒滴度没有达到预定滴度时细胞就开始死亡脱落,导致PRV的病毒滴度始终不高。因此,迫切需要改进PRV的分离和培养方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种利用PIEC细胞分离和培养猪伪狂犬病病毒的方法,该方法培养的猪伪狂犬病病毒滴度较高,可以达到109.0TCID50/mL以上。
本发明是通过如下技术方案来实现的:
一种分离和培养猪伪狂犬病病毒的方法,所述方法的步骤如下:
1)采集临床上诊断为疑似猪伪狂犬病病毒感染的猪病料,用含有抗生素的无菌DMEM液进行研磨,再反复冻融数次,然后4℃、8000~12000rpm离心5~30min,取上清液提取总DNA,然后进行PCR扩增,检测为PRV阳性的病料上清液用无菌滤器进行过滤除菌,得到滤清液备用;
2)用步骤1)获得的病料滤清液接种猪髋动脉传代细胞系,猪髋动脉传代细胞系以下简称PIEC,3天后,将接种病毒的PIEC细胞至-70℃反复冻融,然后低温离心,吸取上清液备用,所述上清液为第1代次上清液;
3)用步骤2)获得的病料第1代次上清液再次接种已经长成单层的PIEC细胞,3天后,将接种病毒的PIEC细胞至-70℃反复冻融,然后低温离心,吸取上清液备用,所述上清液为第2代次上清液;
4)用步骤3)获得的病料第2代次上清液再次接种已经长成单层的PIEC细胞,3天后,将接种病毒的PIEC细胞至-70℃反复冻融3次,然后低温离心,吸取上清液备用,所述上清液为第3代次上清液;
5)用步骤3)获得的病料第3代次上清液再次接种已经长成单层的PIEC细胞,3天后,将接毒的PIEC细胞至-70℃反复冻融3次,然后低温离心,吸取上清液备用,所述上清液为第4代次上清液;
6)用步骤5)获得的病料第4代次上清液再次接种新的已经长成单层的PIEC细胞,3天后,将接种病毒的PIEC细胞至-70℃反复冻融3次,然后低温离心,再吸取第5代次上清液接种新的单层PIEC细胞,如此类推,连续盲传5~10代次;
7)观察第5~10代次的细胞,如果细胞呈现明显的包括拉网、融合、聚堆、合胞体、变圆、脱落、死亡在内的细胞病变,则将该代次的上清液提取DNA,用检测猪伪狂犬病病毒的荧光PCR方法进行鉴定;
8)对步骤7)用荧光PCR方法检测为PRV阳性的该代次上清液,继续进行病毒的噬斑纯化试验;经3轮噬斑纯化后,挑选数个单独的病毒噬斑进行大量增殖,然后继续用检测猪伪狂犬病病毒的PCR方法或荧光PCR方法进行鉴定;
9)将经过步骤8)噬斑纯化的PRV病毒接种PIEC细胞继续进行增殖,待90%的PIEC细胞出现病变后,收获病毒,即将接种PRV病毒的PIEC细胞反复冻融3次,然后在4℃离心,10000rpm 5min,再吸取上清液做种毒;
10)将步骤9)收获的每一个病毒噬斑扩繁的PRV种毒进行连续10倍倍比稀释成0~9次10个稀释度,用PIEC细胞进行病毒的TCID50测定,其病毒滴度不低于109.0TCID50/mL。
进一步,所述步骤1)中所述的无菌DMEM含有氨苄青霉素钠和链霉素各2000IU,研磨时DMEM溶液体积与病料的重量比为5:1,研磨温度0~4℃;然后将研磨液置-70℃反复冻融3次;所述的无菌滤器0.22μm。
进一步,步骤8)所述的噬斑纯化具体包括如下步骤:
(1)将猪PIEC传代细胞系培养成单层细胞后,将步骤7)检测为PRV阳性的上清液进行连续10倍倍比稀释0~9次10个稀释度后,每个稀释度以0.01~0.2mL/cm2细胞的量接种单层PIEC细胞,摇匀后置37℃感作30min~2h;
(2)吸取步骤(1)感作后的病毒液,用PBS液洗涤2~3次后,将37℃含体积比2%胎牛血清的2×DMEM与55~60℃低熔点琼脂糖等量混合后,均匀铺于长成单层的PIEC细胞上,厚度为2~4mm,在37℃、5%CO2培养箱中培养;
(3)步骤(2)培养72h后挑选培养的单个噬斑。
本发明与现有技术相比的有益效果:
本发明创造性地利用PIEC分离和培养猪伪狂犬病病毒,在经过数轮噬斑纯化和增殖以后,PRV的病毒滴度可以达到108.5~109.0TCID50/mL,为猪伪狂犬病病毒疫苗的研制、生物学特异性研究、致病机制等奠定了基础和提供了技术支撑。
附图说明
图1所示PCR检测结果。其中,从左至右依次为:泳道M:DL2000DNA Marker,泳道1-4分别为:PCR阳性样品原液、10倍稀释液、100倍稀释液和1000倍稀释液目的条带(346bp),泳道5-8阴性对照的扩增结果。
图2所示为正常无病变的PIEC细胞(×200)。
图3所示为猪伪狂犬病病毒在PIEC上的CPE(×200)。
图4所示为猪伪狂犬病病毒噬斑纯化图片。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。下述实施例中涉及的试剂若无特别说明,均为市售获得。
实施例1猪伪狂犬病病毒SD2011-03株的分离和培养
1)病料采集:选取用PCR方法证明为猪伪狂犬病病毒阳性的发病猪的扁桃体、脾脏、淋巴结或脑干组织。2)病料处理:用5mL含有抗生素的无菌DMEM液研磨约1g左右的病料,研磨温度0~4℃;然后将研磨液置-70℃反复冻融3次,4℃离心10000rpm离心5分钟,取上清,弃去沉淀,取上清液进行总RNA的提取,进行RT-PCR扩增,阳性样品可以扩增得到一条大小为346bp的特异性条带,如图1所示。检测为阳性的病料上清液再用0.22μm的无菌滤器过滤除菌,制备上清液-70℃以下保存备用。
3)将步骤2)处理的猪伪狂犬病病毒阳性病料的上清液取1mL接种于已长成单层的PIEC细胞(T25细胞瓶),37℃孵育1h,用灭菌PBS液洗涤后换成含有体积比2%新生牛血清的DMEM维持液7~10mL,逐日观察细胞病变(CPE),连续观察2~3日。3天后,若无明显的CPE,将接毒的PIEC细胞至-70℃反复冻融3次,然后在4℃离心,10000rpm 5min,再吸取第1代上清液。
4)将步骤3)吸取上清液1mL接种于已长成单层的PIEC细胞(T25细胞瓶),37℃孵育1h,用灭菌PBS液洗涤后换成含有2%新生牛血清的DMEM维持液7~10mL,逐日观察细胞病变(CPE),连续观察2~3日,3天后,若无明显的CPE,如图2所示,将接毒的PIEC细胞至-70℃反复冻融3次,然后在4℃离心,10000rpm 5min,再吸取第2代上清液。如此连续盲传5~10代。
5)观察第5~10代次的细胞,如果细胞呈现明显的包括拉网、融合、聚堆、合胞体、变圆、脱落、死亡在内的细胞病变,如图3所示,则将该代次的上清液提取RNA,用检测猪伪狂犬病病毒的PCR方法进行鉴定;
6)对步骤5)用PCR方法检测为PRV阳性的该代次上清液,继续进行病毒的噬斑纯化试验;如图4所示,噬斑纯化的具体步骤如下:
(1)用6孔细胞板培养PIEC细胞成不低于90%的单层细胞,将收获的PRV病毒做10倍倍比稀释,稀释倍数分别为10~109,每孔接种不同稀释度的病毒0.5ml,摇匀后置37℃感作1h;
(2)吸弃病毒液,用灭菌PBS液2ml/孔,洗涤2~3次后,将37℃含体积比4%新生牛血清的2×DMEM与等体积浓度为4%(质量体积比)的60℃低熔点琼脂糖均匀混合后铺于已经长成单层的PIEC细胞上,厚度约为2~4mm,约2ml/孔,在37℃、5%CO2培养箱中培养,每5h观察一次,36~72h后挑选单个噬斑,接种于PIEC细胞上扩大培养。
7)将经过步骤6)噬斑纯化的PRV病毒接种PIEC细胞继续进行增殖,待90%的PIEC细胞出现病变后,收获病毒,即将接PRV的PIEC细胞至-70℃反复冻融3次,然后在4℃离心,10000rpm 5min,再吸取上清液做种毒。
10)将步骤9)收获的PRV种毒进行连续10倍倍比稀释成0~9次10个稀释度,用PIEC细胞进行病毒的TCID50测定。
11)经测定,选取的5个单独的病毒噬斑的效价为108.5~109.0TCID50/mL,远高于制造疫苗的标准105.0TCID50/mL。
实施例2猪伪狂犬病病毒的PCR鉴定
该方法在本发明中只作为推荐使用方法,不属于本发明的限定和保护范畴。
1)每一代次的上清液均需提取DNA,提取DNA的试剂盒均为市售产品,本发明对此不予以限定。
2)提好的DNA用针对猪伪狂犬病病毒的PCR方法进行鉴定,所用扩增试剂盒均为市售,所用引物为上游引物为F1:GCTCTGCGTGCTGTGCTCC;所用下游引物为R1:GGGTCCATTCGTCACTTCCG;二者扩增片段的大小为346bp,扩增体系为:2×Premix混合物12.5μL,上下游引物各位10pmol,模板2μL,补水至25μL。反应条件为:95℃2m,95℃20s,58℃30s℃,72℃30s,共35个循环,72℃7m,扩增产物用2%的琼脂糖电泳进行鉴定。
综上所述,本发明所提出的猪伪狂犬病毒的分离方法,简单方便,大大缩短病毒鉴定时间,既可以获得病毒含量、纯化水平高的病毒,也可以实现对隐形感染活体猪实现病毒的分离。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种分离和培养猪伪狂犬病病毒的方法,其特征所述方法的步骤如下:
1)采集临床上诊断为疑似猪伪狂犬病病毒感染的猪病料,用含有抗生素的无菌DMEM液进行研磨,再反复冻融数次,然后4℃、8000~12000rpm离心5~30min,取上清液提取总DNA,然后进行PCR扩增,检测为PRV阳性的病料上清液用无菌滤器进行过滤除菌,得到滤清液备用;
2)用步骤1)获得的病料滤清液接种猪髋动脉传代细胞系,猪髋动脉传代细胞系以下简称PIEC,3天后,将接种病毒的PIEC细胞至-70℃反复冻融,然后低温离心,吸取上清液备用,所述上清液为第1代次上清液;
3)用步骤2)获得的病料第1代次上清液再次接种已经长成单层的PIEC细胞,3天后,将接种病毒的PIEC细胞至-70℃反复冻融,然后低温离心,吸取上清液备用,所述上清液为第2代次上清液;
4)用步骤3)获得的病料第2代次上清液再次接种已经长成单层的PIEC细胞,3天后,将接种病毒的PIEC细胞至-70℃反复冻融3次,然后低温离心,吸取上清液备用,所述上清液为第3代次上清液;
5)用步骤3)获得的病料第3代次上清液再次接种已经长成单层的PIEC细胞,3天后,将接毒的PIEC细胞至-70℃反复冻融3次,然后低温离心,吸取上清液备用,所述上清液为第4代次上清液;
6)用步骤5)获得的病料第4代次上清液再次接种新的已经长成单层的PIEC细胞,3天后,将接种病毒的PIEC细胞至-70℃反复冻融3次,然后低温离心,再吸取第5代次上清液接种新的单层PIEC细胞,如此类推,连续盲传5~10代次;
7)观察第5~10代次的细胞,如果细胞呈现明显的包括拉网、融合、聚堆、合胞体、变圆、脱落、死亡在内的细胞病变,则将该代次的上清液提取DNA,用检测猪伪狂犬病病毒的荧光PCR方法进行鉴定;
8)对步骤7)用荧光PCR方法检测为PRV阳性的该代次上清液,继续进行病毒的噬斑纯化试验;经3轮噬斑纯化后,挑选数个单独的病毒噬斑进行大量增殖,然后继续用检测猪伪狂犬病病毒的PCR方法或荧光PCR方法进行鉴定;
9)将经过步骤8)噬斑纯化的PRV病毒接种PIEC细胞继续进行增殖,待90%的PIEC细胞出现病变后,收获病毒,即将接种PRV病毒的PIEC细胞反复冻融3次,然后在4℃离心,10000rpm5min,再吸取上清液做种毒;
10)将步骤9)收获的每一个病毒噬斑扩繁的PRV种毒进行连续10倍倍比稀释成0~9次10个稀释度,用PIEC细胞进行病毒的TCID50测定,其病毒滴度不低于109.0TCID50/mL。
2.根据权利要求1所述的一种分离和培养猪伪狂犬病病毒的方法,其特征在于所述步骤1)中所述的无菌DMEM含有氨苄青霉素钠和链霉素各2000IU,研磨时DMEM溶液体积与病料的重量比为5:1,研磨温度0~4℃;然后将研磨液置-70℃反复冻融3次;所述的无菌滤器0.22μm。
3.根据权利要求1所述的一种分离和培养猪伪狂犬病病毒的方法,其特征在于步骤8)所述的噬斑纯化具体包括如下步骤:
(1)将猪PIEC传代细胞系培养成单层细胞后,将步骤7)检测为PRV阳性的上清液进行连续10倍倍比稀释0~9次10个稀释度后,每个稀释度以0.01~0.2mL/cm2细胞的量接种单层PIEC细胞,摇匀后置37℃感作30min~2h;
(2)吸取步骤(1)感作后的病毒液,用PBS液洗涤2~3次后,将37℃含体积比2%胎牛血清的2×DMEM与55~60℃低熔点琼脂糖等量混合后,均匀铺于长成单层的PIEC细胞上,厚度为2~4mm,在37℃、5%CO2培养箱中培养;
(3)步骤(2)培养72h后挑选培养的单个噬斑。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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