CN112481223A - 猪流行性腹泻病毒伪狂犬病病毒载体重组病毒、制备方法及其应用 - Google Patents

猪流行性腹泻病毒伪狂犬病病毒载体重组病毒、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供猪流行性腹泻病毒伪狂犬病病毒载体重组病毒、制备方法及其应用，属于动物医学的疫苗领域。猪流行性腹泻病毒伪狂犬病病毒载体重组病毒，是在伪狂犬病病毒基因组中UL40与UL41之间非编码区插入PEDV S蛋白基因表达盒后得到。本发明还提供所述猪流行性腹泻病毒伪狂犬病病毒载体重组病毒在活疫苗中的应用。本发明还提供所述猪流行性腹泻病毒伪狂犬病病毒载体重组病毒为活性成分的疫苗。将rPRV‑S（PEDV）‑UL40株免疫仔猪通过对PEDV抗体进行监测，可以检测到仔猪体内有PRV、PEDV中和抗体产生，非常有利于对PRV变异株及PEDV变异株的净化。

Description

猪流行性腹泻病毒伪狂犬病病毒载体重组病毒、制备方法及 其应用
技术领域
本发明属于动物医学的疫苗领域，具体涉及猪流行性腹泻病毒重组伪狂犬病病毒及其应用。
背景技术
伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起的多种哺乳动物均会发生的共患病。牛、羊、狐狸、水貂、犬和猫等发生伪狂犬病时常表现为奇痒和狂躁或抑郁等典型神经症状，患病动物死亡率极高。猪是伪狂犬病病毒的贮存宿主，通常仔猪发病后死亡率高，大猪感染后一般不发生死亡，但可长期带毒和排毒。新生仔猪呈典型神经症状，随着日龄增长，症状逐步减轻。育成猪和肥猪主要是呼吸道症状，感染伪狂犬病病毒后生长停滞，通常不发生死亡。母猪常发生流产或产死胎、弱仔和木乃伊胎等，种公猪发生睾丸炎等症状。疫苗免疫可以有效保护易感猪，基因缺失疫苗和与其配套的鉴别诊断技术推动了PRV野毒株在猪场中的净化。然而，自2011年以来，一种毒力更高的PRV变异株在我国许多猪场再次流行，该变异株传播力强，且致病力较传统毒株显著增强，能引起大猪发病和死亡，原有疫苗对此变异株保护效力不足，造成严重损失。应用变异株，采用人工基因缺失或传代致弱研制同源性疫苗能提供完全保护，将对我国猪伪狂犬病防控发挥关键作用。
猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(Procine epidemic diarrheavirus，PEDV)引起仔猪呕吐、腹泻和脱水等一系列症状的急性、高度接触性肠道传染病，对新生仔猪的致死率极高。2010年新一轮PED疫情于包括我国在内的多个国家暴发，对2周龄以内的仔猪危害尤为严重，其发病率和死亡率甚至高达90～100％。2013年，PED在美国首次暴发并迅速蔓延到全美，新的疫情给世界养猪业造成了巨大的经济损失，研究发现美国暴发的PEDV流行毒株基因序列与我国流行毒株基因序列高度相似，目前我国的PEDV流行毒株与我国长期使用的CV777疫苗株在基因水平上具有一定差异，其中S基因差异较大，特别是S蛋白N段区域高度变异。S基因编码的S蛋白作为病毒主要的结构蛋白，位于病毒粒子的表面，通过与细胞表面受体结合后侵入细胞，并介导感染宿主体内中和抗体的产生，因此，S蛋白可以作为疫苗研发的首要靶向蛋白。研发针对PEDV中国流行毒株的新型疫苗对于有效防控PED的流行具有重要意义。
现有技术中缺乏能够有效预防伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒的疫苗。
发明内容
本发明的目的是提供猪流行性腹泻病毒伪狂犬病病毒载体重组病毒，可以同时预防伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒感染。
本发明的另一目的是提供猪流行性腹泻病毒伪狂犬病病毒载体重组病毒在活疫苗中的应用。
本发明的再一目的是提供以所述猪流行性腹泻病毒伪狂犬病病毒载体重组病毒为活性成分的疫苗。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
猪流行性腹泻病毒伪狂犬病病毒载体重组病毒，是在伪狂犬病病毒基因组中UL40与UL41之间非编码区插入PEDV S蛋白基因表达盒后得到。
本发明还提供所述猪流行性腹泻病毒伪狂犬病病毒载体重组病毒在活疫苗中的应用。
本发明还提供所述猪流行性腹泻病毒伪狂犬病病毒载体重组病毒为活性成分的疫苗。
在本发明中，猪流行性腹泻病毒伪狂犬病病毒载体重组病毒的病毒液采用如下方法制备：将猪流行性腹泻病毒伪狂犬病病毒载体重组病毒接种ST细胞，采用含有胎牛血清的DMEM培养基培养36～48小时，收获病毒培养物，冻融后离心取上清液作为病毒液。
在本发明中，所述疫苗为活疫苗。
本发明还提供重组载体活疫苗，其活性成份是在伪狂犬病病毒基因组中UL40与UL41之间非编码区插入了外源基因表达盒后得到；所述外源基因包括非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪圆环病毒、狂犬病病毒、口蹄疫病毒、兔瘟病毒和犬瘟热病毒的保护性抗原基因。
申请人通过大量富有创造性的劳动，发现了PRV基因组中UL40与UL41之间非编码区可以作为外源基因插入位点。通过在该位点插入PEDV S蛋白基因表达盒，获得了一株猪流行性腹泻病毒伪狂犬病病毒载体重组病毒rPRV-S(PEDV)-UL40株。猪流行性腹泻病毒重组伪狂犬病病毒rPRV-S(PEDV)-UL40株gC和gD基因与AH02LA株完全一致(gC基因GenBank:KR605320；gD基因GenBank:KR605321)，均与现公开变异毒株高度同源。本发明猪流行性腹泻病毒伪狂犬病病毒载体重组病毒rPRV-S(PEDV)-UL40株是首先通过将S(PEDV)基因表达盒插入AH02LA株UL40与UL41之间非编码区进行重组，随后进行共转染将mini-F替换拯救gI基因而得。将rPRV-S(PEDV)-UL40株免疫仔猪通过对PEDV抗体进行监测，可以检测到仔猪体内有PRV、PEDV中和抗体产生，非常有利于对PRV变异株及PEDV变异株的净化。猪流行性腹泻病毒伪狂犬病病毒载体重组病毒rPRV-S(PEDV)-UL40株能够很好地适应ST细胞，生长滴度高达107.67TCID50/mL。rPRV-S(PEDV)-UL40株接种断奶PRV、PEDV阴性猪后能快速产生高效保护力，可同时预防PRV变异株和PEDV变异株感染，取得了意想不到的效果。将猪流行性腹泻病毒伪狂犬病病毒载体重组病毒用作活载体再表达其他病原的保护性抗原，还能达到接种一针防三种或更多种疫病的效果。
附图说明
图1、pPRV-S-mini-F BAC及pPRV△TK/gE/gI RFLP图。
图2、rPRV-S(PEDV)-UL40株病毒拯救图。
图3、rPRV-S(PEDV)-UL40株间接免疫荧光图。
图4、rPRV-S(PEDV)-UL40株抗体图。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步说明本发明，但本发明的范围和精神并不限于所列实施例。
实施例一、猪流行性腹泻病毒伪狂犬病病毒载体重组病毒的获得与鉴定
1、猪流行性腹泻病毒S基因表达盒的制备
1.1猪流行性腹泻病毒(PEDV)原料收集。
取猪流行性腹泻病病死猪小肠组织病料，研磨后提取组织中病毒RNA。
1.2提取病毒RNA。
(1)按RNAperp pure Tissue Kit RNAperp pure动物组织总RNA提取试剂盒说明书提取病毒RNA，操作如下：
(2)匀浆处理。每10-20mg组织加300μl裂解液RL(使用前加入β-巯基乙醇)，用研磨杵将组织彻底研磨(如组织较难彻底研磨，可选用电动或玻璃匀浆器)；随后向匀浆液中加入590μl RNase-Free ddH2O和10μl Proteinase K，混匀后56℃处理10-20min。(注意：组织量一定不要超过20mg，否则将导致RNA得率和质量下降。)
(3)12,000rpm～13,400×g离心2-5min，取上清进行以下操作。
(4)缓慢加入0.5倍上清体积无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12,000rpm～13,400×g离心30-60sec，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
(5)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1,12000rpm～13,400×g离心30-60sec，弃废液，将吸附柱放收集管中。
(6)DNase|工作液的配制：取10μl DNase|储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μlRDD溶液，轻柔混匀。
(7)向吸附柱CR3中央加入80μl的DNase|工作液，室温放置15min。
(8)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm～13,400×g离心30-60sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
(9)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW(使用前加入乙醇)，室温静置2min，12,000rpm～13,400×g离心30-60sec，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中。重复该步骤一次。
(10)12,000rpm～13,400×g离心2min，倒掉废液，将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附柱材料中残余的漂洗液。(此步骤的目的是将吸附柱CR3中残余的漂洗液去除，漂洗液的残留，可能会影响后续的RT等实验。)
(11)将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μlRNase-Free ddH2O，室温放置2min，12000rpm～13,400×g离心2min，得到RNA溶液。
(12)将收集到的病毒RNA分装，-70℃保存。
取2μl病毒液做模板,按照反转录试剂盒说明书进行反转录,反应体系为：
表1 10μl PCR反应体系
样品 体积
5×PrimeScript Buffer 2μl
PrimeScript RT Enzyme Mix| 0.5μl
Oligo dT Primer(50μM) 0.5μl
模板DNA 2μl
RNase Free H<sub>2</sub>O 5μl
总体积 10μl
反应条件为：37℃反应15min,85℃反应5s。cDNA模板置-20℃备用。
1.3 PEDV S基因扩增
以1.2中合成的cDNA为模板，设计PEDV S基因扩增引物，进行PEDV S基因扩增。反应体系如下：
表2 25μl PCR反应体系
样品 体积
10×Ex Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>free) 1.5μl
MgCl<sub>2</sub> 2μl
dNTP Mixture 2μl
上游引物 1μl
下游引物 1μl
cDNA 2μl
Taq DNA聚合酶 0.4μl
ddH<sub>2</sub>O 14.1μl
总体积 25μl
扩增PEDV S基因的反应程序为：95℃5min,94℃30s，54℃30s，72℃50s共30个循环,72℃8min。取10μL PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳后凝胶成像系统观察结果。
1.4 PEDV S基因T-A克隆
1.4.1 PEDV S基因PCR产物胶回收
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，使用小量胶回收试剂盒回收目的条带,方法如下:
(1)吸附柱平衡处理。向吸附柱中加入200μl Buffer CBS,12000r/min,离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(2)观察分析电泳结果,切取含有目的DNA条带的凝胶。根据凝胶质量,按每100mg1％琼脂凝胶加入的100μl的Binding Solution。
(3)于50～60℃水浴5～10min，期间每2～3min间断轻微摇晃，颠倒晃匀，直至胶块完全融化。
(4)将上述混合液转移至套有2ml收集管的吸附柱中，室温放置2min，6000r/min室温离心1min，取出吸附柱，并倒掉收集管中废液。
(5)将吸附柱重新放回收集管中，加入500μl WA Solution，12000r/min室温离心1min，倒掉收集管中废液。
(6)将吸附柱重新放回收集管中，加入500μl Wash Solution，12000r/min室温离心1min，倒掉收集管中废液。重复此步骤一次。
(7)将吸附柱重新放回收集管中，12000r/min室温离心1min，打开吸附柱的盖子，室温放置5～10min/50℃放置3～5min，以彻底去除Wash Solution。
(8)将吸附柱放入干净的1.5ml收集管中，悬空加入30～50μl H2O，盖上吸附柱盖子，37℃放置2min，12000r/min室温离心1min。
(9)弃去吸附柱，离心管中的液体即为包含目的DNA片段的溶液。
(10)取5μl回收产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统下观察电泳条带亮度，检测回收效果。
1.4.2 PEDV S基因与T载体的连接
将PEDV S基因PCR产物用胶回收试剂盒回收纯化，回收片段与pMD19-T Simple载体连接，体系如下：
表3 10μl PCR反应体系
总体积 10μl
PEDV S基因胶回收产物 4.5μl
pMD19-T simple Vector 0.5μl
Solution| 5μl
反应物程序：16℃连接过夜，取10μl连接产物转化GS1783感受态细胞，将转化产物涂布CAM、KAN LB琼脂平板，32℃培养24h后观察结果。
1.4.3 PEDV S基因鉴定
挑取KAN LB平板划线生长的单菌落，提取DNA进行S基因PCR鉴定。DNA提取过程如下：
挑取KAN LB平板划线生长的单菌落，接种于5ml灭菌KAN LB液体培养基中，32℃220r/min振荡培养过夜。
吸取1ml过夜培养菌液于EP管，4℃12000r/min离心2min。
弃上清，加300μP1 Solution重悬沉淀。
加300μl P2 Solution轻晃摇匀至管口出现“拉丝状”现象。
加300μl P3 Solution中和P2 Solution，轻摇晃匀产生白色絮状沉淀。4℃12000r/min离心10min。
取上清于EP管，加900μl DNA提取液，4℃12000r/min离心10min.。重复此步骤一次。
取上清于EP管，加900μl无水乙醇，4℃12000r/min离心30min。
弃上清，加500μl 75％乙醇，4℃12000r/min离心5min。
弃上清，待乙醇挥发后，悬空滴加50μl ddH2O，所得溶液即含DNA。
鉴定S基因PCR体系如下：
表4 25μl PCR反应体系
样品 体积
Prime star Mix 12μl
上游引物S F 1μl
下游引物S R 1μl
模板DNA 1μl
ddH<sub>2</sub>O 10μl
2、猪流行性腹泻病毒重组伪狂犬病病毒BAC的获得与鉴定
应用引物PRV inser UL40 En Pa F/PRV inser UL40 En Pa R，以S-T-KAN DNA为模板，进行PCR扩增(PCR反应体系如下，表5)，扩增内部插入了卡那霉素抗性基因的PEDV变异株S基因片段，该片段两端分别带有PRV插入位点上游和下游40bp的同源序列。
表5 50μl PCR反应体系
样品 体积
Prime star Max 25μl
上游引物PRV inser UL40En Pa F 2μl
下游引物PRV inser UL40En Pa R 2μl
模板DNA 1μl
ddH<sub>2</sub>O 20μl
反应程序为：94℃3min,94℃30s，65℃30s，72℃7min共30个循环,72℃10min。取10μL PCR产物加入6×loading Buffer于1％琼脂糖凝胶电泳后凝胶成像系统观察结果。
2.1UL40两端同源臂片段胶回收
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，使用小量胶回收试剂盒回收目的条带，方法如下:
吸附柱平衡处理。向吸附柱中加入200μl Buffer CBS，12000r/min，离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中。
观察分析电泳结果，切取含有目的DNA条带的凝胶。根据凝胶质量,按每100mg 1％琼脂凝胶加入的100μl的Binding Solution。
于50～60℃水浴5～10min，期间每2～3min间断轻微摇晃，颠倒晃匀，直至胶块完全融化。
将上述混合液转移至套有2ml收集管的吸附柱中，室温放置2min，6000r/min室温离心1min，取出吸附柱，并倒掉收集管中废液。
将吸附柱重新放回收集管中，加入500μl WA Solution，12000r/min室温离心1min，倒掉收集管中废液。
将吸附柱重新放回收集管中，加入500μl Wash Solution，12000r/min室温离心1min，倒掉收集管中废液。重复此步骤一次。
将吸附柱重新放回收集管中，12000r/min室温离心1min，打开吸附柱的盖子，室温放置5～10min/50℃放置3～5min，以彻底取出Wash Solution。
将吸附柱放入干净的1.5ml收集管中，悬空加入30～50μl H2O，盖上吸附柱盖子，37℃放置2min，12000r/min室温离心1min。
弃去吸附柱，离心管中的液体即为包含目的DNA片段的溶液。
取5μl回收产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统下观察电泳条带亮度，检测回收效果。
2.2转化感受态细胞
2.2.1 GS1783感受态细胞的制备
PCR片段经回收和Dpn I酶切后电转入含pPRV-AH02LA的GS1783的感受态细胞进行第一轮同源重组，将内部插入了卡那霉素抗性基因的PEDV变异株S基因片段插入到PRV基因组的UL40非编码区。其制备过程如下：
-80℃冰箱中取含pPRV-AH02LA的GS1783甘油菌划线CAM LB琼脂平板中过夜培养。挑取LB平板划线生长的GS1783单菌落，接种于5ml灭菌含有0.1％CAM的LB液体培养基中，32℃220r/min振荡培养至对数生长期。
按1:100比例吸取1ml活化菌液至100ml含有0.1％CAM的LB液体培养基中，32℃220r/min振荡摇菌扩大培养2-4h，至OD值为0.5～0.7。
放入42℃220r/min摇菌激活菌中重组酶，15min后立刻对菌冰浴30min保持酶活性。
将菌倒入预冷好的50ml离心杯中，4℃5000r/min，离心10min。
弃去上清，加预冷好的10％甘油40ml重悬沉淀，5000r/min，离心10min。
弃去上清，加预冷好的10％甘油40ml洗涤，摇晃均匀，5000r/min，离心10min。重复此步骤2次。
弃去上清后将离心杯中残留液体摇晃后吸出，吸入冷冻过的EP管，4℃，5000r/min，离心5min。
用冷冻过的枪头吸出上清将菌液留至100μl左右，-20℃取出胶回收片段DNA加至EP管，轻弹混匀，放置冰盒10min。
加入预冷1mm电转化杯，1500V 200Ω条件电转。
电转后迅速加入提前准备的1ml LB EP管中，置于32℃220r/min摇菌。
1h后取出EP管，5000r/min，离心3min，弃上清留至100μl左右，重悬沉淀，加至含有0.1％CAM、KAN的LB琼脂平板，涂布棒涂布。
放入32℃温箱中培养，24h后观察结果。
接着将内部插入了卡那霉素抗性基因的PEDV变异株S基因片段内部进行第二轮重组，敲除卡那霉素抗性基因，筛选出的阳性单克隆，命名为BAC pPRV-S-mini-F。阳性单克隆经BamH I酶切后进行RFLP图谱分析。插入后的S基因进行PCR(PCR体系如下，表6)和测序鉴定。
表6 25μl PCR反应体系
样品 体积
2×Hieff PCR Master Mix 12μl
上游引物S F 1μl
下游引物S R 1μl
模板DNA 1μl
ddH<sub>2</sub>O 10μl
反应程序为：94℃3min,94℃30s，50℃30s，72℃1min30s共30个循环,72℃10min。取10μL PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳后凝胶成像系统观察结果。
3、猪流行性腹泻病毒重组伪狂犬病病毒拯救与鉴定
以PRV LA-A株的DNA为模板，应用引物PRV gE flanking F和gE flanking R进行PCR扩增(PCR体系如下，表5，获得LA-A株ΔgE和gI基因片段，将回收的扩增片段与BACpPRV-S-mini-F的DNA共转染ST细胞，在拯救病毒的同时，将BAC中的mini-F基因替换为LA-A株-F株ΔgE和gI基因。在转染后1～2天观察在紫外光(488nm)激发下不发出荧光的病毒蚀斑，经3轮挑斑，获得纯化的病毒。经过PCR、基因测序鉴定，插入的S基因表达盒(PCR体系如下，表6)、ΔgE和gI基因正确。
表7ΔgE和gI基因鉴定
样品 体积
LA Taq DNA聚合酶 0.25μl
2×GC Buffer II 12.5μl
dNTPs(2.5mM) 4μl
上游引物PRV gE flanking F 1μl
下游引物PRV gE flanking R 1μl
模板DNA 1μl
ddH<sub>2</sub>O 5.25μl
反应程序为：94℃3min,94℃30s，52℃30s，72℃4min30s共30个循环,72℃10min。取10μL PCR产物加入6×loading Buffer于1％琼脂糖凝胶电泳后凝胶成像系统观察结果。
表8 S基因表达盒鉴定
样品 体积
2×Hieff PCR Master Mix 12.5μl
上游引物S F 1μl
下游引物S R 1μl
模板DNA 1μl
ddH<sub>2</sub>O 10μl
反应程序为：94℃3min,94℃30s，50℃30s，72℃1min30s共30个循环,72℃10min。取10μL PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳后凝胶成像系统观察。结果均与预期一致。
实施例二、猪流行性腹泻病毒重组伪狂犬病病毒rPRV-S(PEDV)-UL40株的传代稳定性
经转染三次挑斑纯化后，每日观察ST细胞中细胞病变，待病变出现后进行挑斑传代，具体步骤如下：
在荧光显微镜下观察蚀斑位置并标记。
吸取细胞孔中原有培养液，取1μl新的健康细胞孔培养液，枪头抵住标记位置，左右轻晃，使用枪头中新的培养液吹打一次(切勿吹打次数过多)，吹打后含病毒蚀斑培养液留在枪头中。
将枪头中培养液贴壁打在新的健康细胞孔中。
如此连续传代15代，收集第15代感染细胞与上清混合液，保存于-80℃备用。
保存前吸取200μl病毒液用通用性柱式基因组DNA提取试剂盒提取病毒基因组DNA进行鉴定。提取步骤如下：
取200μl病毒液，加入200μl GTL solution。
依次加入20μl蛋白酶K溶液与20μl GL solution后，立即漩涡振荡以混匀，56℃水浴10min。
瞬离以收集管壁的水珠，加入200μl无水乙醇，立即漩涡振荡混匀，再次瞬离。
将全部液体转移至吸附柱内，12,000rpm离心1min，弃废液。
加入500μl GW1 Solution，12,000rpm离心1min，弃废液。
加入500μl GW2 Solution，12,000rpm离心1min，弃废液。重复此步骤一次。
将吸附柱于12,000rpm空离2min，室温静置10min以彻底挥发GW2 Solution。
将吸附柱套于新的EP管中，向膜中央悬空加入30μl的ddH2O,室温静置3min后，12,000rpm离心1min，收集DNA，保存于-20℃冰箱。
以F15病毒基因组DNA为模板，用引物S(PEDV)F/R扩增S基因片段(PCR体系见表8)
结果表明：将重组病毒PRV-S(PEDV)-UL40在ST细胞中连续传代15代后，S基因表达盒未发生丢失或变异。
实施例三、猪流行性腹泻病毒重组伪狂犬病病毒rPRV-S(PEDV)-UL40株的生长特性鉴定
1.种毒的制备
(1)玻璃细胞瓶中添加10ml ST细胞悬液，置5％CO2恒温培养箱中37℃培养。
(2)培养2～3d后待细胞长满至单层，弃去上清培养液并加入新鲜的细胞维持液(含2％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基)。
(3)将第15代rPRV-S(PEDV)-UL40病毒液在-80℃、37℃冻融一次。
(4)取100μl冻融的细胞液接种于上述ST细胞瓶中，置5％CO2恒温培养箱中37℃培养。
(5)每8小时显微镜下观察细胞病变情况，待病变达80％后将细胞在-80℃、37℃快速冻融三次，4℃12,000rpm离心10min，分离细胞碎片等杂质，将上清病毒液分装于1.5mlEP管存于-80℃备用。
2.病毒TICD50的测定
(1)细胞准备：96孔细胞板中每孔加入100μl ST细胞悬液，置5％CO2恒温培养箱中37℃培养1d长满至单层。
(2)将分装好的第15代rPRV-S(PEDV)-UL40病毒液从-80℃取出，置于37℃融化，用无添加的DMEM培养基按10倍比从10-1稀释至10-8.
(3)用排枪吸去细胞孔中培养液并添加100μl新鲜细胞维持液(含2％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基)。
(4)各梯度分别吸取100μl病毒液接于8个同一梯度96孔细胞板中，同时设置8个健康细胞孔作为对照。
(5)接毒后轻轻晃动，置5％CO2恒温培养箱中37℃培养。
(6)连续5d显微镜下观察细胞病变并统计病变孔数，5d后进行汇总。按Red-Muench法计算rPRV-S(PEDV)-UL40的TICD50。
经测定，rPRV-S(PEDV)-UL40滴度可达到107.67TCID50/mL以上，能满足疫苗的生产要求。
实施例四、猪流行性腹泻病毒重组伪狂犬病病毒rPRV-S(PEDV)-UL40株免疫后抗体测定
1、试验材料
1.1病毒与PEDV商品灭活苗
PRV rPRV-S(PEDV)-UL40株病毒液，病毒含量107.67TCID50/mL。
PEDV CV777株，来自江苏省农业科学院猪病研究组，病毒含量107.00TCID50/mL。
PEDV商品灭活苗。品名：泻净诺。厂家：浙江诗华诺倍威生物技术有限公司。批次：20181016，
1.2诊断试剂盒
PRV抗体诊断试剂盒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)抗体诊断试剂盒和猪瘟病毒(SFV)抗体诊断试剂盒、猪流行性腹泻病毒(PEDV抗体诊断试剂盒)。
2、试验动物
试验选取9头健康仔猪，其PRV抗原和PRV抗体均为阴性，猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(SFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗原与抗体均为阴性。接种前核实猪只的饮食、精神状况和临床情况等，凡不健康的猪只排除出试验。通过耳标号码和笼号与圈号进行标识。在隔离环境中分笼饲养。饲料为全价配合饲料(市售产品)，饮水为自来水，每日上午和下午各饲喂一次。专人负责饲养，每天进行2次清洁卫生。
3、分组
仔猪随机分为3组(A～C)，每组3头。
4、试验方法和研究的指标
(1)试验方法
免疫：将rPRV-S(PEDV)-UL40株病毒液和PEDV商品灭活苗分别应用无菌DMEM培养液稀释至105.00TCID50/2mL用于免疫，A组肌肉接种2mL 105.00TCID50 rPRV-S(PEDV)-UL40株，B组后海穴接种2mL/每头PEDV商品灭活疫苗，C组注射各2mL PBS，免疫剂量为2mL/头。
血清和抗体检测：接种后7、14、21、28、35、42、49和56天采集血清，测定抗PEDV的中和抗体。
临床症状观察：所有试验猪只每日观察精神、饮食状况和各种呼吸系统、神经系统和全身性临床表现。
体温测量：从疫苗接种前开始，至接种后14d，所有猪只每日测量体温一次(直肠温度)。
(2)研究的指标
仔猪体内PEDV中和抗体水平。采用固定血清稀释病毒法，试验准备及具体操作如下：
试验准备：
①细胞：Vero细胞；培养基：DMEM、新生牛血清和抗生素(100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素)；细胞维持及传代：将细胞经胰酶消化后1:3传代，加含10％新生牛血清的DMEM营养液培养24～48小时，换成含2％新生牛血清的DMEM维持液。病毒：PEDV CV777株，毒种冻存于-70℃。
病毒悬液的制备：按0.01MOI接种Vero细胞后，待约75％细胞发生病变时(约36～48小时)，在-70℃与37℃温度下冻融细胞并剧烈晃动来破碎细胞，5000r/min离心10分钟后，提取上清(0.5ml/管)，标记名称、批次和日期等，于-70℃保存备用。
②病毒滴度测定①取-70℃保存的病毒悬液，置37℃水浴融化后立即取出，应用DMEM液10倍倍比稀释至10-8；取生长24～48小时，长满单层的96孔板Vero细胞，吸去上清；将稀释好的病毒液依次接种于第1列至第8列，每个稀释度接种4～6孔，每孔100μl，37℃二氧化碳培养箱中吸附1小时之后，每孔添加100μl含4％新生牛血清的DMEM；37℃培养5日，记录每个稀释度的病变数，按Reed&Muench法计算TCID50。
中和试验方法(无菌操作)：
(1)96孔板制备Vero细胞，生长24～48小时，待其长满单层，备用。
(2)待检血清56℃水浴灭活30分钟。
(3)将病毒原液应用DMEM液10倍倍比稀释至10-8，分装至EP管。
(4)各稀释度病毒分别添加等量灭活血清，混匀37℃作用1小时。
(5)取制备好的96孔板Vero细胞，吸去上清，将病毒和血清学混合物依次接种于第1列至第8列，每个稀释度接种3～6孔，每孔100μl，37℃二氧化碳培养箱中培养5日，记录每个稀释度的病变数，按Reed&Muench法计算TCID50。
(6)取伪狂犬病病毒阴性血清，按上述方法测定TCID50。
(7)血清中和指数公式如下：
中和指数＝待检样品TCID50/阴性血清对照组TCID50。
(8)应用标准品作为对照，检测方法如下：
病毒对照将病毒10倍倍比稀释，接种于上述Vero细胞，按上述病毒滴度测定方法测定TCID50。
细胞对照同批不接种的Vero细胞单层，重复8孔。
阳性血清对照已知中和指数的PEDV阳性血清作为阳性对照，测定中和指数，方法如上。
5、试验结果
仔猪免疫rPRV-S(PEDV)-UL40株后，未见任何临床症状和体温异常反应，接种后PEDV中和抗体水平第一周至第八周分别为0.18、0.28、2.48、2.00、8.24、27.44、9.71、1.92，PEDV商品灭活苗免疫后仔猪体内PEDV中和抗体水平第一周至第八周分别为15.21、11.07、10.83、52.58、13.98、62.23、24.95、10.83。
rPRV-S(PEDV)-UL40株免疫仔猪后5周和6周，产生较高的抗PEDV的中和抗体，PRV-S免疫猪只抗PEDV的中和抗体水平略低于PEDV灭活苗免疫仔猪，但由于活疫苗比灭活疫苗能产生更高水平的细胞免疫和黏膜免疫，所以试验结果表明rPRV-S(PEDV)-UL40株具有优良的免疫效力。
综上所述，伪狂犬病病毒基因组中UL40与UL41之间非编码区可以作为外源基因的插入位点，在此位点插入PEDV S蛋白基因表达盒构建的rPRV-S(PEDV)-UL40株安全性可靠，能对PEDV产生免疫力，是一株优良的重组疫苗株，其开发应用将非常有利于在猪场中进行PRV变异株及PEDV变异株的预防。伪狂犬病病毒基因组中UL40与UL41之间非编码区作为外源基因插入位点的应用前景广阔。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 猪流行性腹泻病毒伪狂犬病病毒载体重组病毒、制备方法及其应用
<130> 20201201
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 5828
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> S蛋白基因表达盒
<400> 1
ctagtggatc ccccaactcc gcccgtttta tgactagaac caatagtttt taatgccaaa 60
tgcactgaaa tcccctaatt tgcaaagcca aacgccccct atgtgagtaa tacggggact 120
ttttacccaa tttcccaagc ggaaagcccc ctaatacact catatggcat atgaatcagc 180
acggtcatgc actctaatgg cggcccatag ggactttcca catagggggc gttcaccatt 240
tcccagcata ggggtggtga ctcaatggcc tttacccaag tacattgggt caatgggagg 300
taagccaatg ggtttttccc attactggca agcacactga gtcaaatggg actttccact 360
gggttttgcc caagtacatt gggtcaatgg gaggtgagcc aatgggaaaa acccattgct 420
gccaagtaca ctgactcaat agggactttc caatgggttt ttccattgtt ggcaagcata 480
taaggtcaat gtgggtgagt caatagggac tttccattgt attctgccca gtacataagg 540
tcaatagggg gtgaatcaac aggaaagtcc cattggagcc aagtacactg cgtcaatagg 600
gactttccat tgggttttgc ccagtacata aggtcaatag gggatgagtc aatgggaaaa 660
acccattgga gccaagtaca ctgactcaat agggactttc cattgggttt tgcccagtac 720
ataaggtcaa tagggggtga gtcaacagga aagtcccatt ggagccaagt acattgagtc 780
aatagggact ttccaatggg ttttgcccag tacataaggt caatgggagg taagccaatg 840
ggtttttccc attactggca cgtatactga gtcattaggg actttccaat gggttttgcc 900
cagtacataa ggtcaatagg ggtgaatcaa caggaaagtc ccattggagc caagtacact 960
gagtcaatag ggactttcca ttgggttttg cccagtacaa aaggtcaata gggggtgagt 1020
caatgggttt ttcccattat tggcacgtac ataaggtcaa taggggtgag tcattgggtt 1080
tttccagcca attgaattca aacgccatgt actttcccac cattgacgtc aatgggctat 1140
tgaaactaat gcaacgtgac ctttaaacgg tactttccca tagctgatta atgggaaagt 1200
accgttctcg agccaataca cgtcaatggg aagtgaaagg gcagccaaaa cgtaacaccg 1260
ccccggtttt cccctggaaa ttccatattg gcacgcattc tattggctga gctgcgttct 1320
acgtgggtat aagaggcgcg accagcgtcg gtaccgtcgc agtcttcggt ctgaccaccg 1380
tagaacgcag agctcctcgc tgcaggcggc cgctctagaa ctcgtcgatc gcagcgatga 1440
agtctttaac ctacttctgg ttgttcttac cagtactttc aacacttagc ctaccacaag 1500
atgtcaccag gtgcacagct aacactaatt ttaggcggtt cttttcaaaa tttaatgttc 1560
aggcgcctgc agttgttgta ctgggcggtt atctacctat tggtgaaaac cagggtgtca 1620
attcaacttg gtactgtgct ggccaacatc caactgctag tggcgttcat ggtatctttc 1680
ttagccatat tagaggtggt catggctttg agattggcat ttcgcaagag ccttttgacc 1740
ctagtggtta ccagctttat ttacataagg ctactaacgg taacactaat gctactgcgc 1800
gactgcgcat ttgccagttt cccagcatta aaacattggg ccccgctgct aataatgatg 1860
ttacaacagg tcgtaactgc ctatttaaca aagccatccc agctcatatg agtgaacata 1920
gtgttgtcgg cataacatgg gataatgatc gtgtcactgt cttttctgac aagatctatt 1980
atttttattt taaaaatgat tggtcccgtg ttgcgacaaa gtgttacaac agtggaggtt 2040
gtgctatgca atatgtttac gaacccactt actacattct taatgttact agtgctggtg 2100
aggatggtat ttcttatcaa ccctgtacag ctaattgcat tggttatgct gccaatgtat 2160
ttgctactga gcccaatggc cacataccag aaggttttag ttttaataat tggtttcttt 2220
tgtccaatga ttccactttg gtgcatggta aggtggtttc caaccaacca ttgttggtca 2280
attgtctttt ggccattcct aagatttatg gactaggcca atttttctcc tttaatcaaa 2340
cgatcgatgg tgtttgtaat ggagctgctg tgcagcgtgc accagaggct ctgaggttta 2400
atattaatga cacctctgtc attcttgctg aaggctcaat tgtacttcat actgctttag 2460
gaacaaattt ttcttttgtt tgcagtaatt cctcagaacc tcacttagcc acctttgcca 2520
tacctctggg tgctatccaa gtaccctatt attgttttct taaagtggat acttacaact 2580
ccactgttta taaattcttg gctgttttac ctcttaccgt cagggaaatt gtcatcacca 2640
agtatggtga tgtttatgtc aatgggtttg gctacttgca tctcggtttg ttggatgctg 2700
tcacaattaa tttcactggt catggcactg acgatgacgt ttctggtttt tggaccatag 2760
catcgactaa ttttgttgat gcacttatcg aagttcaagg aactgccatt cagcgtattc 2820
tttattgtga tgatcctgtt agccaactca agtgttctca ggttgctttt gaccttgacg 2880
atggttttta ccgtatttcc tctacaaacc ttctgagtca tgaacagcca acttcttttg 2940
ttactttgcc atcatttaat gatcattctt ttgttaatat tactgtctct gctgcttttg 3000
gtggtcatag tggtgccaac cttattgcat ctgacactac tatcaatggg tttagttctt 3060
tctgtgttga cactagacaa tttaccattt cactgtttta taacgttaca aacagttatg 3120
gttacgtgtc taaatcacag gatagtaatt gcccttttac cttgcaatct gttaatgatt 3180
acctgtcttt tagcaaattt tgtgtttcta ccagcctttt ggctagtgcc tgtaccatag 3240
atctttttgg ttaccctgag tttggtagtg gtgttaagtt cacgtccctt tactttcaat 3300
tcacaaaggg tgagttgatt actggcacgc ctaaaccact tgaaggtgtt acggacgttt 3360
cttttatgac tctggatgtg tgtaccaagt atactatcta tggctttaaa ggtgagggta 3420
tcattaccct tacaaattct agctttttgg caggtgttta ttatacatct gattctggac 3480
agttgttagc ttttaagaat gtcactagtg gtgctgttta ttctgttacg ccatgttctt 3540
tttcagagca ggctgcatat gttgatgatg atatagtggg tgttatttct agtttgtcta 3600
gctccacttt taacagtact agggagttgc ctggtttctt ctaccattct aatgatggct 3660
ctaattgtac agagcctgtg ttggtgtata gtaacatagg tgtttgtaaa tctggcagta 3720
ttggctatgt ccgatctcag tctggccaag tcaagattgc acccacggtt actgggaata 3780
ttagtattcc caccaacttt agtatgagta ttaggacaga atatttacag ctttacaaca 3840
cgcctgttag tgttgattgt gctacatatg tttgtaatgg taactctcgt tgtaaacaat 3900
tactcaccca gtacactgca gcatgtaaga ccatagagtc agcattacaa ctcagcgcta 3960
ggcttgagtc tgctgaagtc aactctatgc ttactatttc tgaagaggct ctacagttag 4020
ctaccatcag ttcgtttaat ggtgatggat ataattttac taatgtgctg ggtgtttccg 4080
tgtatgacca tgcaaggggc agggtggtac aaaaaatgtc tttcattgaa gacctgcttt 4140
ttaataaagt ggttactaat ggccttggta ctgttgatga agactataag cgctgttcta 4200
atggccgctc tgtggcagat ttagtctgtg cgcagtatta ctctggtgtc atggtactac 4260
ctggtgttgt tgacgctgag aagcttcata tgtatagtgc gtctctcatc ggtggtatgg 4320
tgctaggagg ttttactgca gcagcggcat tgccttttag ctatgctgtt caagcgagac 4380
tgaattatct tgctctacag acggatgttc tacagcggaa ccagcaattg cttgctgagt 4440
cttttaattc tgctattggt aatataactc cagcctttga gagtgttaaa gaggctatta 4500
gtcaaacttc taagggtttg aacactgtgg ctcatgcgct taccaaggtc caagaggttg 4560
ttaattcgca gggtgcagct ttgacccaac ttaccgtaca gctgcaacac aacttccaag 4620
ccatttctag ttctattgat gacatttact cccgacttga cattctttca gccgatgttc 4680
aggtagaccg tctcatcacc ggcagattat cagcacttaa tgcttttgtt gctcaaaccc 4740
ttactaagta tactgaggtt caggctagca ggaaactagc acagcaaaag gttaatgagt 4800
gcgttaaatc gcaatctcag cgttatggtt tttgtggtgg tgatggcgag cacattttct 4860
ctctggtaca ggccgcacct caaggcctgc tgtttttaca cacagtactt gtaccgggtg 4920
actttgtaaa tgttattgcc atcgctggct tatgtgttaa cgatgaaatt gccttgactc 4980
tacgtgagcc tggtttagtc ttgtttacgc atgaacttca agatactgcg acggaatatt 5040
ttgtttcatc gcgacgtatg tatgaaccta gaaaacctac cgttggtgat tttgttcaaa 5100
ttgagagttg tgtggtcacc tatgtcaatt tgactagaga ccaactacca gaagtaatcc 5160
cagattacat cgatgttaac aaaacacttg atgagatttt agcctctctg cccaatagaa 5220
ctggtccaag tctttctcta gatgttttta atgccactta tcttaatctt actggtgaaa 5280
ttgcagattt agagcagcgt tcagagtctc tccgtaatac tacagaagag cttcaaagtc 5340
ttatatataa tatcaacaac acactagttg accttgagtg gctcaaccga gttgagacat 5400
atatcaagtg gccgtggtgg gtttggttga ttatttttat tgttctcatc tttgttgtgt 5460
cattactagt gttctgctgc atttccacgg gttgttgtgg atgctgcggc tgctgtggtg 5520
cttgtttttc aggttgttgt aggggtccta gacttcaacc ttacgaagct tttgaaaagg 5580
tccacgtgca gtgatctaga gcggccgcgg ggatccagac atgataagat acattgatga 5640
gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg aaatttgtga 5700
tgctattgct ttatttgtaa ccattataag ctgcaataaa caagttaaca acaacaattg 5760
cattcatttt atgtttcagg ttcaggggga ggtgtgggag gttttttcgg atcctctaga 5820
gtcgacaa 5828
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 伪狂犬病病毒
<400> 2
gtggggtggg gagagttggc ggggaggcgg gga 33
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> PRV inser UL40 En Pa F
<400> 3
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<210> 4
<211> 61
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> PRV inser UL40 En Pa R
<400> 4
gtccaccccc gtcagcccca tctcccttcc cccgtcatca ttgtcgactc tagaggatcc 60
g 61

Claims (6)

1.猪流行性腹泻病毒伪狂犬病病毒载体重组病毒，其特征在于是在伪狂犬病病毒基因组中UL40与UL41之间非编码区插入PEDV S蛋白基因表达盒后得到。
2.权利要求1所述猪流行性腹泻病毒伪狂犬病病毒载体重组病毒在活疫苗中的应用。
3.以权利要求1所述猪流行性腹泻病毒伪狂犬病病毒载体重组病毒为活性成分的疫苗。
4.根据权利要求3所述疫苗，其特征在于猪流行性腹泻病毒伪狂犬病病毒载体重组病毒的病毒液采用如下方法制备：将猪流行性腹泻病毒伪狂犬病病毒载体重组病毒接种ST细胞，采用含有胎牛血清的DMEM培养基培养36～48小时，收获病毒培养物，冻融后离心取上清液作为病毒液。
5.根据权利要求4所述疫苗，其特征在于所述疫苗为活疫苗。
6.重组载体活疫苗，其特征在于其活性成份是在伪狂犬病病毒基因组中UL40与UL41之间非编码区插入了外源基因表达盒后得到；所述外源基因包括非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪圆环病毒、狂犬病病毒、口蹄疫病毒、兔瘟病毒和犬瘟热病毒的保护性抗原基因。
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