JP6971378B2 - 水産養殖動物におけるアエロモナス出血性疾患の予防及び制御のための弱毒生ワクチン - Google Patents
水産養殖動物におけるアエロモナス出血性疾患の予防及び制御のための弱毒生ワクチン Download PDFInfo
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Description
(1)は、配列表の配列6で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
(2)は、配列表の配列6で示されるアミノ酸配列が、1つ又は幾つかのアミノ酸残基の置換及び/又は欠損及び/又は付加を受けて、同じ機能を有する、配列6に由来するタンパク質である。
(a1)は、配列表の配列5で示されるDNA分子である。
(a2)は、コード領域が配列表の配列5で示されるDNA分子である。
(a3)は、(a1)又は(a2)により限定されるDNA配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズし、同じ機能を有するタンパク質をコードするDNA分子である。
(a4)は、(a1)又は(a2)又は(a3)により限定されるDNA配列と90%以上の相同性を有し、同じ機能を有するタンパク質をコードするDNA分子である。
(b1)水産動物アエロモナス・ベロニワクチン、
(b2)水産動物アエロモナス・ハイドロフィラワクチン、
(b3)水産動物アエロモナスワクチン、
(b4)水産動物出血性疾患ワクチン
(b1)水産動物アエロモナス・ベロニワクチン、
(b2)水産動物アエロモナス・ハイドロフィラワクチン、
(b3)水産動物アエロモナスワクチン、
(b4)水産動物出血性疾患ワクチン
(c1)水産動物アエロモナス・ベロニ感染の予防及び/又は治療、
(c2)水産動物アエロモナス・ハイドロフィラ感染の予防及び/又は治療、
(c3)水産動物アエロモナス感染の予防及び/又は治療、
(c4)水産動物出血性疾患の感染の予防及び/又は治療、
(c5)水産動物の免疫力の改善
(d1)水産動物アエロモナス・ベロニ感染の予防及び/又は治療、
(d2)水産動物アエロモナス・ハイドロフィラ感染の予防及び/又は治療、
(d3)水産動物アエロモナス感染の予防及び/又は治療、
(d4)水産動物出血性疾患の感染の予防及び/又は治療、
(d5)水産動物の免疫力の改善
(f1)水産動物アエロモナス・ベロニ感染の予防及び/又は治療、
(f2)水産動物アエロモナス・ハイドロフィラ感染の予防及び/又は治療、
(f3)水産動物アエロモナス感染の予防及び/又は治療、
(f4)水産動物出血性疾患の感染の予防及び/又は治療、
(f5)水産動物の免疫力の改善
E.coli MC1061:BioVector NTCC典型培養物寄託センター、番号:MC1061
E.coli S17−1(λ pair):BioVector NTCC典型培養物寄託センター、番号:s17−1
一、ノックアウトプラスミドの構築
ノックアウトプラスミドの構築プロセスの模式図を図1に示す。具体的なステップは次のとおりである。
1、PCR法(反応手順:98℃、5分、32×[98℃、20秒;58℃、20秒;72℃、1分]、72℃、5分)によってプラスミドpRE112を線状化して、線状化プラスミド断片を得た。
Aer−up−F:5’−TGAATTCCCGGGAGAATGATCTCGGCGGTACCTGG−3’;
Aer−up−R:5’−GATCCACACCGGTAAATCAGGGTAGACAGGTTCAG−3’。
Aer−down−F:5’−CCTGTCTACCCTGATTTACCGGTGTGGATCTGGAC−3’;
Aer−down−R:5’−GCTTCTTCTAGAGGTTGAGTGAAGGTGGAGCTGAG−3’。
1、ステップ1で得られたノックアウトプラスミドで、MC1061コンピテント細胞を形質転換し、25uF、2.5kV、200ohmで電気形質転換を行った。電気形質転換の直後に、1mlのLB液体培地を加え、37℃、200r/minで1〜1.5時間シェーカーで培養した後、遠心分離し、900μlを除去し、100μlを残し再懸濁し、その後すべてを30ug/mlのクロロマイセチン(Cm)を含むLB固体プレート上に塗布し、37℃で一晩培養した。一晩後に増殖したシングルコロニーについて、コロニーPCR検出により陽性コロニーをスクリーニングした(プライマーAer−up−F及びプライマーAer−up−Rを用いてPCR検出を行い、サイズが2348bpのバンドを得た)。
アエロモナス・ベロニ(Aeromonas veronii)Hm091△aerは、2017年10月09日に中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センター(略称CGMCC;住所:北京市朝陽区北辰西路1号院3号、中国科学院微生物研究所;郵便番号100101)に、寄託番号CGMCC No.14776で寄託された。
1、アエロモナス・ベロニ A.veronii Hm091を30mlのLB液体培地に接種し、37℃、200r/minで18時間シェーカーで培養した。2mlの菌液を取り、5000r/mimで10分間遠心分離し、上清を除去し、PBSで2回洗浄し、遠心分離で上清を除去し、1mlの0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝液を加えて菌体を再懸濁し、A.veronii Hm091炭酸水素ナトリウム緩衝液を得た。
群A(対照群):PBSにゼブラフィッシュを感染させた。
群B(A.hydrophila NJ−1赤色蛍光標識感染群):A.hydrophila NJ−1赤色蛍光標識溶液にゼブラフィッシュを感染させ、感染ウェル内のA.hydrophila NJ−1の濃度は4×107CFU/mlであった。
群C(A.veronii Hm091赤色蛍光標識感染群):A.veronii Hm091赤色蛍光標識溶液にゼブラフィッシュを感染させ、感染ウェル内のA.veronii Hm091の濃度は4×107CFU/mlであった。
群D(A.hydrophila NJ−1赤色蛍光標識+無標識A.veronii Hm091感染群):A.hydrophila NJ−1赤色蛍光標識溶液及びA.veronii Hm091溶液にゼブラフィッシュを感染させ、感染ウェル内のA.hydrophila NJ−1の濃度は4×107CFU/mlであり、感染ウェル内のA.veronii Hm091の濃度は4×107CFU/mlであった。
群E(A.hydrophila NJ−1赤色蛍光標識+A.veronii Hm091青色蛍光標識):A.hydrophila NJ−1赤色蛍光標識溶液及びA.veronii Hm091青色蛍光標識液にゼブラフィッシュを感染させ、感染ウェル内のA.hydrophila NJ−1の濃度は4×107CFU/mlであり、感染ウェル内のA.veronii Hm091の濃度は4×107CFU/mlであった。
群F(A.veronii Hm091△aer赤色蛍光標識感染群):A.veronii Hm091△aer赤色蛍光標識溶液にゼブラフィッシュを感染させ、感染ウェル内のA.veronii Hm091△aerの濃度は4×107CFU/mlであった。
群G(A.hydrophila NJ−1赤色蛍光標識+無標識A.veronii Hm091△aer感染群):A.hydrophila NJ−1赤色蛍光標識溶液及びA.veronii Hm091△aer溶液にゼブラフィッシュを感染させ、感染ウェル内のA.hydrophila NJ−1の濃度は4×107CFU/mlであり、感染ウェル内のA.veronii Hm091△aerの濃度は4×107CFU/mlであった。
1、アエロモナス・ベロニ A.veronii Hm091をLB固体培地に接種し、37℃で12時間培養し、その後モノクローナルを選び取って、30mlのLB液体培地に接種し、37℃、200r/minで18時間シェーカーで培養した。
アエロモナス・ベロニ A.veronii Hm091△aerがそれぞれ3.3×107CFU/ml、2.5×107CFU/ml、1.67×107CFU/mlの浸漬濃度では、ゼブラフィッシュは死亡しなかったが、野生型株による感染後24時間以内にゼブラフィッシュは100%死亡する可能性がある。その結果、Aerをノックアウトすると、アエロモナス・ベロニの毒性は著しく低下し、アエロモナス・ベロニ A.veronii Hm091△aerの感染濃度≦3.3×107CFU/mlの浸漬は安全であることが明らかになった。
一、ゼブラフィッシュの血清免疫グロブリン含有量に対するアエロモナス・ベロニ A.veronii Hm091△aerワクチンの影響
生後3ヶ月のゼブラフィッシュを次の3つの群にランダムに分けた。
群1(対照群):ゼブラフィッシュを2週間正常に飼育し、基礎飼料を1日2回飽食給餌した。
群2(給餌免疫群):ゼブラフィッシュを2週間正常に飼育し、アエロモナス・ベロニ A.veronii Hm091△aer(2×107CFU/g)を含む基礎飼料を1日2回飽食給餌した。
群3(浸漬免疫群):ゼブラフィッシュを2週間正常に飼育し、アエロモナス・ベロニ A.veronii Hm091△aer含有の水に週に1回浸漬し(2×107CFU/ml、浸漬時間は12時間)、基礎飼料を1日2回飽食給餌した。
群1(対照群):ゼブラフィッシュを2週間正常に飼育し、基礎飼料を1日2回飽食給餌した。
群2(給餌免疫群):ゼブラフィッシュを2週間正常に飼育し、アエロモナス・ベロニ A.veronii Hm091△aer(2×107CFU/g)を含む基礎飼料を1日2回飽食給餌した。
群3(浸漬免疫群):ゼブラフィッシュを2週間正常に飼育し、アエロモナス・ベロニ A.veronii Hm091△aer含有の水に週に1回浸漬し(4×107CFU/L、浸漬時間は12時間)、基礎飼料を1日2回飽食給餌した。
群1(対照群、CK):ゼブラフィッシュを2週間正常に飼育し、基礎飼料を1日2回飽食給餌した。
群2(給餌免疫群、T1):ゼブラフィッシュを2週間正常に飼育し、アエロモナス・ベロニ A.veronii Hm091△aer(2×107CFU/g)を含む基礎飼料を1日2回飽食給餌した。
群3(浸漬免疫群、T2):ゼブラフィッシュを2週間正常に飼育し、アエロモナス・ベロニ A.veronii Hm091△aer含有の水に週に1回浸漬し(3×107CFU/ml、浸漬時間は12時間)、基礎飼料を1日2回飽食給餌した。
各群の処理後、各群のゼブラフィッシュを次の3つの群にランダムに分けた。
群A(A.hydrophila NJ−1+塩化アンモニウム):200mg/Lの塩化アンモニウムにゼブラフィッシュを感染させ(浸漬)、12時間後、2×107CFU/mlのアエロモナス・ベロニ A.veronii Hm091を加えた。
群B(A.veronii Hm091):2×107CFU/mlの濃度のアエロモナス・ベロニ A.veronii Hm091にゼブラフィッシュを感染させた(浸漬)。
群C(A.veronii Hm091+ A.hydrophila NJ−1):それぞれの菌の濃度が2×107CFU/mlのアエロモナス・ベロニ A.veronii Hm091及びアエロモナス・ハイドロフィラ A.hydrophila NJ−1にゼブラフィッシュを感染させた(浸漬)。
96時間以内のゼブラフィッシュの死亡状況を統計し、式(RPS=(1−免疫群死亡数/対照死亡数)×100%)に従って免疫保護率(RPS)を計算した。
結果を図5及び表3に示す。
??1)本発明は、アエロモナス・ベロニのアエロリシンがゼブラフィッシュの感染部位に損傷を引き起こし、さらに関連する細菌の魚体内への侵入を促進することが出血性疾患の大発生を引き起こす主な原因となるという発症メカニズムに基づき、感染症を引き起こすアエロモナス・ベロニから、出血性疾患を予防/治療するワクチンを開発する。それにより、長い間アエロモナス出血性疾患の病因が不明であるため後期に感染を引き起こす細菌を重視する一方、損傷を引き起こす主要な細菌のワクチンの開発を無視することで、長い間細菌性敗血症のワクチン予防/制御効果が低下するという現状が回避される。
2)本発明は相同組換えの原理を採用し、特定の遺伝子断片を標的として欠損させて遺伝子不活性化を引き起こすことによって、得られた遺伝子欠損株はより良好な遺伝的安定性を有し、トランスポゾンなどの不安定な遺伝子工学的手法により構築される弱毒株による遺伝的不安定性のリスクが回避される。本発明の弱毒生ワクチンは、抗生物質標識を一切含まず、耐性株又は抗生物質耐性遺伝子を環境に放出することによって引き起こされる潜在的な害がない。
3)本発明では、遺伝子ノックアウトの方法を使用して、アエロリシン(Aerolysin)の主要な毒性因子をノックアウトして弱毒株を取得し、その毒性は親株よりも著しく低下する。同時に、不活化ワクチンの不十分な不活化による安全性の問題、及び不活化試薬による副作用がよく回避される。
4)本発明の弱毒生ワクチンは、様々な供給源からのアエロモナスに対して一定の交差保護力を有し、幅広い適応性を有する。
5)本発明の弱毒生ワクチンは、ゼブラフィッシュにおいて一定の免疫保護力を有し、本発明の弱毒生ワクチンがゼブラフィッシュの免疫応答を効果的に活性化できることを示している。
6)本発明により提供されるワクチンを使用することによって、水産動物の免疫力を著しく増強し、耐病性発現型を改善することができる。
Claims (17)
- 組換え菌であって、アエロモナス・ベロニのアエロリシン遺伝子をノックアウトすることによって得られたものである、ことを特徴とする組換え菌。
- 前記ノックアウトは、オープンリーディングフレーム全体をノックアウトするか、又は一部の遺伝子セグメントをノックアウトすることである、ことを特徴とする請求項1に記載の組換え菌。
- 組換え菌であって、特異的なDNA断片をアエロモナス・ベロニに導入し相同組換えを行った後に得られた前記特異的なDNA断片を有する組換え菌であり、前記特異的なDNA断片は、アエロリシン遺伝子の上流ホモロジーアーム及び下流ホモロジーアームを含み、前記上流ホモロジーアームは、配列表の配列3の5’末端から第3092〜4276番目のヌクレオチドで示され、前記下流ホモロジーアームは、配列表の配列3の5’末端から第4277〜5408番目のヌクレオチドで示される、ことを特徴とする組換え菌。
- 寄託番号がCGMCC No.14776であるアエロモナス・ベロニ(Aeromonas veronii)Hm091△aer。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え菌を含むワクチンであって、以下の(b1)〜(b4)のいずれかである、ことを特徴とするワクチン。
(b1)水産動物アエロモナス・ベロニワクチン、
(b2)水産動物アエロモナス・ハイドロフィラワクチン、
(b3)水産動物アエロモナスワクチン、
(b4)水産動物出血性疾患ワクチン - 請求項4に記載のアエロモナス・ベロニ(A.veronii)Hm091△aerを含むワクチンであって、以下の(b1)〜(b4)のいずれかである、ことを特徴とするワクチン。
(b1)水産動物アエロモナス・ベロニワクチン、
(b2)水産動物アエロモナス・ハイドロフィラワクチン、
(b3)水産動物アエロモナスワクチン、
(b4)水産動物出血性疾患ワクチン - ワクチンを調製する方法であって、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え菌をワクチンの活性成分として包装するステップを含み、前記ワクチンは、以下の(b1)〜(b4)のいずれかである、ことを特徴とする方法。
(b1)水産動物アエロモナス・ベロニワクチン、
(b2)水産動物アエロモナス・ハイドロフィラワクチン、
(b3)水産動物アエロモナスワクチン、
(b4)水産動物出血性疾患ワクチン - ワクチンを調製する方法であって、請求項4に記載のアエロモナス・ベロニ(Aeromonas veronii)Hm091△aerをワクチンの活性成分として包装するステップを含み、前記ワクチンは、以下の(b1)〜(b4)のいずれかである、ことを特徴とする方法。
(b1)水産動物アエロモナス・ベロニワクチン、
(b2)水産動物アエロモナス・ハイドロフィラワクチン、
(b3)水産動物アエロモナスワクチン、
(b4)水産動物出血性疾患ワクチン - 請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え菌を用いて、製品を調製するための使用であって、以下の(c1)〜(c5)の少なくとも1つである、ことを特徴とする使用。
(c1)水産動物アエロモナス・ベロニ感染の予防及び/又は治療、
(c2)水産動物アエロモナス・ハイドロフィラ感染の予防及び/又は治療、
(c3)水産動物アエロモナス感染の予防及び/又は治療、
(c4)水産動物出血性疾患の感染の予防及び/又は治療、
(c5)水産動物の免疫力の改善 - 請求項4に記載のアエロモナス・ベロニ(Aeromonas veronii)Hm091△aerを用いて、製品を調製するための使用であって、以下の(c1)〜(c5)の少なくとも1つである、ことを特徴とする使用。
(c1)水産動物アエロモナス・ベロニ感染の予防及び/又は治療、
(c2)水産動物アエロモナス・ハイドロフィラ感染の予防及び/又は治療、
(c3)水産動物アエロモナス感染の予防及び/又は治療、
(c4)水産動物出血性疾患の感染の予防及び/又は治療、
(c5)水産動物の免疫力の改善 - 水産動物アエロモナス・ベロニワクチンであって、その活性成分は、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え菌、又は、請求項4に記載のアエロモナス・ベロニ(Aeromonas veronii)Hm091△aerである、ことを特徴とする水産動物アエロモナス・ベロニワクチン。
- 水産動物アエロモナス・ハイドロフィラワクチンであって、その活性成分は、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え菌、又は、請求項4に記載のアエロモナス・ベロニ(Aeromonas veronii)Hm091△aerである、ことを特徴とする水産動物アエロモナス・ハイドロフィラワクチン。
- 水産動物アエロモナスワクチンであって、その活性成分は、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え菌、又は、請求項4に記載のアエロモナス・ベロニ(Aeromonas veronii)Hm091△aerである、ことを特徴とする水産動物アエロモナスワクチン。
- 水産動物出血性疾患ワクチンであって、その活性成分は、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え菌、又は、請求項4に記載のアエロモナス・ベロニ(Aeromonas veronii)Hm091△aerである、ことを特徴とする水産動物出血性疾患ワクチン。
- 製品であって、その活性成分は、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え菌、又は、請求項4に記載のアエロモナス・ベロニ(Aeromonas veronii)Hm091△aerであり、前記製品の用途は、以下の(d1)〜(d5)の少なくとも1つである、ことを特徴とする製品。
(d1)水産動物アエロモナス・ベロニ感染の予防及び/又は治療、
(d2)水産動物アエロモナス・ハイドロフィラ感染の予防及び/又は治療、
(d3)水産動物アエロモナス感染の予防及び/又は治療、
(d4)水産動物出血性疾患の感染の予防及び/又は治療、
(d5)水産動物の免疫力の改善 - 以下の(f1)〜(f5)の少なくとも1つである請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え菌の使用。
(f1)水産動物アエロモナス・ベロニ感染の予防及び/又は治療、
(f2)水産動物アエロモナス・ハイドロフィラ感染の予防及び/又は治療、
(f3)水産動物アエロモナス感染の予防及び/又は治療、
(f4)水産動物出血性疾患の感染の予防及び/又は治療、
(f5)水産動物の免疫力の改善 - 以下の(f1)〜(f5)の少なくとも1つである請求項4に記載のアエロモナス・ベロニ(Aeromonas veronii)Hm091△aerの使用。
(f1)水産動物アエロモナス・ベロニ感染の予防及び/又は治療、
(f2)水産動物アエロモナス・ハイドロフィラ感染の予防及び/又は治療、
(f3)水産動物アエロモナス感染の予防及び/又は治療、
(f4)水産動物出血性疾患の感染の予防及び/又は治療、
(f5)水産動物の免疫力の改善
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