CN111235287B - 基于LAMP法检测含Aer基因的气单胞菌的引物组及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于LAMP法检测含Aer基因的气单胞菌的引物组及其应用。本发明首先提供了一种基于LAMP法检测含Aer基因的气单胞菌的引物组，如SEQ.NO.1‑4所示。本发明还提供了所述的引物组在闭管可视化环介导等温扩增技术检测含Aer基因的气单胞菌中的应用。本发明的引物组可用于检测大部分含有Aer毒力基因的致病性气单胞菌。提供的LAMP检测方法操作简单、特异性强、灵敏度高。

Description

基于LAMP法检测含Aer基因的气单胞菌的引物组及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于LAMP法检测含Aer基因的气单胞菌的引物组及其应用。

背景技术

鳗鲡(Anguilla spp.)，俗称鳗鱼，肉质鲜美，营养价值高，是世界重要的经济鱼类。中国鳗鲡养殖产量约占全球70％，年产值愈百亿元。然而，在目前鳗鲡高密度集约化的养殖过程中，致病性气单胞菌(Aeromonas spp.)可引起鳗鲡烂鳃、赤皮、穿孔、出血性败血症、肠炎和流行性溃疡等疾病，危害严重，可造成巨大的经济损失(Xiong J,Huang B,Songlin G,Xu J,Huang W.A novel mul iplex PCR assay for rapid detection ofvirulent aeromonas in cultured eels.J Appl Microbiol.2019,127(2):418-428.doi:10.1111/jam.14311.)。气溶素(aerolysin,aer)是致病性气单胞菌的一种重要毒力因子，是细胞毒性的成孔肠毒素，具有溶血性、细胞毒性、肠毒性，可导致机体组织溃疡、败血和坏死等病理变化，可引起鱼类特别是鳗鲡的败血症(Beaz-Hidalgo R and Figueras MJ.Aeromonas spp.whole genomes and virulence factors implicated in fishdisease.J Fish Dis.2013；36(4):371-388.)和组织溃疡等(Kingombe CI,D'Aoust JY,Huys G,et al.Multiplex PCR method for detection of three aeromonasenterotoxin genes.Appl Environ Microbiol.2010；76:425-433.；Foysal MJ,Momtaz F,Ali MH,et al.Molecular characterization and interactome analysis of aerolysin(aer)gene from fish pathogen aeromonas veronii:The pathogenicity inferredfrom sequence divergence and linked to histidine kinase(cheA).J FishDis.2019；42(4):465-475.)。此外，研究表明，气溶素基因广泛存在于气单胞菌中，与气单胞菌的致病性密切相关(Yi,S.W.,You,M.J.,Cho,H.S.,Lee,C.S.,Kwon,J.K.and Shin,G,W.(2013)Molecular characterization of Aeromonas species isolated from farmedeels(Anguilla japonica).Vet Microbiol 164,195–200.)。因此，该毒力因子可应用于检测致病性气单胞菌。

目前，快速检测致病性气单胞菌的毒力基因的方法主要有常规PCR、巢式PCR、或qPCR等，上述方法具有反应速度快、灵敏度高、特异性强等优点，但是，其依赖于昂贵、精密的热循环仪器，故难以在经济欠发达的养殖场进行临床样品检测(El-Bahar HM,Ali NG,Aboyadak IM,et al.Virulence genes contributing to aeromonas hydrophilapathogenicity in Oreochromis niloticus.Int Microbiol.2019.doi:10.1007/s10123-019-00075-3)。2000年，日本学者Notomi等提出了一种新型核酸扩增技术——环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，该技术可在60-65℃特定恒温条件下，快速、高效、特异地扩增靶基因，特别是其扩增只需要一台恒温培养箱或水浴箱，摆脱了对PCR仪等昂贵精密专业设备的依赖，适用经济欠发达地区的临床样品检(Notomiet al.2000.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic AcidsResearch,28(12):E63)。

目前，基于气溶素aer基因的LAMP检测技术已有报道：匡燕云以气溶素基因aer为靶序列，建立了嗜水气单胞菌的LAMP快速检测方法(匡燕云.环介导等温扩增技术检测嗜水气单胞菌方法的建立,南昌大学,2007,硕士论文)；王子浩则以气溶素基因aer为靶序列，建立了维氏气单胞菌的LAMP快速检测方法(王子浩.致病性维氏气单胞菌LAMP方法的建立与应用，四川农业大学，2013，硕士论文)。但是，上述建立的针对气溶素毒力基因的LAMP检测方法仅局限于分别检测嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌，由于鳗鲡致病性气单胞菌种类较多，利用上述方法检测鳗鲡源致病性气单胞菌存着较高风险的漏检。

CN109554449A，公开日20190402的专利文献公开了一种可同时检测气单胞菌7个毒力基因的多重PCR方法，该方法根据气单胞菌的管家基因及7个毒力基因的特征性基因序列做了靶序列，结合引物的扩增效率，以及兼顾基因的种属差异，优化组合，经过实验验证，优选了其中八对PCR引物，组合成两套四重PCR反应体系。该公开专利文献为本申请人的前期工作，虽然能够检测致病性气单胞菌，但是也仅能检测三种鳗鲡常见主要气单胞菌(嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila，维氏气单胞菌A.veroni，豚鼠气单胞菌A.caviae)，利用上述方法检测鳗鲡源致病性气单胞菌仍存在漏检的风险。

发明内容

本发明要解决的技术问题，在于提供一种基于LAMP法检测含气溶素(Aer)基因的气单胞菌的引物组及其应用，可用于检测大部分含有aer毒力基因的致病性气单胞菌。

本发明是这样实现的：

本发明首先提供了一种基于LAMP法检测含Aer基因的气单胞菌的引物组，引物序列具体如下：

F3：

5’-GGGGAGAAGAGCTCCATCAA-3’，

B3：

5’-CTCAGGCTGTAGGTRTCGGT-3’

FIP：

5’-TCTTGACCAGCTGCTTGCCG-TCATATACCCTGGAACCCGA-3’，

BIP：

5’-CCAATGCGACCAACTACACSGA-TGGTGGCCTTGTCGTACT-3’。

本发明还提供了所述的引物组在闭管可视化环介导等温扩增技术检测含Aer基因的气单胞菌中的应用。

进一步地，所述闭管可视化环介导等温扩增技术的反应体系：体积5-50μL，外引物:内引物的体积比为1:4-1:8；引物浓度范围：1-50μM。

更进一步地，25μL反应体系：10×Buffer 2.5μL，外引物F3和B3各0.5μL，内引物FIP和BIP各4μL，20-100mM 4×dNTPs 1.4μL，模板2μL，Bst DNA合成酶1μL，苯酚红染料1μL，SYTO 9.0染料0.5-1μL，体系起始pH为7.5-9.5，超纯水加至25μL。

其中所述10×Buffer：80-120μM(NH₄)₂SO₄，300-700μM KCl，60-120μM MgSO₄，0.1-1.5％Tween-20或Triton-100。

进一步地，所述闭管可视化环介导等温扩增技术的反应程序：在金属浴中63℃2-5min，60-75℃恒温45-65min，95℃3min，然后通过颜色变化肉眼判定扩增结果，粉红色为阴性，亮黄色为阳性；或在qPCR仪器上，进行63℃2-5min，63-73℃恒温运行25-65min收集荧光值，95℃3min，通过实时扩增曲线进行相对定量检测。

本发明具有如下优点：

1)本发明专利提供了一套由四对引物组成的LAMP引物组合，引物检测范围更广，除了维氏气单胞菌(A.veroni)、嗜水气单胞菌(A.hydrophila)、豚鼠气单胞菌(A.caviae)外，还可检测到温和气单胞菌(A.sobria)、维氏气单胞菌温和株(Aeromonasveroniibv.Sobria)、简达气单胞菌(A.jandaei)等。

2)本发明提供了一种闭管可视化环介导等温扩增技术。该方法可以在45min-65min完成核酸扩增，通过颜色变化(粉红色为阴性，亮黄色为阳性)肉眼判定扩增结果，无需额外进行电泳和/或开管添加入荧光染料等，从而避免了扩增产物的实验室污染等问题，大大缩短了样品检测时间和复杂程度。

3)本发明专利提供的LAMP检测方法特异性强：对副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌等多种非气单胞病原菌，均无阳性扩增结果。

4)本发明专利提供的LAMP检测方法灵敏度高，最低检出率为5.3×10^-4(ng/μL)。

附图说明

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。

图1为LAMP体系中镁离子浓度的优化结果。a：0μM Mg²⁺浓度的扩增结果；b：2μM Mg^{2 +}浓度的扩增结果；c：4μM Mg²⁺浓度的扩增结果；d：6μM Mg²⁺浓度的扩增结果。1-2：气单胞菌病原菌基因组模板；3-4：双蒸水作为阴性对照。

图2为气溶素(aer)基因可视化检测灵敏度测定结果。a：实时荧光LAMP方法灵敏度检测结果；b：肉眼观察灵敏度度检测结果。1-6：模板稀释倍数依次为5.3，5.3×10^-1，5.3×10^-2，5.3×10^-3，5.3×10^-4，5.3×10^-5(ng/μL)；7-8为双蒸水(阴性对照)。

图3为气溶素aer毒力基因特异性测定结果。a：实时荧光LAMP方法的特异性检测结果；b：肉眼判读方法的特异性检测结果。1-12：不同的气单胞菌菌株，依次为(1：B13温和气单胞菌Aeromonas sobria；2：B27嗜水气单胞菌A.hydrophila；3：B41维氏气单胞菌A.veronii；4：B52嗜水气单胞菌A.hydrophila；5：B56嗜水气单胞菌A.hydrophila；6：B69维氏气单胞菌A.veronii；7：B72维氏气单胞菌A.veronii；8：B106维氏气单胞菌A.veronii；9：B108豚鼠气单胞菌A.caviae；10：B144嗜水气单胞菌A.hydrophila；11：CGMCCC 1.2205维氏气单胞菌A.veronii；12：ATCC154688豚鼠气单胞菌A.caviae；13-16：非-气单胞菌(依次为：13：B1501创伤弧菌Vibriovulnificus；14：B1701副溶血性弧菌,V.parahemolyticus；15：ATCC6538金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus；16：ATCC9027铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa)。

具体实施方式

本发明收集并分析了国际基因组数据库收录的气单胞菌气溶素基因aer基因序列，这些aer基因序列来自气单胞菌不同物种，如维氏气单胞菌Aeromonas veronii、嗜水气单胞菌A.hydrophila、温和气单胞菌A.sobria、杀鲑气单胞菌A.salmonicida等，基本涵盖了养殖鳗鲡常见的主要致病性气单胞菌。通过序列比对，选择了其中一段种间高度保守且属内高度特异的序列作为检测致病性气单胞菌aer基因的靶核酸序列，然后按照引物设计原则，设计并合成多对引物，如表1所示。

表1气溶素aer基因LAMP引物

本发明LAMP引物序列在多种气单胞菌气溶素aer基因高度保守，经(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)网站比对及对鳗鲡病原菌库收集的气单胞菌进行检测时发现，可对鳗鲡常见致病性气单胞-维氏气单胞菌Aeromonas veronii、嗜水气单胞菌A.hydrophila、温和气单胞菌A.sobria、杀鲑气单胞菌A.salmonicida、维氏气单胞菌温和株(Aeromonas veronii bv.Sobria)、简达气单胞菌(A.jandaei)等多种不同气单胞菌实现有效检测。

实施例一：基于气溶素(aer)基因的LAMP反应体系优化

对LAMP反应体系中的Mg²⁺不同浓度(0μM，2μM，4μM，6μM)进行优化，结果显示：当体系中无Mg²⁺添加时，阳性与阴性样品在扩增结束后均保持了粉红色，无扩增(图1，a)；当体系中Mg²⁺为2μM时，仅有一份阳性样品扩增结束变成了亮黄色，说明该浓度下扩增反应不稳定(图1，b)；当体系中Mg²⁺为4μM和6μM时，阳性样本均实现了稳定有效扩增，阳性样品均呈现了亮黄色，而阴性样品保持了原来的粉红色(图1，c&d)。

实施例二：基于气溶素(aer)基因的致病性气单胞菌闭管可视化LAMP技术的灵敏度

以含有aer基因的阳性质粒为模板，进行10倍比稀释，终浓度分别为5.3，5.3×10^-1，5.3×10^-2，5.3×10^-3，5.3×10^-4，5.3×10^-5(ng/μL)，采用优化的LAMP反应体系和扩增程序进行LAMP反应。通过实时荧光LAMP方法和肉眼观察变化以判断所检测样品的结果。结果显示，前5个浓度梯度下，靶基因得到明显扩增(图1a中线1-5)，肉眼可见明显的颜色变化，即从阴性的粉红色到阳性亮黄色(图2b，管1-5)，结果表明，该方法的灵敏度为5.3×10^-4(ng/μL)。第6个稀释度样本的扩增曲线显示，扩增曲线没有达到平台期(图2a中的线6)，即产物量较少。与样本6的肉眼观察颜色变化不明显相吻合，即颜色变成橘黄色(介于粉红色和亮黄色之间)(图2b中管6)。阴性对照组(图2a中线7-8)没有明显扩增)，可视化结果中颜色保持了原来的粉红色(图2b中管7-8)。

实施例三：基于气溶素(aer)基因的致病性气单胞菌闭管可视化LAMP技术的特异性

选取16株病原菌(12株气单胞菌和4株非-气单胞菌)在优化的LAMP体系中测定其特异性。实时荧光LAMP扩增曲线检测结果显示：8株气单胞菌分别在15-30min(30-60循环)内扩增曲线达到了平台期(图3a，线1-7和线9)；2株气单胞菌则分别在40-50min(80-100循环)内扩增曲线达到了平台期(图3a，线11和线12)；其余2株气单胞菌(图3a，线8和线10)和4株非气单胞菌(图3a，线13-16)包括1株金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、1株副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)、1株绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)和1株肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)均在65min内未出现明显的扩增曲线(图3a)。这一结果与可视化结果相吻合，8株含有气溶素基因，反应后肉眼可见明显的颜色变化，即从阴性的粉红色到阳性亮黄色(图3b，管1-7和管9)；2株气单胞(图3b，管11和管12)反应后颜色变化与扩增曲线趋势一致，由粉红色变为橘黄色(介于粉红色和亮黄色之间)；其他2株气单胞菌(图3b，管8和管10)和4株非气单胞菌(图3b，管13-16)至反应结束则均保持了原始的粉红色。综上结果表明：12株气单胞菌中有10株含有aer基因，非气单胞菌中均未检测到aer基因。说明该方法特异性良好。

实施例四：人工感染试验后的样本检测

将鳗源致病性气单胞菌，划线接种于LB平板，28℃过夜培养，挑取单菌落于LB液体培养基中培养16～18h，参照国家标准(GB/T4789.2-2003)进行细菌计数，将菌液浓度调整为2×10⁸cfu/mL，10倍梯度稀释后，人工感染日本鳗鲡，鳗鲡规格(80±10)g，腹腔感染，分别在24h、36h和48h取样。

1)取临床症状明显的鳗鲡各6尾，解剖取病灶部位，分别取鳃、肝脏、肾脏等组织/器官。按照天根组织提取试剂盒方法提取组织DNA进行检测。结果显示：从24h开始就可以在鳃、肝脏、肾脏中检测出气溶素基因aer。

2)而外观健康的鳗鲡中采集相同的组织，按上述方法制备DNA模板进行LAMP检测。结果呈现阴性。

实施例五：临床样品检测

于福建省某养鳗场分别取表观正常与有明显发病症状(鳍条发红，腹部充血，红头，肝肿大充血)的鳗鲡分别为10尾和30尾，分别取其肝脏、肾脏等组织器官。按照实施例四的方法进行检测。结果显示：表观正常的10尾鳗鲡中均未检测到aer毒力基因；而在30尾具有明显症状的鳗鲡肝脏和肾脏部位，则均检测到了aer毒力基因。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

序列表

<110> 集美大学

<120> 基于LAMP法检测含Aer基因的气单胞菌的引物组及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

ggggagaaga gctccatcaa 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> (人工序列)

<400> 2

ctcaggctgt aggtatcggt 20

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> (人工序列)

<400> 3

tcttgaccag ctgcttgccg tcatataccc tggaacccga 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> (人工序列)

<400> 4

ccaatgcgac caactacacg gatggtggcc ttgtcgtact 40

Claims (5)

1.一种基于LAMP法检测含Aer基因的气单胞菌的引物组在制备闭管可视化环介导等温扩增技术检测含Aer基因的气单胞菌的试剂中的应用，其特征在于：引物序列具体如下：

F3：

5’-GGGGAGAAGAGCTCCATCAA-3’，

B3：

5’-CTCAGGCTGTAGGTRTCGGT-3’，

FIP：

5’-TCTTGACCAGCTGCTTGCCG-TCATATACCCTGGAACCCGA-3’，

BIP：

5’-CCAATGCGACCAACTACACSGA-TGGTGGCCTTGTCGTACT-3’。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述闭管可视化环介导等温扩增技术的反应体系：体积5-50μL，外引物:内引物的体积比为1:4-1:8；引物浓度范围：1-50μM。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：25μL反应体系：10×Buffer 2.5μL，外引物F3和B3各0.5μL，内引物FIP和BIP各4μL，20-100mM 4×dNTPs 1.4μL，模板2μL，Bst DNA合成酶1μL，苯酚红染料1μL，SYTO 9.0染料0.5-1μL，体系起始pH为7.5-9.5，超纯水加至25μL。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述10×Buffer：80-120μM(NH₄)₂SO₄，300-700μM KCl，60-120μM MgSO₄，0.1-1.5％Tween-20或Triton-100。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述闭管可视化环介导等温扩增技术的反应程序：在金属浴中63℃2-5min，60-75℃恒温45-65min，95℃3min，然后通过颜色变化肉眼判定扩增结果，粉红色为阴性，亮黄色为阳性；或在qPCR仪器上，进行63℃2-5min，63-73℃恒温运行25-65min收集荧光值，95℃3min，通过实时扩增曲线进行相对定量检测。

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