CN115786546A - 快速鉴别大熊猫病原菌的检测方法及其检测结果验证 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种快速鉴别大熊猫病原菌的检测方法及其检测结果验证，主要涉及大熊猫病原菌检测方法技术领域；本检测方法通过设计大肠杆菌phoA、肺炎克雷伯菌phoE和奇异变形杆菌ureR基因序列的特异性片段引物并进行PCR反应；若大熊猫病理样品中含有上述病原菌，则通过PCR反应能够扩增出相应的目的片段，然后通过凝胶电泳跑胶和凝胶成像系统对扩增出的产物进行检测，若在扩增出的产物中检测到三种病原菌对应指定大小的片段时，则证明大熊猫病理样品中含有该三种病原菌；通过多重PCR检测技术能够同时对大熊猫的该三种病原菌进行检测，该方法准确度高、操作简单、减少工作量且重复性好。
Description
技术领域
本发明涉及大熊猫病原菌检测方法技术领域，具体涉及一种快速鉴别大熊猫病原菌的检测方法及其检测结果验证。
背景技术
大熊猫(AiLuropoda meLanoLeuca)是我国特有的珍稀濒危动物，是世界生物多样性保护的旗舰种。随着近年来保护工作的不断加强深入，大熊猫种群数量和生活环境得到了巨大的改善。大熊猫疾病按病原分主要分为病毒性疾病、寄生虫性疾病、细菌性疾病，而细菌性疾病是引起大熊猫感染发病的重要因素。
大肠杆菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌均是临床中引起大熊猫感染发病的常见病原菌，常引起大熊猫腹泻、出血性肠炎、呼吸道感染、肺炎和尿路感染等症状。大肠杆菌感染大熊猫可导致大熊猫出现腹泻、肠炎等症状，据资料记载大肠杆菌O152血清型曾导致近20只大熊猫发生出血性肠炎而导致死亡；奇异变形杆菌可引发大熊猫泌尿生殖道感染出现血尿等症状，是引起雌性大熊猫繁殖障碍的重要原因；肺炎克雷伯菌可引起大熊猫腹泻、粪便带黏液或血液、败血症和泌尿生殖系统感染。目前在大熊猫细菌性疾病检测工作中，主要依赖的是传统的病原学检测方法，其检测周期长、步骤繁琐无法满足基层饲养单位对这些病原体的快速、准确的检测需求。
单重PCR具有检测快速、特异性高等优点，但该种检测方法通常只能针对单一病原菌进行检测，而临床样本常为复杂的混合病原感染，因此该检测方法存在一定的局限性。多重PCR，又称多重引物PCR，是指在一个反应体系里加入两对及以上的引物，同时扩增出多个核酸片段，也可加入多对病原的特异性引物用于同时检测多种病原体的一种PCR检测方法，该方法具有检测量大、准确和快速等优点。因此，如何依据多重PCR检测技术设计处一种快速有效且准确性高的鉴别大熊猫病原菌的方法，成为了本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
解决的技术问题
针对现有技术所存在的上述缺点，本发明提供了一种快速鉴别大熊猫病原菌的检测方法及其检测结果验证，旨在使其能够以多重PCR检测的技术对大熊猫致病细菌进行快速有效的检测和鉴别。
技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种快速鉴别大熊猫病原菌的检测方法，包括以下检测步骤：
S1、依据大肠杆菌(phoA)、奇异变形杆菌(ureR)和肺炎克雷伯菌(phoE)的基因序列，分别设计出3对特异性引物，所述特异性引物的序列分别为：
大肠杆菌特异性引物：
phoA-F：5'-CGTTTCTACCGCAGAGTTG-3'
phoA-R：5'-GTGACTATGACCAGCGTGTT-3'
奇异变形杆菌特异性引物：
ureR-F：5'-TACTTCAGCAATGTCTACCGC-3'
ureR-R：5'-CCCCATTCTGACATCCAAC-3'
肺炎克雷伯菌特异性引物：
phoE-F：5'-TAATGATGATGGGCTTTGTG-3'
phoE-R：5'-CGAAGAAGTCGGTGTTGC-3'；
S2、使用无菌试管收集大熊猫病理样本，经过细菌培养后获得增菌液，接着对增菌液的细菌进行提取DNA，并将提取的细菌DNA分装到不同的管体中备用；
S3、分别在用于PCR扩增反应的PCR管中加入12.5μL的2×Taq PCR Master Mix，然后加入指定量的S1中的六条特异性引物、S2中提取的大熊猫粪便样本中的细菌DNA 2μL和ddH2O 5.5μL，所得即为PCR扩增反应体系；
S4、将S3中装有PCR扩增反应体系的PCR管置入PCR仪内进行扩增，所得即为PCR产物；
S5、取5μL S4中的PCR产物点胶在2％的琼脂糖凝胶胶孔内，在150V的电压条件下电泳30min，电泳完成后使用凝胶成像系统观察结果。
更进一步地，所述S1中设计特异性引物的方式为：依据大肠杆菌(phoA)、奇异变形杆菌(ureR)和肺炎克雷伯菌(phoE)的基因序列，使用Primer5.0软件设计出需要检测基因片段两端的首尾引物。
更进一步地，所述S2中细菌培养的步骤为：
步骤1：使用无菌的生理盐水分别对大熊猫病理样本进行稀释，稀释10倍后使用接种环将稀释后的样本涂布在BHI琼脂培养基上，接着将接种后的BHI琼脂培养基置于37℃恒温培养箱中培养18-24h，并根据生长情况适当延长培养时间；
步骤2：用接种环挑取BHI琼脂培养基的菌落，并将挑取的菌落接种于同一个BHI液体培养基中，接种后于37℃振荡培养箱中培养24h，所得即为扩大培养后的增菌液。
更进一步地，所述S2中提取DNA的方法为：取2mL增菌液在12000rpm的条件下离心5min，移液枪吸去上清液后，使用生理盐水洗涤菌体沉淀，取1mL生理盐水重悬，震荡均匀后于沸水浴10min，立即放入-20℃冰箱中冰冻30min，室温溶解后离心取上清液，所得即为细菌DNA。
更进一步地，所述S3中六条特异性引物的浓度为0.2μmoL/L，且六条特异性引物的量分别为：引物phoA-F、引物phoA-R、引物phoE-F和引物phoE-R的量分别为1μL，引物ureR-F和引物ureR-R的量分别为0.5μL。
更进一步地，所述S4中的反应条件为：预变性95℃5min，变性95℃30S，退火60℃30S，延伸72℃40S，反应30个循环。
更进一步地，所述S5中在点胶时将Marker点在紧邻PCR产物的胶孔内。
一种快速鉴别大熊猫病原菌的检测方法的检测结果验证，包括以下验证步骤：
Step1、分别对大肠杆菌标准菌株ATCC25922、奇异变形杆菌标准菌株ATCC12453和肺炎克雷伯菌标准菌株ATCC700603进行扩大培养，接着按照细菌基因组提取试剂盒的具体操作步骤提取DNA，并将提取的DNA分别标即为大肠杆菌DNA、奇异变形杆菌DNA和肺炎克雷伯菌DNA；
Step2、分别在用于PCR扩增反应的PCR管中加入12.5μL的2×Taq PCR Master Mix和4.5μL ddH2O，所得即为预反应体系；
Step3、使用移液枪将Step1中的大肠杆菌DNA、奇异变形杆菌DNA和肺炎克雷伯菌DNA分别吸取2μL加入到不同的预反应体系中，分别标即为大肠杆菌体系、奇异变形杆菌体系和肺炎克雷伯菌体系，然后将Step1中的大肠杆菌DNA、奇异变形杆菌DNA和肺炎克雷伯菌DNA分别吸取2μL加入到同一预反应体系中，所得即为混合体系；
Step4、将大肠杆菌特异性引物各吸取1μL加入至大肠杆菌体系中，将奇异变形杆菌特异性引物各吸取1μL加入至奇异变形杆菌体系中，将肺炎克雷伯菌特异性引物各吸取1μL加入至肺炎克雷伯菌体系中，并且将六条特异性引物吸取1μL加入至混合体系中，混合均匀后将大肠杆菌体系、奇异变形杆菌体系、肺炎克雷伯菌体系和混合体系置于PCR仪内进行扩增，所得即为大肠杆菌产物、奇异变形杆菌产物、肺炎克雷伯菌产物和混合产物；
Step5、将大肠杆菌产物、奇异变形杆菌产物、肺炎克雷伯菌产物和混合产物点在2％的琼脂糖凝胶胶孔内，在150V的电压条件下电泳30min，电泳完成后使用凝胶成像系统观察结果。
更进一步地，所述Step4中六条特异性引物的浓度为0.2-0.6μmoL/L。
更进一步地，所述Step4中的反应条件为：预变性95℃5min，变性95℃30S，退火60℃30S，延伸72℃40S，反应30个循环。
有益效果
采用本发明提供的技术方案，与已知的公有技术相比，具有如下有益效果：
本发明提供的快速鉴别大熊猫病原菌的检测方法，分别针对大肠杆菌phoA、奇异变形杆菌ureR、肺炎克雷伯菌phoE和基因序列的特异性片段设计引物，若大熊猫病理样品中含有上述病原菌，则通过PCR反应能够扩增出相应的目的片段，然后通过凝胶电泳和凝胶成像系统能够对扩增出的产物进行检测，若在扩增出的产物中检测到三种病原菌对应指定大小的片段时，则证明大熊猫病理样品中含有该种病原菌；通过多重PCR检测技术能够同时对三种病原菌进行检测，该方法准确度高、操作简单、工作量较小且重复性好，能够为大熊猫细菌性疾病感染提供诊断，和临床用药提供依据，对促进大熊猫保护具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明中实施例1中大肠杆菌产物、奇异变形杆菌产物、肺炎克雷伯菌产物和混合产物的凝胶成像图；
图2为本发明的实施例2大肠杆菌产物、奇异变形杆菌产物和肺炎克雷伯菌产物的凝胶成像图；
图3为本发明的实施例1、2和3中Step5的混合产物的凝胶成像图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
本实施例的一种快速鉴别大熊猫病原菌的检测方法，包括以下检测步骤：
S1、依据大肠杆菌(phoA)、奇异变形杆菌(ureR)和肺炎克雷伯菌(phoE)的基因序列，分别设计出3对特异性引物，特异性引物的序列分别为：
大肠杆菌特异性引物：
phoA-F：5'-CGTTTCTACCGCAGAGTTG-3'
phoA-R：5'-GTGACTATGACCAGCGTGTT-3'
奇异变形杆菌特异性引物：
ureR-F：5'-TACTTCAGCAATGTCTACCGC-3'
ureR-R：5'-CCCCATTCTGACATCCAAC-3'
肺炎克雷伯菌特异性引物：
phoE-F：5'-TAATGATGATGGGCTTTGTG-3'
phoE-R：5'-CGAAGAAGTCGGTGTTGC-3'；
S2、使用无菌试管收集大熊猫病理样本，经过细菌培养后获得增菌液，接着对增菌液的细菌进行提取DNA，并将提取的细菌DNA分装到不同的管体中备用；
S3、分别在用于PCR扩增反应的PCR管中加入12.5μL的2×Taq PCR Master Mix，然后加入指定量的S1中的六条特异性引物、S2中提取的大熊猫粪便样本中的细菌DNA 2μL和ddH2O 5.5μL，所得即为PCR扩增反应体系；
S4、将S3中装有PCR扩增反应体系的PCR管置入PCR仪内进行扩增，所得即为PCR产物；
S5、取5μL S4中的PCR产物点胶在2％的琼脂糖凝胶胶孔内，在150V的电压条件下电泳30min，电泳完成后使用凝胶成像系统观察结果。
S1中设计特异性引物的方式为：依据大肠杆菌(phoA)、奇异变形杆菌(ureR)和肺炎克雷伯菌(phoE)的基因序列，使用Primer5.0软件设计出需要检测基因片段两端的首尾引物。
S2中细菌培养的步骤为：
步骤1：使用无菌的生理盐水分别对大熊猫病理样本进行稀释，稀释10倍后使用接种环将稀释后的样本涂布在BHI琼脂培养基上，接着将接种后的BHI琼脂培养基置于37℃恒温培养箱中培养18h，并根据生长情况适当延长培养时间；
步骤2：用接种环挑取BHI琼脂培养基的菌落，并将挑取的菌落接种于同一个BHI液体培养基中，接种后于37℃振荡培养箱中培养24h，所得即为扩大培养后的增菌液。
S2中提取DNA的方法为：取2mL增菌液在12000rpm的条件下离心5min，移液枪吸去上清液后，使用生理盐水洗涤菌体沉淀，取1mL生理盐水重悬，震荡均匀后于沸水浴10min，立即放入-20℃冰箱中冰冻30min，室温溶解后离心取上清液，所得即为细菌DNA。
S3中六条特异性引物的浓度为0.2μmoL/L，且六条特异性引物的量分别为：引物phoA-F、引物phoA-R、引物phoE-F和引物phoE-R的量分别为1μL，引物ureR-F和引物ureR-R的量分别为0.5μL。
S4中的反应条件为：预变性95℃5min，变性95℃30S，退火60℃30S，延伸72℃40S，反应30个循环。
S5中在点胶时将Marker点在紧邻PCR产物的胶孔内。
一种快速鉴别大熊猫病原菌的检测方法的检测结果验证，包括以下验证步骤：
Step1、分别对大肠杆菌标准菌株ATCC25922、奇异变形杆菌标准菌株ATCC12453和肺炎克雷伯菌标准菌株ATCC700603进行扩大培养，接着按照细菌基因组提取试剂盒的具体操作步骤提取DNA，并将提取的DNA分别标即为大肠杆菌DNA、奇异变形杆菌DNA和肺炎克雷伯菌DNA；
Step2、分别在用于PCR扩增反应的PCR管中加入12.5μL的2×Taq PCR Master Mix和4.5μL ddH2O，所得即为预反应体系；
Step3、使用移液枪将Step1中的大肠杆菌DNA、奇异变形杆菌DNA和肺炎克雷伯菌DNA分别吸取2μL加入到不同的预反应体系中，分别标即为大肠杆菌体系、奇异变形杆菌体系和肺炎克雷伯菌体系，然后将Step1中的大肠杆菌DNA、奇异变形杆菌DNA和肺炎克雷伯菌DNA分别吸取2μL加入到同一预反应体系中，所得即为混合体系；
Step4、将大肠杆菌特异性引物各吸取1μL加入至大肠杆菌体系中，将奇异变形杆菌特异性引物各吸取1μL加入至奇异变形杆菌体系中，将肺炎克雷伯菌特异性引物各吸取1μL加入至肺炎克雷伯菌体系中，并且将六条特异性引物吸取1μL加入至混合体系中，混合均匀后将大肠杆菌体系、奇异变形杆菌体系、肺炎克雷伯菌体系和混合体系置于PCR仪内进行扩增，所得即为大肠杆菌产物、奇异变形杆菌产物、肺炎克雷伯菌产物和混合产物；
Step5、将大肠杆菌产物、奇异变形杆菌产物、肺炎克雷伯菌产物和混合产物点在2％的琼脂糖凝胶胶孔内，在150V的电压条件下电泳30min，电泳完成后使用凝胶成像系统观察结果。
Step4中六条特异性引物的浓度为0.2μmoL/L。
Step4中的反应条件为：预变性95℃5min，变性95℃30S，退火60℃30S，延伸72℃40S，反应30个循环。
实施例2
本实施例的一种快速鉴别大熊猫病原菌的检测方法，包括以下检测步骤：
S1、依据大肠杆菌(phoA)、奇异变形杆菌(ureR)和肺炎克雷伯菌(phoE)的基因序列，分别设计出3对特异性引物，特异性引物的序列分别为：
大肠杆菌特异性引物：
phoA-F：5'-CGTTTCTACCGCAGAGTTG-3'
phoA-R：5'-GTGACTATGACCAGCGTGTT-3'
奇异变形杆菌特异性引物：
ureR-F：5'-TACTTCAGCAATGTCTACCGC-3'
ureR-R：5'-CCCCATTCTGACATCCAAC-3'
肺炎克雷伯菌特异性引物：
phoE-F：5'-TAATGATGATGGGCTTTGTG-3'
phoE-R：5'-CGAAGAAGTCGGTGTTGC-3'；
S2、使用无菌试管收集大熊猫病理样本，经过细菌培养后获得增菌液，接着对增菌液的细菌进行提取DNA，并将提取的细菌DNA分装到不同的管体中备用；
S3、分别在用于PCR扩增反应的PCR管中加入12.5μL的2×Taq PCR Master Mix，然后加入指定量的S1中的六条特异性引物、S2中提取的大熊猫粪便样本中的细菌DNA 2μL和ddH2O 5.5μL，所得即为PCR扩增反应体系；
S4、将S3中装有PCR扩增反应体系的PCR管置入PCR仪内进行扩增，所得即为PCR产物；
S5、取5μL S4中的PCR产物点胶在2％的琼脂糖凝胶胶孔内，在150V的电压条件下电泳30min，电泳完成后使用凝胶成像系统观察结果。
S1中设计特异性引物的方式为：依据大肠杆菌(phoA)、奇异变形杆菌(ureR)和肺炎克雷伯菌(phoE)的基因序列，使用Primer5.0软件设计出需要检测基因片段两端的首尾引物。
S2中细菌培养的步骤为：
步骤1：使用无菌的生理盐水分别对大熊猫病理样本进行稀释，稀释10倍后使用接种环将稀释后的样本涂布在BHI琼脂培养基上，接着将接种后的BHI琼脂培养基置于37℃恒温培养箱中培养20h，并根据生长情况适当延长培养时间；
步骤2：用接种环挑取BHI琼脂培养基的菌落，并将挑取的菌落接种于同一个BHI液体培养基中，接种后于37℃振荡培养箱中培养24h，所得即为扩大培养后的增菌液。
S2中提取DNA的方法为：取2mL增菌液在12000rpm的条件下离心5min，移液枪吸去上清液后，使用生理盐水洗涤菌体沉淀，取1mL生理盐水重悬，震荡均匀后于沸水浴10min，立即放入-20℃冰箱中冰冻30min，室温溶解后离心取上清液，所得即为细菌DNA。
S3中六条特异性引物的浓度为0.2μmoL/L，且六条特异性引物的量分别为：引物phoA-F、引物phoA-R、引物phoE-F和引物phoE-R的量分别为1μL，引物ureR-F和引物ureR-R的量分别为0.5μL。
S4中的反应条件为：预变性95℃5min，变性95℃30S，退火60℃30S，延伸72℃40S，反应30个循环。
S5中在点胶时将Marker点在紧邻PCR产物的胶孔内。
一种快速鉴别大熊猫病原菌的检测方法的检测结果验证，包括以下验证步骤：
Step1、分别对大肠杆菌标准菌株ATCC25922、奇异变形杆菌标准菌株ATCC12453和肺炎克雷伯菌标准菌株ATCC700603进行扩大培养，接着按照细菌基因组提取试剂盒的具体操作步骤提取DNA，并将提取的DNA分别标即为大肠杆菌DNA、奇异变形杆菌DNA和肺炎克雷伯菌DNA；
Step2、分别在用于PCR扩增反应的PCR管中加入12.5μL的2×Taq PCR Master Mix和4.5μL ddH2O，所得即为预反应体系；
Step3、使用移液枪将Step1中的大肠杆菌DNA、奇异变形杆菌DNA和肺炎克雷伯菌DNA分别吸取2μL加入到不同的预反应体系中，分别标即为大肠杆菌体系、奇异变形杆菌体系和肺炎克雷伯菌体系，然后将Step1中的大肠杆菌DNA、奇异变形杆菌DNA和肺炎克雷伯菌DNA分别吸取2μL加入到同一预反应体系中，所得即为混合体系；
Step4、将大肠杆菌特异性引物各吸取1μL加入至大肠杆菌体系中，将奇异变形杆菌特异性引物各吸取1μL加入至奇异变形杆菌体系中，将肺炎克雷伯菌特异性引物各吸取1μL加入至肺炎克雷伯菌体系中，并且将六条特异性引物吸取1μL加入至混合体系中，混合均匀后将大肠杆菌体系、奇异变形杆菌体系、肺炎克雷伯菌体系和混合体系置于PCR仪内进行扩增，所得即为大肠杆菌产物、奇异变形杆菌产物、肺炎克雷伯菌产物和混合产物；
Step5、将大肠杆菌产物、奇异变形杆菌产物、肺炎克雷伯菌产物和混合产物点在2％的琼脂糖凝胶胶孔内，在150V的电压条件下电泳30min，电泳完成后使用凝胶成像系统观察结果。
Step4中六条特异性引物的浓度为0.4μmoL/L。
Step4中的反应条件为：预变性95℃5min，变性95℃30S，退火60℃30S，延伸72℃40S，反应30个循环。
实施例3
本实施例的一种快速鉴别大熊猫病原菌的检测方法，包括以下检测步骤：
S1、依据大肠杆菌(phoA)、奇异变形杆菌(ureR)和肺炎克雷伯菌(phoE)的基因序列，分别设计出3对特异性引物，特异性引物的序列分别为：
大肠杆菌特异性引物：
phoA-F：5'-CGTTTCTACCGCAGAGTTG-3'
phoA-R：5'-GTGACTATGACCAGCGTGTT-3'
奇异变形杆菌特异性引物：
ureR-F：5'-TACTTCAGCAATGTCTACCGC-3'
ureR-R：5'-CCCCATTCTGACATCCAAC-3'
肺炎克雷伯菌特异性引物：
phoE-F：5'-TAATGATGATGGGCTTTGTG-3'
phoE-R：5'-CGAAGAAGTCGGTGTTGC-3'；
S2、使用无菌试管收集大熊猫病理样本，经过细菌培养后获得增菌液，接着对增菌液的细菌进行提取DNA，并将提取的细菌DNA分装到不同的管体中备用；
S3、分别在用于PCR扩增反应的PCR管中加入12.5μL的2×Taq PCR Master Mix，然后加入指定量的S1中的六条特异性引物、S2中提取的大熊猫粪便样本中的细菌DNA 2μL和ddH2O 5.5μL，所得即为PCR扩增反应体系；
S4、将S3中装有PCR扩增反应体系的PCR管置入PCR仪内进行扩增，所得即为PCR产物；
S5、取5μLS4中的PCR产物点胶在2％的琼脂糖凝胶胶孔内，在150V的电压条件下电泳30min，电泳完成后使用凝胶成像系统观察结果。
S1中设计特异性引物的方式为：依据大肠杆菌(phoA)、奇异变形杆菌(ureR)和肺炎克雷伯菌(phoE)的基因序列，使用Primer5.0软件设计出需要检测基因片段两端的首尾引物。
S2中细菌培养的步骤为：
步骤1：使用无菌的生理盐水分别对大熊猫病理样本进行稀释，稀释10倍后使用接种环将稀释后的样本涂布在BHI琼脂培养基上，接着将接种后的BHI琼脂培养基置于37℃恒温培养箱中培养24h，并根据生长情况适当延长培养时间；
步骤2：用接种环挑取BHI琼脂培养基的菌落，并将挑取的菌落接种于同一个BHI液体培养基中，接种后于37℃振荡培养箱中培养24h，所得即为扩大培养后的增菌液。
S2中提取DNA的方法为：取2mL增菌液在12000rpm的条件下离心5min，移液枪吸去上清液后，使用生理盐水洗涤菌体沉淀，取1mL生理盐水重悬，震荡均匀后于沸水浴10min，立即放入-20℃冰箱中冰冻30min，室温溶解后离心取上清液，所得即为细菌DNA。
S3中六条特异性引物的浓度为0.2μmoL/L，且六条特异性引物的量分别为：引物phoA-F、引物phoA-R、引物phoE-F和引物phoE-R的量分别为1μL，引物ureR-F和引物ureR-R的量分别为0.5μL。
S4中的反应条件为：预变性95℃5min，变性95℃30S，退火60℃30S，延伸72℃40S，反应30个循环。
S5中在点胶时将Marker点在紧邻PCR产物的胶孔内。
一种快速鉴别大熊猫病原菌的检测方法的检测结果验证，包括以下验证步骤：
Step1、分别对大肠杆菌标准菌株ATCC25922、奇异变形杆菌标准菌株ATCC12453和肺炎克雷伯菌标准菌株ATCC700603进行扩大培养，接着按照细菌基因组提取试剂盒的具体操作步骤提取DNA，并将提取的DNA分别标即为大肠杆菌DNA、奇异变形杆菌DNA和肺炎克雷伯菌DNA；
Step2、分别在用于PCR扩增反应的PCR管中加入12.5μL的2×Taq PCR Master Mix和4.5μL ddH2O，所得即为预反应体系；
Step3、使用移液枪将Step1中的大肠杆菌DNA、奇异变形杆菌DNA和肺炎克雷伯菌DNA分别吸取2μL加入到不同的预反应体系中，分别标即为大肠杆菌体系、奇异变形杆菌体系和肺炎克雷伯菌体系，然后将Step1中的大肠杆菌DNA、奇异变形杆菌DNA和肺炎克雷伯菌DNA分别吸取2μL加入到同一预反应体系中，所得即为混合体系；
Step4、将大肠杆菌特异性引物各吸取1μL加入至大肠杆菌体系中，将奇异变形杆菌特异性引物各吸取1μL加入至奇异变形杆菌体系中，将肺炎克雷伯菌特异性引物各吸取1μL加入至肺炎克雷伯菌体系中，并且将六条特异性引物吸取1μL加入至混合体系中，混合均匀后将大肠杆菌体系、奇异变形杆菌体系、肺炎克雷伯菌体系和混合体系置于PCR仪内进行扩增，所得即为大肠杆菌产物、奇异变形杆菌产物、肺炎克雷伯菌产物和混合产物；
Step5、将大肠杆菌产物、奇异变形杆菌产物、肺炎克雷伯菌产物和混合产物点在2％的琼脂糖凝胶胶孔内，在150V的电压条件下电泳30min，电泳完成后使用凝胶成像系统观察结果。
Step4中六条特异性引物的浓度为0.6μmoL/L。
Step4中的反应条件为：预变性95℃5min，变性95℃30S，退火60℃30S，延伸72℃40S，反应30个循环。
凝胶成像：
在凝胶成像的过程中，先将TAE缓冲液导入指定的凝胶电泳槽内，接着将带有含0.5ug/mL的溴化乙锭的琼脂糖凝胶放入凝胶电泳槽中，然后将Marker和混有溴酚蓝的PCR产物点入相邻的胶孔内，点胶结束后打开凝胶电泳槽的电源使其开始跑胶工作，跑胶结束后将跑好的琼脂糖凝胶放入紫外成像仪器中进行凝胶成像。
将实施例1中Step5中奇异变形杆菌产物、肺炎克雷伯菌产物、大肠杆菌产物和混合产物跑胶后的凝胶成像图分别标记为1、2、3和4，将Marker标记为M，所得凝胶成像图如图1所示。图1中，凝胶内包含有三条大小不同的条带，其中666bp条带指扩增出的大肠杆菌基因片段、308bp条带指扩增出的奇异变形杆菌片段，456bp条带指扩增出的肺炎克雷伯菌片段。
将实施例2中Step5中奇异变形杆菌产物、肺炎克雷伯菌产物和大肠杆菌产物跑胶后的凝胶成像图分别标记为1、2和3，将Marker标记为M，所得凝胶成像图如图2所示。图2中，凝胶内包含有三条大小不同的带，其中666bp条带指扩增出的大肠杆菌基因片段、308bp条带指扩增出的奇异变形杆菌片段，456bp条带指扩增出的肺炎克雷伯菌片段。
分别将实施例1、2和3中Step5的混合产物跑胶后的凝胶成像图分别标记为1、2和3，将Marker标记为M，所得凝胶成像图如图3所示。图3中，凝胶内包含有三条大小不同的条带，其中666bp条带指扩增出的大肠杆菌基因片段、308bp条带指扩增出的奇异变形杆菌片段，456bp条带指扩增出的肺炎克雷伯菌片段。
临床样本检测
按照一种快速鉴别大熊猫病原菌的检测方法中的检测步骤对送检的100份大熊猫粪便样本进行单重PCR检测、多重PCR检测和病原学检测，在100份样本中检出大肠杆菌，检出率为100％；在30份样本中检测出奇异变形杆菌，检出率为30％；在90份样本中检测出肺炎克雷伯菌，检出率为90％。
单重PCR检测的方法：将一种快速鉴别大熊猫病原菌的检测方法中的检测步骤S3中的六条特异性引物更改为一对首位引物，即在扩增过程中的每个PCR扩增反应体系中仅加入一对首位引物，100份大熊猫粪便样本的单重PCR检测对应了300份PCR扩增反应体系。其中，加入引物phoA-F和引物phoA-R的100份PCR扩增反应体系中检测出100份666bp的条带；加入引物引物phoE-F和引物phoE-R的100份PCR扩增反应体系中检测出90份456bp的条带；加入引物ureR-F和引物ureR-R的100份PCR扩增反应体系中检测出30份308bp的条带。
多重PCR检测的方法：具体步骤与一种快速鉴别大熊猫病原菌的检测方法中的检测步骤一直，100份大熊猫粪便样本的单重PCR检测对应了100份PCR扩增反应体系，其中，每个体系中均检到了666bp的条带，100份PCR扩增反应体系中90份中检出了456bp的条带，100份PCR扩增反应体系中30份中检出了308bp的条带。
病原学检测：通过其他病原学检测方法对送检的100份大熊猫粪便样本进行检测，检测结果表明，在每份大熊猫粪便样本中检测到了大肠杆菌，在100份大熊猫粪便样本中的90份中检测到了肺炎克雷伯菌，在100份大熊猫粪便样本中的30份中检测到了奇异变形杆菌。
上述检测结果记录于下表：
通过上表可知，通过单重PCR、多重PCR和病原学检测的三种检测结果之间相符合，说明本发明中用多重PCR的方式检测大熊猫病理样本中病原菌的方法检测结果较为准确，而且本发明的方法相较于其他方法而言可同时对多种病原菌进行检测，具有极佳的推广价值。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不会使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种快速鉴别大熊猫病原菌的检测方法，其特征在于，包括以下检测步骤：
S1、依据大肠杆菌(phoA)、奇异变形杆菌(ureR)和肺炎克雷伯菌(phoE)的基因序列，分别设计出3对特异性引物，所述特异性引物的序列分别为：
大肠杆菌特异性引物：
phoA-F：5'-CGTTTCTACCGCAGAGTTG-3'
phoA-R：5'-GTGACTATGACCAGCGTGTT-3'
奇异变形杆菌特异性引物：
ureR-F：5'-TACTTCAGCAATGTCTACCGC-3'
ureR-R：5'-CCCCATTCTGACATCCAAC-3'
肺炎克雷伯菌特异性引物：
phoE-F：5'-TAATGATGATGGGCTTTGTG-3'
phoE-R：5'-CGAAGAAGTCGGTGTTGC-3'；
S2、使用无菌试管收集大熊猫病理样本，经过细菌培养后获得增菌液，接着对增菌液的细菌进行提取DNA，并将提取的细菌DNA分装到不同的管体中备用；
S3、分别在用于PCR扩增反应的PCR管中加入12.5μL的2×Taq PCR Master Mix，然后加入指定量的S1中的六条特异性引物、S2中提取的大熊猫粪便样本中的细菌DNA 2μL和ddH2O5.5μL，所得即为PCR扩增反应体系；
S4、将S3中装有PCR扩增反应体系的PCR管置入PCR仪内进行扩增，所得即为PCR产物；
S5、取5μL S4中的PCR产物点胶在2％的琼脂糖凝胶胶孔内，在150V的电压条件下电泳30min，电泳完成后使用凝胶成像系统观察结果。
2.根据权利要求1所述的一种快速鉴别大熊猫病原菌的检测方法，其特征在于，所述S1中设计特异性引物的方式为：依据大肠杆菌(phoA)、奇异变形杆菌(ureR)和肺炎克雷伯菌(phoE)的基因序列，使用Primer5.0软件设计出需要检测基因片段两端的首尾引物。
3.根据权利要求1所述的一种快速鉴别大熊猫病原菌的检测方法，其特征在于，所述S2中细菌培养的步骤为：
步骤1：使用无菌的生理盐水分别对大熊猫病理样本进行稀释，稀释10倍后使用接种环将稀释后的样本涂布在BHI琼脂培养基上，接着将接种后的BHI琼脂培养基置于37℃恒温培养箱中培养18-24h，并根据生长情况适当延长培养时间；
步骤2：用接种环挑取BHI琼脂培养基的菌落，并将挑取的菌落接种于同一个BHI液体培养基中，接种后于37℃振荡培养箱中培养24h，所得即为扩大培养后的增菌液。
4.根据权利要求1所述的一种快速鉴别大熊猫病原菌的检测方法，其特征在于，所述S2中提取DNA的方法为：取2mL增菌液在12000rpm的条件下离心5min，移液枪吸去上清液后，使用生理盐水洗涤菌体沉淀，取1mL生理盐水重悬，震荡均匀后于沸水浴10min，立即放入-20℃冰箱中冰冻30min，室温溶解后离心取上清液，所得即为细菌DNA。
5.根据权利要求1所述的一种快速鉴别大熊猫病原菌的检测方法，其特征在于，所述S3中六条特异性引物的浓度为0.2μmoL/L，且六条特异性引物的量分别为：引物phoA-F、引物phoA-R、引物phoE-F和引物phoE-R的量分别为1μL，引物ureR-F和引物ureR-R的量分别为0.5μL。
6.根据权利要求1所述的一种快速鉴别大熊猫病原菌的检测方法，其特征在于，所述S4中的反应条件为：预变性95℃5min，变性95℃30S，退火60℃30S，延伸72℃40S，反应30个循环。
7.根据权利要求1所述的一种快速鉴别大熊猫病原菌的检测方法，其特征在于，所述S5中在点胶时将Marker点在紧邻PCR产物的胶孔内。
8.一种快速鉴别大熊猫病原菌的检测方法的检测结果验证，其特征在于，包括以下验证步骤：
Step1、分别对大肠杆菌标准菌株ATCC25922、奇异变形杆菌标准菌株ATCC12453和肺炎克雷伯菌标准菌株ATCC700603进行扩大培养，接着按照细菌基因组提取试剂盒的具体操作步骤提取DNA，并将提取的DNA分别标即为大肠杆菌DNA、奇异变形杆菌DNA和肺炎克雷伯菌DNA；
Step2、分别在用于PCR扩增反应的PCR管中加入12.5μL的2×Taq PCR Master Mix和4.5μL ddH2O，所得即为预反应体系；
Step3、使用移液枪将Step1中的大肠杆菌DNA、奇异变形杆菌DNA和肺炎克雷伯菌DNA分别吸取2μL加入到不同的预反应体系中，分别标即为大肠杆菌体系、奇异变形杆菌体系和肺炎克雷伯菌体系，然后将Step1中的大肠杆菌DNA、奇异变形杆菌DNA和肺炎克雷伯菌DNA分别吸取2μL加入到同一预反应体系中，所得即为混合体系；
Step4、将大肠杆菌特异性引物各吸取1μL加入至大肠杆菌体系中，将奇异变形杆菌特异性引物各吸取1μL加入至奇异变形杆菌体系中，将肺炎克雷伯菌特异性引物各吸取1μL加入至肺炎克雷伯菌体系中，并且将六条特异性引物吸取1μL加入至混合体系中，混合均匀后将大肠杆菌体系、奇异变形杆菌体系、肺炎克雷伯菌体系和混合体系置于PCR仪内进行扩增，所得即为大肠杆菌产物、奇异变形杆菌产物、肺炎克雷伯菌产物和混合产物；
Step5、将大肠杆菌产物、奇异变形杆菌产物、肺炎克雷伯菌产物和混合产物点在2％的琼脂糖凝胶胶孔内，在150V的电压条件下电泳30min，电泳完成后使用凝胶成像系统观察结果。
9.根据权利要求1所述的一种快速鉴别大熊猫病原菌的检测方法的检测结果验证，其特征在于，所述Step4中六条特异性引物的浓度为0.2-0.6μmoL/L。
10.根据权利要求1所述的一种快速鉴别大熊猫病原菌的检测方法的检测结果验证，其特征在于，所述Step4中的反应条件为：预变性95℃5min，变性95℃30S，退火60℃30S，延伸72℃40S，反应30个循环。
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