CN113621727A - 5种病原菌多重pcr检测的引物、探针及其试剂盒 - Google Patents
5种病原菌多重pcr检测的引物、探针及其试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及5种病原菌多重PCR检测的引物、探针及其试剂盒。本发明引物探针支持高通量检测，可快速实现金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌和念珠菌五种病原菌的联合检测，准确高、特异性好。根据目标病原体的定量/半定量检测结果，可实时、快速监测血流感染患者体内的特定病原体的变化，及时评估患者状况，能有效地起到准确诊断这些病原体，做到早发现、早预防、早治疗、早控制，为临床医生提供辅助治疗建议，如合理选择使用抗菌药物，以减少医院感染机会，在科研领域和临床上具有极高的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及5种病原菌多重PCR检测的引物、 探针及其试剂盒。
背景技术
血流感染(blood stream infection,BSI)是指各种病原微生物侵入血液循环，在血液中繁殖，释放毒素及代谢产物，并诱导细胞因子释放，引起全身炎症 反应综合征，进一步导致血压下降、感染性休克、凝血及纤溶系统改变，最 终引起全身多器官功能不全，是一种严重的全身感染。入侵血液的病原体主 要为细菌、真菌以及霉菌。细菌(包括G-阴性菌和G+阳性菌)仍是主要的病 原微生物，据CHINET 2020数据显示，临床血液标本分离菌的主要细菌依次 为大肠埃希菌(23.18％)、肺炎克雷伯菌(16.51％)、表皮葡萄球菌(8.39％)、金黄色葡萄球菌(7.90％)、人葡萄球菌(6.18％)、屎肠球菌(3.95％)、铜绿 假单胞菌(3.32％)、鲍曼不动杆菌(2.95％)、粪肠球菌(2.55％)、阴沟肠杆菌 (2.27％)、头状葡萄球菌(2.21％)和溶血葡萄球菌(1.80％)。其中G-阴性菌仍然 是主要入侵菌种，大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆 菌共占比45.86％，G+阳性菌中表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌 和肠球菌共占比28.97％。
葡萄球菌属共包括30多个种，根据是否产生游离的血浆凝固酶分为血浆 凝固酶阳性和血浆凝固酶阴性葡萄球菌(coagulase-negative Staphylocoeei，CNS) 两大群。前者以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为代表，金黄色葡萄球 菌广泛分布于自然界和医院环境中，是一种常见的致病菌，在20％的正常人 鼻腔中存在金黄色葡萄球菌的长期定植，30％的人可间断携带该菌，金黄色 葡萄球菌的定植是其引起感染的一个主要危险因素。该菌可引起从浅表的皮 肤、软组织感染到肺感染、败血症等毒素参与的多种感染性疾病。金黄色葡 萄球菌是引起血流感染的重要病原菌，在过去十几年中由金黄色葡萄球菌引 起的菌血症的发生率不断增加，CHINET 2020数据显示血流感染中金黄色葡 萄球菌占比7.90％。凝固酶阴性葡萄球菌是定居在人体皮肤和黏膜表面的正常 菌群。1971年，Holt首先报道了CNS导致的败血症。随着介入性诊疗技术的 广泛应用，侵袭性诊疗操作所引起的导管相关性静脉炎、导管相关性软组织 炎、导管相关性菌血症，气管插管相关性感染，导尿相关性感染、内窥镜及 腹腔镜相关性感染等原因，由凝固酶阴性葡萄球菌引起的各种导管相关性感 染等报道逐渐增多。虽然CNS感染主要是由表皮葡萄球菌所致，但其他的一 些菌属如人型葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、华纳葡萄球菌等亦已经被证实与 人类感染有关。CHINET 2020数据显示血流感染中表皮葡萄球菌、人葡萄球 菌、头状葡萄球菌和溶血葡萄球菌共占比18.58％。
肠球菌是革兰阳性球菌，属于链球菌科，是存在于人类肠道的正常菌群。 它是一种条件致病菌，不仅可引起泌尿系、皮肤软组织感染，还可导致菌血 症、心内膜炎、脑膜炎等严重感染。其中对人类致病的肠球菌主要为粪肠球 菌和屎肠球菌，约90％以上的肠球菌感染是由粪肠球菌和屎肠球菌引起。近 年来随着抗菌药物的广泛应用，肠球菌引起的医院感染呈逐渐上升趋势，其 成为最常见医院感染菌之一。CHINET 2020数据显示血流感染中粪肠球菌和 屎肠球菌共占比6.5％。
侵袭性真菌包括念珠菌、曲霉、隐球菌、毛孢子等，近年来侵袭性真菌 感染呈明显增多趋势。念珠菌血流感染为住院患者最常见的侵袭性真菌病， 在美国，念珠菌已经成为院内感染中排列第4的病原菌。在国内医院感染病 例中，念珠菌血流感染占有相当的比率，而且有逐年上升的趋势。念珠菌属 于条件致病菌，广泛存在于正常人的皮肤、黏膜，属正常菌群，但当机体免 疫力低下、营养不良、侵入性操作和长期广谱抗生素使用的条件下易引起念 珠菌继发感染。一旦发生念珠菌血流感染，则病死率高，住院时间延长、费 用增加，危害极大。针对念珠菌的临床工作因此显得越来越重要。
血培养被认为是血流感染诊断的金标准，但是一次培养至少需要12～48 h，阳性率低(仅50％左右)即阴性也不能被排除感染，所以快速简便的诊断方 法成为研究热点。有研究显示，早期诊断和合理治疗对于改善血流感染特别 是脓毒症患者治疗效果影响巨大。开始治疗的时间延误得越久，患者存活的 机会将会大大下降。如果患者在诊断的第一个小时内就接受抗生素治疗，其 生存机会接近80％；此后每隔一小时下降7.6％，延迟治疗6个小时，死亡 率便会达到58％。然而，如果患者一开始接受了不当的抗生素治疗，其生存 机会可能会下降五倍。而早期抗真菌治疗往往被忽视，甚至血培养阳性后48h 才开始抗真菌治疗，治疗延误是医院内死亡的独立危险因素，病死率显著增 加1.5～2倍。
随着分子生物学的发展，分子生物学技术在微生物领域的应用，特别是 荧光定量PCR和数字PCR检测技术平台的出现后，越来越广泛。数字PCR 技术是在qPCR技术上发展起来的第三代PCR技术，理论上可以实现对单个 拷贝的目标核酸片段进行扩增检测，是当前灵敏度最高的核酸检测技术。利 用多色荧光数字PCR平台，结合不同荧光标记水解探针的应用，可以同时对 多个目标片段进行检测。然而如何将数字PCR技术有效的应用于多种血流感 染病原体的检测仍是本领域技术人员亟需克服的难题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了5种病原菌多重PCR检测的引物、探针及其试 剂盒，可快速实现金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠 球菌和念珠菌五种病原菌的联合检测，准确高、灵敏度高、特异性好。为了 实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
用于检测金黄色葡萄球菌的SEQ ID NO：1～2所示核苷酸序列的引物和 SEQ IDNO：3所示核苷酸序列的探针；
用于检测凝固酶阴性葡萄球菌的SEQ ID NO：4～5所示核苷酸序列的引物 和SEQID NO：6所示核苷酸序列的探针；
用于检测屎肠球菌的SEQ ID NO：7～8所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的探针；
用于检测粪肠球菌的SEQ ID NO：10～11所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的探针；和
用于检测念珠菌的SEQ ID NO：13～14所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO：15所示核苷酸序列的探针。
与上述核苷酸序列具有90％以上(例如92％、94％、96％或98％等)同 源性且功能相同的核苷酸序列变体，均在本发明的保护范围之内。
本发明引物探针针对金黄色葡萄球菌sa256基因、凝固酶阴性葡萄球菌 Tuf基因、屎肠球菌L78127基因、粪肠球菌sodA基因和念珠菌28srRNA基 因的特定保守区域设计而成，可实现五种病原菌的联合检测，检测结果准确 可靠、灵敏度较高，适用于中国人群的筛查，能有效地起到准确诊断、耐药 溯源、耐药控制等作用，从而减少抗生素使用量，降低耐药产生，在科研领 域和临床上具有极高的应用价值。
基于以上结果，本发明还提供了所述的引物、探针组在制备金黄色葡萄 球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌和念珠菌多重检测的试剂 盒中的应用。
本发明还提供了5种病原菌多重检测的试剂盒，包括本发明所述的引物、 探针组。
本发明试剂盒还包括检测试剂和核酸提取试剂。
本发明中，检测试剂用于PCR扩增，核酸提取试剂用于提取待测样本的核 酸，本发明对检测试剂和核酸提取试剂的具体组成和来源没有特殊限制，可 购自任意厂家。本发明具体实施例中，检测试剂包括无菌水和PCR Mix，包括 但不仅限于此，核酸提取试剂为市售天根DP710试剂盒。
本发明还提供了5种病原菌多重PCR检测的方法，利用本发明引物探针组 或本发明试剂盒进行检测。
本发明检测方法基于多重荧光PCR或多重数字PCR平台进行检测。
“多重数字PCR”是指在同一数字PCR反应体系里加上两对或两对以上引 物，同时扩增出多个核酸片段的数字PCR反应。将多重PCR技术与数字PCR技 术有机结合而形成的多重数字PCR，根据DNA探针不同荧光度、DNA扩增不 同循环数及多种标记荧光同时使用，便可大幅提高数字PCR多重性，多重性可 达20-50以上，即同时在一个PCR反应单元内进行20-50个以上的数字PCR反 应。
本发明基于多重数字PCR平台的检测方法包括以下步骤：
(1)提取待测样本核酸；
(2)配置数字PCR反应液；
(3)制备液滴芯片；
(4)运行液滴芯片扩增程序后，采用生物芯片阅读仪进行分析后报告输 出。
本发明中，所述待测样本为感染患者血浆样本或无症状定植者肛肠试子 样本。
本发明步骤(4)中，所述扩增程序包括：95℃预变性5min；95℃变性15 秒，60℃退火30秒，循环40次。
利用本发明引物探针可快速实现金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、 屎肠球菌、粪肠球菌和念珠菌五种病原菌的联合检测，该方法操作简单、快 速、高效、具有较高的灵敏度、特异性。主要体现以下几个方面：
l、实验操作流程相对简单，只需按规定加样即可进行反应，自动生成结 果，无需后续操作。
2、整个操作仅需2-3小时，相对其他的诊断方法，如血培养、组织病理学 等，大大节省了检测时间，为临床早期诊断提供了有力的保证。
3、数字PCR反应在密闭体系中完成扩增，利用荧光信号积累实时监测整 个PCR进程，无需凝胶电泳，因此降低了污染可能。
4、本检测方法最低能检测到50个拷贝的基因，即50各拷贝/ml，具有较 高的敏感性。
5、通过设计特异性引物保证本方法具有较高的特异性，针对这些菌的引 物探针与其它真菌及细菌等无交叉阳性反应。
除上述之外，该检测方法还可对菌含量进行定量检测，弥补了诊断难定 量或定量结果不精确的缺点。通过该检测特点有望解决一些长期困扰临床诊 断和治疗方面的问题。例如，部分真菌属人类的正常菌群之一，传统的培养 方法往往很难区别是真菌定植状态还是感染状态，给临床诊断和治疗带来了 麻烦。通过数字PCR定量检测有助于查找、判断真菌正常定植和感染的临界点。 此外，通过此方法可连续性对同一患者的阳性标本进行跟踪，以了解药物在 治疗过程中的疗效观察，同时也可为临床疾病的转归提供重要参考。
具体实施方式
本发明提供了5种病原菌多重PCR检测的引物、探针及其试剂盒。本领 域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是， 所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为 包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关 人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改 动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1本发明引物探针
本实施例涉及的引物组合序列如表1所示。
表1引物探针组合序列
实施例2本发明检测方法
实验流程如下：
血浆样本核酸提取→配置数字PCR反应液→液滴芯片生成→扩增→阅读 →结果分析与报告输出。
核酸提取实验盒推荐使用领航基因科技(杭州)有限公司生产的血浆游离DNA 核酸提取试剂盒进行提取，按照说明书进行核酸提取。
一、靶基因检测方案
数字PCR检测流程(配置数字PCR反应液、液滴芯片生成及扩增过程)。
1、配制20μl的液滴PCR检测体系，具体体系配方分别见表2。
表2
| 组分 | 体积(μl) |
| 5x Taq Mix | 4 |
| Forward Primer(100μM) | 0.06 |
| Reverse Primer(100μM) | 0.06 |
| Probe(100μM) | 0.04 |
| 模板 | 5 |
| 总体积 | 20 |
备注：表1中反应体系为单引物探针对反应体系，同样适用于多重检测体 系。
2、将提取的核酸模版加入到体系中并混匀，模板加入量为5μl，同时配制 实验的阳性对照和阴性对照；
3、按照SOP流程将配制好的反应体系加入到领航基因科技(杭州)有限 公司液滴芯片加样孔中；将芯片放入样本制备仪，启动仪器生成液滴。
将芯片放入芯片扩增仪中；设置液滴芯片扩增程序，并运行；反应程序 如下：95℃预变性5min；95℃变性15秒，60℃退火30秒，循环40次。
二、液滴芯片阅读、结果分析及报告流程
1、扩增结束后，将芯片架拿出放至数字PCR阅读仪的芯片放置台上，打 开GenePMS软件，并设置软件相应参数；
2、选择相应的荧光检测通道，开始芯片扫描并分析结果；
3、数据分析与报告输出。
实施例3本发明所述试剂盒
1、核酸提取试剂盒(优选为天根DP710试剂盒)
优选市售天根DP710试剂盒按说明进行DNA的提取，具体如下：
分离样本按血浆1:1.5的比例加入裂解液GHH，依次加入蛋白酶K、磁 珠和carrierRNA，涡旋振荡混匀后室温孵育20min左右，孵育期间摇晃震荡 2次；
将离心管置于磁力架上2min，待磁珠完全吸附时，弃废液；
加750ul缓冲液GDF，上下颠倒混匀30s，使磁珠充分悬浮，将离心管置 于磁力架上2min，待磁珠完全吸附时，弃废液；
加750ul漂洗液PWG，上下颠倒混匀30s，使磁珠充分悬浮，将离心管置 于磁力架上2min，待磁珠完全吸附时，弃废液，重复该操作一次；
将离心管置于磁力架上，室温晾干5-10min；
加入适量洗脱缓冲液TBC，移液器吹吸使磁珠重新悬浮，56℃孵育5min， 期间每2min轻轻晃动使核酸充分洗脱；
将离心管置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附时，将洗脱液转移至 新的离心管中，应用于下一步核酸检测。
2、液滴PCR核酸检测试剂盒
表3
根据具体实验方案中摸板量和引物探针对的组合，反应体系会有改动， 上述方案是单探针的示范PCR体系；
实验反应程序：95℃ 10min(95℃，15sec，60℃，30sec)40cycles。
实施例4灵敏度检测试验
人为往血液中掺入了5-10CFU的金黄色葡萄菌作为模拟样本，分别按照 本发明试剂盒(实施例1)进行液滴式数字PCR和常规血培方法检测，结果 见表4。
表4
以上实验结果显示，在相同微量菌体浓度条件下，经过本发明样本处理 方法获得的样本经过检测能够获得更多的阳性点数，而常规血培方法无法获 得阳性点数，表明本发明所述方法能够保证微量致病菌的阳性检出率，灵敏 度更高。
取阳性对照品(即含靶基因片段的质粒溶液)，测定其浓度并计算拷贝数， 按照10倍的浓度梯度稀释，选取5.0～5.0×104拷贝/ml的浓度作为样品，用本 发明的试剂盒和检测方法进行检测。
结果表明，本发明试剂盒对病原菌的最低检出限浓度为50个拷贝的基因， 即50个拷贝/ml。
实施例5特异性检测实验
交叉测试，购买下列菌株，并提取菌株DNA模板，固定0.1ng细菌DNA 上样量，按照实施例1进行数字PCR的检测，通过数据进行交叉测试，结果 如表5。
表5
结果显示，本发明引物探针1～21种病原菌进行检测，发现仅能检测出金 黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌和念珠菌五种病 原菌，无法检出其他病原菌。证明本发明试剂盒特异性高，能准确地、特异 地将这五种病原菌检测出来。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技 术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 领航基因科技（杭州）有限公司
<120> 5种病原菌多重PCR检测的引物、探针及其试剂盒
<130> MP21004083
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggaaacatt gtgttctgta tgtaaa 26
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcgtatgac cagcttcggt act 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gccgtcttga taatctttag tag 23
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcttcagcgt agtctaataa tttacgg 27
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggtgaagaag ttgaaatcat cgg 23
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acaactgtta ctggtgtaga aatg 24
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atctggtcgc cagcctttt 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgagcagca ccgttttgg 19
<210> 9
<211> 16
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<400> 9
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<211> 17
<212> DNA
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<400> 10
gtggcggsca cgcaaac 17
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
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<400> 11
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<400> 12
acattcttct gggaaatta 19
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
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<210> 14
<211> 26
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caaagtkctt ttcatctttc swtcac 26
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tggcgagaga ccgatagc 18
Claims (10)
1.5种病原菌多重PCR检测的引物、探针组，其特征在于，包括：
用于检测金黄色葡萄球菌的SEQ ID NO：1～2所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的探针；
用于检测凝固酶阴性葡萄球菌的SEQ ID NO：4～5所示核苷酸序列的引物和SEQ IDNO：6所示核苷酸序列的探针；
用于检测屎肠球菌的SEQ ID NO：7～8所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的探针；
用于检测粪肠球菌的SEQ ID NO：10～11所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的探针；和
用于检测念珠菌的SEQ ID NO：13～14所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO：15所示核苷酸序列的探针。
2.权利要求1所述的引物、探针组在制备金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌和念珠菌多重PCR检测的试剂盒中的应用。
3.5种病原菌多重检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物、探针组。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括检测试剂和核酸提取试剂。
5.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述检测试剂包括无菌水、PCRMix。
6.5种病原菌的多重PCR检测的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的引物探针组或权利要求3或4所述的试剂盒进行检测。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，基于多重荧光PCR或多重数字PCR平台进行检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，基于多重数字PCR平台的检测方法包括以下步骤：
(1)提取待测样本核酸；
(2)配置数字PCR反应液；
(3)制备液滴芯片；
(4)运行液滴芯片扩增程序后，采用生物芯片阅读仪进行分析后报告输出。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述待测样本为感染患者血浆样本或无症状定植者肛肠试子样本。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述扩增程序包括：95℃预变性5min；95℃变性15秒，60℃退火30秒，循环40次。
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