CN110564824B - 一种检测人类致病菌的引物和探针组合、试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学检测技术领域，特别涉及一种检测人类致病菌的引物和探针组合、试剂盒。该试剂盒包括用于检测铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、人葡萄球菌和鲍曼不动杆菌的引物和探针组合，该试剂盒采用以上引物和探针组合，结合多重数字PCR，能够快速、准确地鉴别检测范围内的致病菌种类及目标核酸拷贝数，检测方法具有较高的灵敏度，可以保证致病菌的低拷贝核酸片段阳性检出；同时能够动态监测致病菌感染患者体内上述致病菌的种类或目标核酸片段拷贝数变化，及时辅助评估治疗效果，为医生临床方案的优化提供参考。

Description

一种检测人类致病菌的引物和探针组合、试剂盒
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种检测人类致病菌的引物和探针组合、试剂盒。
背景技术
人类致病菌包括细菌、病毒、螺旋体、立克次氏体、衣原体、支原体、真菌及放线菌等，一般所说的致病菌指的是病原微生物中的细菌。虽然绝大多数细菌是无害甚至有益的，但是相当一部分可以致病。当人体免疫力低下或者存在伤口时，致病菌可入侵组织部位，导致血液、尿液和脑脊液感染等。例如，金黄色葡萄球菌和链球菌也是正常菌群，常可以存在于体表皮肤，鼻腔而不引起疾病，但某特定条件下，临床患者可罹患肺炎、脑膜炎和败血症等严重感染疾病。其中尿路感染、血流感染、呼吸道感染和胸腹腔感染最为显著。CHINET中国细菌耐药监测网公布的2017年中国细菌耐药监测报告中显示，190610株从临床分离的菌株来源于尿液标本的菌株占比是19.2％，血液标本的占比是15.2％，呼吸道标本占比为40％。
任何细菌侵入尿路，均可能引起尿路感染，以大肠杆菌最为常见，约占60％-80％，其次为变形杆菌、克雷白杆菌、产气杆菌、粪链球菌、葡萄球菌和绿脓杆菌等，偶尔还有真菌、寄生虫和病毒等致病菌。上述尿路感染的致病菌主要来源肠道平时就有的菌株，感染的一般规律是首次尿路感染，无症状的细菌尿，致病菌常为大肠杆菌，而医院获得性感染的致病菌多为粪链球菌、变形杆菌和克雷白杆菌等感染。
腹腔感染是指病原体侵入宿主腹腔并造成明显损害而引起的感染性疾病，包括发生于腹膜腔和腹腔脏器的感染，尤其是实质性脏器的感染性疾病，通常是肠杆菌科细菌、肠球菌属等的混合感染，一旦发生腹腔感染，病死率高达24％，因此监测腹腔感染细菌的分布对临床药物选择和治疗具有重要意义。
血流感染(bloodstream infection，BSI)，是临床上重症感染性疾病之一，具有较高的发病率和致死率，主要临床表现为：骤发寒战，高热，心动过速，呼吸急促，皮疹，肝脾肿大和精神，神志改变等一系列严重临床症状，严重者可引起休克，弥散性血管内凝血(DIC)和多脏器功能衰竭。
现阶段，细菌培养仍然是诊断感染疾病的重要检查方法之一，甚至是很多感染，如血流感染诊断的金标准。培养后通过生化方法或显微镜观察确定病原体，但该方法耗时长，通常需要数天时间才能确定结果，且对于难培养或无法培养的病原体，则难以准确检测。在缺乏准确诊断结果的情况下，临床医师为了缓解病症，可能盲目使用抗生素，导致患者的生存率降低、细菌耐药性的出现以及治疗费用的增加等。而且这种方式的鉴定周期相对较久(阳性报警需要1到5天，甚至更长)，无法满足临床早期、快速诊断以指导治疗的需要。临床方案中更早确定致病菌，可最大程度保证临床治疗效果。而且通过传统的细菌培养的方式，很多样本如脑脊液、胸腹水和血液的阳性检出率不高，仅可获得不超过20％的阳性检出率，也不适合临床实验室对不易培养的微生物如军团菌属、巴尔通氏体属和曲霉属真菌等及时检出。
此外，国内外已经有报道，通过高通量测序平台的宏基因组检测方法、靶向测序技术或16S rRNA测序方法直接对患者样本进行致病菌核酸片段检测。同时测序获得的绝大多数核酸片段为宿主的基因片段，造成测序数据的浪费，且需要较高的测序深度，才能保证目标菌株核酸片段的检出。因此，很难在测序深度和检出率之间获得完美的平衡。并且其操作复杂，成本高，无法满足临床大规模临床检测的需求。
目前，市场上针对大部分临床样本常见致病菌的鉴定大都基于细菌培养，利用阳性培养物再进一步通过PCR、质谱等方法进行菌株鉴定，直接鉴定的方法或者试剂盒极为少见。已有的针对临床感染样本直接鉴定的产品，其检测灵敏度均达不到临床级别的要求。因此开发一种针对临床感染样本，能够快速、准确、灵敏地鉴定致病菌菌株，指导临床进行抗生素治疗，是迫切地，有重大临床意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测人类致病菌的引物和探针组合、试剂盒，本发明引物和探针组合能够快速、准确地将感染患者临床样本中的铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、人葡萄球菌和鲍曼不动杆菌检测出来，对致病菌的低拷贝目标核酸片段具有较高的阳性检出率；结合数字PCR绝对定量技术可实现致病菌目标核酸片段拷贝数的实时监控。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测人类致病菌的引物和探针组合，包括：
用于检测铜绿假单胞菌的SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针；
用于检测大肠埃希菌的SEQ ID NO:4～5所示核苷酸序列的引物，SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针；
用于检测肺炎克雷伯菌的SEQ ID NO:7～8所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的探针；
用于检测表皮葡萄球菌的SEQ ID NO:10～11所示核苷酸序列的引物和SEQ IDNO:12所示核苷酸序列的探针；
用于检测金黄色葡萄球菌的SEQ ID NO:1、13所示核苷酸序列的引物和SEQ IDNO:14所示核苷酸序列的探针；
用于检测屎肠球菌的SEQ ID NO:1、13所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO:15所示核苷酸序列的探针；
用于检测人葡萄球菌的SEQ ID NO:1、13所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO:16所示核苷酸序列的探针；和\或
用于检测鲍曼不动杆菌的SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO:17所示核苷酸序列的探针。
本发明提供的引物和探针组合包含检测铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、人葡萄球菌和鲍曼不动杆菌中至少一种致病菌的引物和探针组合。
本发明中，SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物对，SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针针对铜绿假单胞菌长度为390bp的靶片段设计，序列为：gattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgactagccgttgggatccttgagatcttagtggcgcacgtaacgcgataagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttacctggccttgacatgctgagaactttccagagatggattggtgccttcgggaacagagacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaacccttgtccttagttaccagcacctcgggtgggcactctaaggagactgccggtgacaaaccgg。
本发明中，SEQ ID NO:4～5所示核苷酸序列的引物对，SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针针对大肠埃希菌长度为910bp的靶片段设计，序列为：acctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagcaacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgcngcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaaagtactttcagcggggaggaagggagtaaagttaatacctttgctcattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtttgttaagtcagatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatctgatactggcaagcttgagtctcgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacgaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccgganntaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggtcttgacatccacggaagttttcagagatgagaatgtgccttcgggaaccgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggtccggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaa。
本发明中，SEQ ID NO:7～8所示核苷酸序列的引物对，SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的探针针对肺炎克雷伯菌长度为596bp的靶片段设计，序列为：tcgagcggtagcacagagagcttgctctcgggtgacgagcggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagtgggggaccttcgggcctcatgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcactttcagcggggaggaaggcgatgaggttaataacctcatcgattgacgttaccctgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcattcgaaactggcaggctagagtc。
本发明中，SEQ ID NO:10～11所示核苷酸序列的引物对，SEQ ID NO:12所示核苷酸序列的探针针对金黄色葡萄球菌长度为260bp的靶片段设计，序列为：aggatgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcgaacagacgaggagcttgctcctctgacgttagcggcggacgggtgagtaacacgtggataacctacctataagactgggataacttcgggaaaccggagctaataccggataatatattgaaccgcatggttcaatagtgaaagacggttttgctgtcacttatagatggatccgcgccgcattagctagttggtaaggtaacggcttaccaaggca。
本发明中，SEQ ID NO:1、13所示核苷酸序列的引物对，SEQ ID NO:14所示核苷酸序列的探针针对金黄色葡萄球菌长度为260bp的靶片段设计，序列为：gttgaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgAagaaccttaccaaatcttgacatcctttgacaactctagagatagagccttccccttcgggggacaaagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttaagcttagttgccatcattaagttgggcactctaagttgactgc。
本发明中，SEQ ID NO:1、13所示核苷酸序列的引物对，SEQ ID NO:15所示核苷酸序列的探针针对屎肠球菌长度为260bp的靶片段设计，序列为：aaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacacgaagaaccttaccaggtcttgacatcctttgaccactctagagatagagcttccccttcgggggcaaagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattgttagttgccatcattcagttgggcactctagcaagactg。
本发明中，SEQ ID NO:1、13所示核苷酸序列的引物对，SEQ ID NO:16所示核苷酸序列的探针针对人葡萄球菌长度为260bp的靶片段设计，序列为：ctcaaaggaattgacggggacccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaaatcttgacatcctttgacccttctagagatagaagtttccttcgggggacaaagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttaagcttagttgccatcattaagttgggcactctaagttgactgccggtgacaa。
本发明中，SEQ ID NO:1、13所示核苷酸序列的引物对，SEQ ID NO:17所示核苷酸序列的探针针对人葡萄球菌长度为298bp的靶片段设计，序列为：cgatgtctactagccgttggggcctttgaggctttagtggcgcagctaacgcgataagtagaccgcctggggagtacggtcgcaagactaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggccttgacatactagaaactttccagagatggattggtgccttcgggaatctagatacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccc。
本发明中，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。其中，所述荧光报告基因包括FAM、VIC、ROX、CY5、425、755、680，所述荧光淬灭基团包括MGB、BHQ1、BHQ2和BHQ3。
具体地，SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团MGB；
SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团VIC，3’端标记有荧光淬灭基团MGB；
SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团ROX，3’端标记有荧光淬灭基团MGB；
SEQ ID NO:12所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团MGB；
SEQ ID NO:14所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团MGB；
SEQ ID NO:15所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团VIC，3’端标记有荧光淬灭基团MGB；
SEQ ID NO:16所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团ROX，3’端标记有荧光淬灭基团MGB；
SEQ ID NO:17所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团MGB。
本发明还提供上述引物组和探针在制备检测血液、胸水、腹水、脑脊液、尿液等临床样本中常见人类致病菌的试剂中的应用。
本发明还提供一种检测临床样本中人类致病菌的试剂盒，包括本发明所述的引物和探针组合。
其中，所述临床样本为血液、胸水、腹水、脑脊液、尿液或痰液。
本发明提供的试剂盒中，还包括内对照引物和探针组合，具体序列为：
IC-F1:GCTTCTTGTGGAGCTCGACAA(SEQ ID NO：18)；IC-R1:CCGTCAGCAACTTCGTTTTCA(SEQ ID NO：19)；IC-P1:ATTO425-CGCGACGGATCTACGTCACAGCG-BHQ1(SEQ ID NO：20)。
本发明提供的内对照引物和探针，根据随机生成的核酸序列IC-STD1生成，IC-STD1序列为:
gacgtctgtaaaatggcgttgatgtggatcgactctatagaggcatctacgaggtctgtggccgcgtggtcaaaagtgcggctttcgtatttgctgctcgtctatactttcacaatcttgacctgcacggcaaagagacgcttcttgtggagctcgacaacgcaacaacgcgacggatctacgtcacagcgagtatagtgaaaacgaagttgctgacggcggaagcgacatagggatctgtcagttgtcattcgcgaaaaacatccgtccccgagggggacagtcactgacgcggttttgcatgtctggctttagaattcagtatagtgcgctgatccgagtcgaattaaaaacaccagtacccaaaaccaggcgggctcgccacgtcggctaatcctggtacattttgtaaacaatgttctgaagaaaatttgtgaaagaaggacgggtcatcgcctactaatagcaacaacgatcggccgcaccttccattgtcgtggcgatgcacgacagggtgcgtgtaccagacaaccgatagcacgctcggattacacggcaaaggtgcttgtgttccgacaggctagcatataatcctgaggcgttaccccaatcgttcaccgtcggatttgctacagcctcccattagtcggcacaggtggatgtgttgcgatagcccgctaagatattctaaggcgtaacgcagatgaatattctacagagttgccataggcgttgaacgcttcacggacgataggaatttgcgtatagagcgggtcatcgaagggttatacactcgtagttaacatctagcccggctctatcagtacaccagtgccttgaatgacatactcatcattaaactttctcaacagtcaaacgaccaagtg。
本发明提供的试剂盒中，还包括多重数字PCR检测试剂；所述多重数字PCR检测试剂包括PCR Mix反应液和超纯水。
本发明提供的试剂盒中，还包括样本提取试剂；所述样本提取试剂包括裂解液、Proteinase K、磁珠悬液、洗涤液、异丙醇、75％乙醇和洗脱液。各组分的具体组成参见海狸游离核酸提取试剂盒(货号：70404L-50)。
本发明提供的试剂盒中，还包括阴性对照品，所述阴性对照品为水。
本发明提供的试剂盒中，还包括阳性对照品，所述阳性对照品含有铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、人葡萄球菌或鲍曼不动杆菌的靶基因片段的质粒溶液。
本发明提供的试剂盒还包括PCR芯片、芯片专用油和ddH2O。
本发明提供的特异性引物和探针组合可用于血液、胸水、腹水、脑脊液、尿液等临床样本中常见人类致病菌直接鉴定，能够快速、准确地将临床样本中铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、人葡萄球菌和鲍曼不动杆菌的特异性目标核酸片段检测出来，无需进行细菌培养，大大缩短了致病菌的鉴定时间，提高了致病菌的低拷贝核酸片段的阳性检出。
本发明提供的引物和探针组合可结合数字PCR检测平台，对多种致病菌目标核酸片段的拷贝数进行实时定量检测，可有效评估临床样本中致病菌目标核酸片段的拷贝数变化，核酸片段拷贝数在一定程度上与临床样本体内的致病菌数目呈正相关，进而指示临床治疗效果，达到临床治疗方案效果优劣的实时评估。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示四色多重数字PCR检测结果，其中，1-A，ROX(绿色)、CY5(亮灰色)；1-B中，FAM(蓝色)、VIC(红色)，其中绿色部分为双阳性信号；两张图片中的黄色均为阴性扩增点，即四种颜色各自代表每个荧光通道的扩增信号。
具体实施方式
本发明公开了一种检测人类致病菌的引物和探针组合、试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1本发明引物和探针组合、对照引物和探针组合
引物和探针序列见表1。
表1引物和探针组合序列
实施例2本发明试剂盒
试剂盒包括表1中本发明引物和探针组合、样本提取试剂、多重数字PCR检测试剂、阳性对照品、阴性对照品、PCR芯片，芯片专用油，ddH2O。
其中，阴性对照品为超纯水，阳性对照品为试剂盒检测目标菌株对应的标准品。
实施例3
利用实施例2的试剂盒对84例血液样本中的铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、人葡萄球菌和鲍曼不动杆菌进行检测。其中，14例为阳性样本，70例阴性样本。同时采用血培养法测定样本的感染情况，该方法为目前行业金标准。
检测步骤为：
一、核酸提取：
核酸提取过程采用的仪器和设备如表2，试剂如表3所示。
表2仪器与设备表
表3试剂名称及存储
试剂名称 存储
裂解液A 2-8℃保存
Proteinase K 2-8℃保存
磁珠悬液 2-8℃保存
洗涤液A 2-8℃保存
异丙醇 常温保存
75％乙醇 常温保存
洗脱液 2-8℃保存
1、将临床全血样本(10mL)平均分为两份，分装于15mL离心管中。
2、1600g离心10min，取上层血浆于新的15mL离心管中，注意不要吸到下层的血液。
3、进行第二次离心，16000g离心10min，取上层血浆于新的15mL离心管中。
4、向分离出的血浆样品中加入200ul蛋白酶K，充分振荡混匀后，再加入1.6mL的裂解液，最大转速漩涡振荡混合均匀后，将离心管置于55℃水浴锅孵育10min，期间每隔5min漩涡振荡10s。
5、向上述离心管中加入1mL异丙醇，漩涡振荡30s后，再加入100ul磁珠悬液(使用前充分震荡5-10min，使磁珠充分重悬均匀)，最大转速漩涡振荡混合均匀后静置10min。
6、将离心管置于磁力架上3-5min，使得溶液充分澄清，然后去除上清液，并取下离心管。
7、加入6mL washing buffer于上述离心管中，漩涡振荡1min，使得磁珠充分重悬，将离心管置于磁力架上3-5min，溶液彻底澄清后，去除上清液，取下离心管。
8、向离心管中加入6mL 75％的乙醇溶液，漩涡振荡1min，使得磁珠充分重悬后，置于磁力架上3-5min，待溶液澄清后，去除乙醇溶液，并取下离心管。
9、向离心管中加入1mL 75％乙醇溶液，吹打均匀后，将混合磁珠的溶液转移至1.5mL的新的EP管中(低吸附管)，震荡混匀30s后，室温静置1min，然后静置于磁力架上至溶液充分澄清。
10、充分去除上清液，于磁力架上室温静置5-10min，充分晾干磁珠(但避免磁珠过度干燥)。
11、将55℃预热的洗脱液(DDW)，加入磁珠中，充分吹打均匀后，55℃水浴锅孵育5min，洗脱核酸，然后再置于磁力架上，转移洗脱液于1.5mLEP管中。
12、将核酸溶液用Qubit测定浓度,下游基因检测实验使用后置于-20℃冰箱中保存。
二、多重数字PCR
利用实施例2的试剂盒进行PCR扩增反应，分别以提取的待检样品DNA、阳性对照和阴性对照进行多种数字PCR反应，PCR反应体系见表4。
表4
组分 体积(μL)
2x Taq Mix 7.5
Forward Primer(10μM) 0.6
Reverse Primer(10μM) 0.6
Probe(10μM) 0.4
核酸模板 1
总体积 超纯水补足至15
PCR反应条件为：95℃5分钟预变性，95℃15秒→60℃30秒，共45个循环。反应程序结束后，液滴芯片经过配套设备，进行信号判读，最终获得实验结果，结果见表5，其中两个样本的荧光检测结果见图1。
表5两种方法检测结果比较
样本 本发明试剂盒 细菌培养
阳性样本 14 14
阴性样本 70 70
结果显示，本发明试剂盒对14例阳性样本的检出率为100％，细菌培养结果一致，对阴性样本检测结果与细菌培养法也一致。
实施例4特异性检测试验
根据ATCC菌库获得的相关菌株，按照菌株说明书的相关培养方式进行放大培养，利用菌体核酸提取试剂盒(品牌：天根，货号：DP302-02)获得相应菌株的核酸片段。
在数字PCR平台上，进行每对引物探针对的特异性测试实验，如表6所示，如大肠杆菌的特异性引物探针对分别在大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌、阴沟肠杆菌、头葡萄球菌和粪肠球菌的基因组模板中进行扩增实验；其他菌株对应的引物探针对，依次进行类似实验。
表6特异性测试实验结果
结果显示，相应的引物探针对只有在对应的菌株模板实验中，才获得阳性扩增信号，其他组均显示为阴性结果。说明本发明试剂盒特异性高，能准确地、特异地将铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、人葡萄球菌和鲍曼不动杆菌检测出来。
实施例5：灵敏度实验
1、根据ATCC菌库获得的相关菌株，按照菌株说明书的相关培养方式进行放大培养，利用菌体核酸提取试剂盒(品牌：天根，货号：DP302-02)获得相应菌株的核酸片段。
2、在数字PCR平台上，首先对各菌株模板组进行拷贝数定标实验，确定每菌株的低拷贝模板量。
3、每个菌株分别测试10拷贝/反应、5拷贝/反应和2拷贝/反应，每浓度梯度测试20次。
4、实验检测结果如表7所示，该试剂盒中的八种目标菌株，其中10拷贝/反应的检测限，测试20组均可完全检测出阳性信号；5拷贝/反应的检测限，19组均可检测出阳性信号；2拷贝/反应的检测限，18组均可检测出阳性信号。
表7最低检测限结果
结果显示，本发明试剂盒对10拷贝的样本的检出率为100％，对8种菌株的最低检出限浓度均为10拷贝。
对比试验
对照引物和探针序列见表8，采用实施例5的方法对对照引物和探针的灵敏度进行检测，结果见表8。
表8对照引物和探针序检测限结果
菌种名称 检测限
P.aeruginosa(铜绿假单胞菌) 30CPR
E.coli(大肠埃希菌) 30CPR
K.pneumoniae(肺炎克雷伯菌) 45/30CPR
S.epidermidis(表皮葡萄球菌) 30CPR
S.aureus(金黄色葡萄球菌) 30CPR
E.faecium(屎肠球菌) 30CPR
S.hominis(人葡萄球菌) 40/30CPR
A.baumannii(鲍曼不动杆菌) 30CPR
结果表明，通过对比实验可知，本发明提供的引物和探针对铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、人葡萄球菌和鲍曼不动杆菌的检测限为10拷贝/反应，而对照组的引物探针对均在30拷贝/反应以上。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 领航基因科技（杭州）有限公司
<120> 一种检测人类致病菌的引物和探针组合、试剂盒
<130> MP1910549
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcaacgcgaa gaaccttacc 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gttcccgaag gcaccaatc 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccttgacatg ctgagaac 18
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggccttcggg ttgtaaagta c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcttctgcgg gtaacgtcaa t 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aagggagtaa agttaatacc 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agcctgatgc agccatgc 18
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttagccggtg cttcttctgc 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
taacctcatc gattgacg 18
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aacttcggga aaccggagc 19
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
catctataag tgacagcaaa accgtc 26
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgcatggttc aatagtga 18
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
catgcaccac ctgtcacttt g 21
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tagagccttc cccttcg 17
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atagagcttc cccttcgg 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctagagatag aagtttcc 18
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccttgacata ctagaaactt 20
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gcttcttgtg gagctcgaca a 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccgtcagcaa cttcgttttc a 21
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cgcgacggat ctacgtcaca gcg 23

Claims (6)

1.一种检测人类致病菌的引物和探针组合，其特征在于，由如下引物和探针组成：
用于检测铜绿假单胞菌的SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针；
用于检测大肠埃希菌的SEQ ID NO:4～5所示核苷酸序列的引物，SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针；
用于检测肺炎克雷伯菌的SEQ ID NO:7～8所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的探针；
用于检测表皮葡萄球菌的SEQ ID NO:10～11所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO:12所示核苷酸序列的探针；
用于检测金黄色葡萄球菌的SEQ ID NO:1、13所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO:14所示核苷酸序列的探针；
用于检测屎肠球菌的SEQ ID NO:1、13所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO:15所示核苷酸序列的探针；
用于检测人葡萄球菌的SEQ ID NO:1、13所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO:16所示核苷酸序列的探针；和
用于检测鲍曼不动杆菌的SEQ ID NO: 1～2所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO:17所示核苷酸序列的探针；
所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；
SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团MGB；
SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团VIC，3’端标记有荧光淬灭基团MGB；
SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团ROX，3’端标记有荧光淬灭基团MGB；
SEQ ID NO:12所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团MGB；
SEQ ID NO:14所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团MGB；
SEQ ID NO:15所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团VIC，3’端标记有荧光淬灭基团MGB；
SEQ ID NO:16所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团ROX，3’端标记有荧光淬灭基团MGB；
SEQ ID NO:17所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团MGB。
2.如权利要求1所述的引物和探针组合在制备检测血液、胸水、腹水、脑脊液、尿液和痰液中常见人类致病菌的试剂中的应用。
3.一种用于检测临床样本中人类致病菌的试剂盒，包括权利要求1所述的引物和探针组合。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括多重数字PCR检测试剂；所述多重数字PCR检测试剂包括PCR Mix反应液和超纯水。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括样本提取试剂；所述样本提取试剂包括裂解液、蛋白酶K、磁珠悬液、洗涤液、异丙醇、75%乙醇和洗脱液。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括阴性对照品和阳性对照品；
所述阴性对照品为水；
所述阳性对照品为含有铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、人葡萄球菌或鲍曼不动杆菌的靶基因片段的质粒溶液。
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