CN112813179B

CN112813179B - 一种用于尿路感染病原菌检测的试剂盒及其使用方法

Info

Publication number: CN112813179B
Application number: CN202011429697.6A
Authority: CN
Inventors: 舒博文; 周小明; 田甜
Original assignee: South China Normal University; Guangzhou First Peoples Hospital
Current assignee: South China Normal University; Guangzhou First Peoples Hospital
Priority date: 2020-12-09
Filing date: 2020-12-09
Publication date: 2023-04-18
Anticipated expiration: 2040-12-09
Also published as: CN112813179A

Abstract

本发明公开了一种用于尿路感染病原菌检测的试剂盒及其使用方法，包括靶向大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌16S rRNA中具有物种特异性序列的crRNAs，Cas13a蛋白，单链RNA探针，RNase抑制剂和缓冲液。本发明的试剂盒无需反转录及核酸序列扩增步骤，极大地降低了反转录可能造成的样品损失和核酸扩增可能造成的污染风险；操作步骤简单、恒温反应、无需热循环；检测时间不超过1小时，高效快速；可实现尿路感染病原菌16S rRNA定性检测与单分子水平检测定量检测，无需内参校正和建立标准曲线。

Description

一种用于尿路感染病原菌检测的试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及病原菌检测领域，特别涉及一种用于尿路感染病原菌检测的试剂盒。

背景技术

尿路感染（Urinary Tract Infection，UTI）是临床常见的细菌性感染疾病，据统计人一生中约有50%的概率会经历尿路感染。尿路感染的95%以上是由单一细菌引起的，其中最常见的是大肠埃希菌，其次为粪肠球菌属、铜绿假单胞菌、葡萄球菌属细菌和肺炎克雷伯菌等。理想情况下，临床医生应当在获知患者的病原菌类型、含量的前提下，综合考虑感染部位、感染程度和患者生理、病理情况，给予针对性抗菌治疗方案（包括抗菌药物的品种、剂量、给药次数、给药途径、疗程等）。然而，当前尿路感染病原检测主要依赖尿培养和以此为基础的病原菌鉴定、菌落计数，此过程极为繁琐耗时，检测周期一般需要16-24小时甚至更长，因此目前尿路感染的诊治主要是通过临床症状评估结合经验性治疗来完成的。例如，针对尿路感染诊治的最新中国专家共识提出：根据患者的感染部位、发病情况、发病场所、既往抗菌药物用药史及其治疗反应等推测可能的病原体，同时结合当地细菌耐药性监测数据，先给予抗菌药物经验性治疗, 待获知病原学检测及药敏试验结果后，再结合先前的治疗反应调整用药方案。由于尿路感染临床症状的多样性和复杂性，而且在获得药敏试验结果之前经常采用经验性治疗或不规范的抗菌药物治疗所导致的尿路感染病原体的分布发生改变和耐药性的产生，使得现阶段尿路感染的诊治面临极大的挑战。因此，发展快速病原菌鉴定方法对于解决当前尿路感染所面临的挑战尤为重要。

原核生物体内普遍存在16S rRNA是其蛋白质合成所必需的一种核糖体RNA，一方面由于其包含了种属差异的特异性序列，可被作为细菌检测和鉴定的分子标志物，另一方面由于其相对丰度较高（通常为多拷贝甚至是成千上万拷贝），有利于提高细菌的高灵敏检出。因此，靶向16S rRNA的核酸检测可以实现快速尿路感染病原细菌的鉴定，可能避免冗长耗时的尿培养过程。然而，现有针对16S rRNA目的片段的高灵敏细菌检测主要依赖反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和相关等温扩增，包括RT-LAMP（逆转录环介导等温扩增），RT-RPA（重组酶聚合酶扩增技术），NASBA（核酸依赖性扩增技术），这些方法不可避免涉及了核酸的高度复制（上万倍），需要格外防备其导致的气溶胶污染和携带污染风险：包括建立隔离良好的物理隔间和空气交换系统等。这些要求很大程度上限制了现有核酸检测方法的广泛开展与应用。

发明内容

本发明为解决现有RNA定量检测技术存在的不足，提供一种用于尿路感染病原菌检测的试剂盒。

本发明的目的是通过以下技术方实现的：

一种用于尿路感染病原菌检测的试剂盒，包括靶向大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌属、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌16S rRNA中具有物种特异性序列的crRNAs，Cas13a蛋白，单链RNA探针，RNase 抑制剂和缓冲液。

进一步，所述crRNAs的序列如SEQ ID NO:2、4、6、8、10中的一种或多种所示。

进一步，所述缓冲液pH为8.9，包括以下组分：10 mM Tris-HCl、1.5 mM MgCl2、50mM KCl。

本发明还提供一种用于尿路感染病原菌检测的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

S1：提取待测样本的核酸，得到核酸样本；

S2：配制包含20 nM Cas13a蛋白、10 nM crRNAs、300nM 单链 RNA 荧光报告探针、1×反应缓冲液和0.02%（v/v）RNase 抑制剂的反应体系，其中反应缓冲液包含 10 mMTris-HCl、1.5 mM MgCl2，50 mM KCl，溶液pH 8.9；

S3：将核酸样本与步骤S2反应体系混合，进行检测结果判读。

进一步，步骤S3中将制备的混合液37℃孵育30-60 min，在孵育过程中用荧光信号采集装置每分钟读取一次荧光信号，绘制荧光强度随时间变化的曲线。

进一步，步骤S3中将制备的混合液形成大量直径不超过100 µm的油包水离散微液滴，微液滴的数目不少于12000个，置于37℃孵育30-60 min，孵育反应结束后读取微液滴光学信号，分别统计总液滴数目和荧光液滴数目，计算阳性液滴比例并根据泊松公式计算原始样品靶标序列的拷贝数。

相对于现有技术，本发明所述的用于尿路感染病原菌检测的试剂盒的有益效果是：

（1）无需反转录及核酸序列扩增步骤，极大地降低了反转录可能造成的样品损失和核酸扩增可能造成的污染风险；

（2）操作步骤简单、恒温反应、无需热循环；

（3）检测时间不超过1小时，高效快速；

（4）可实现尿路感染病原菌16S rRNA单分子水平检测及绝对定量，无需内参校正和建立标准曲线。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1是实施例1中铜绿假单胞菌荧光实时检测结果；

图2是实施例1中铜绿假单胞菌检测的crRNA特异性评估结果；

图3是实施例2中铜绿假单胞菌微滴法数字化检测的定量性能评估结果；

图4是实施例3中对五种常见尿路感染病原菌检测的特异性测试结果。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明的实施例进行详细说明，以便更清楚理解本发明的目的、特点和优点。应理解的是，附图所示的实施例并不是对本发明范围的限制，而只是为了说明本发明技术方案的实质精神。

一种用于尿路感染病原菌检测的试剂盒，包括靶向大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌属、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌16S rRNA中具有物种特异性序列的crRNAs，Cas13a蛋白，单链RNA探针，RNase 抑制剂和缓冲液。其中，crRNAs的序列如SEQ ID NO: 2、4、6、8、10中的一种或多种所示。缓冲液pH为8.9，包括以下组分：10 mM Tris-HCl、1.5 mMMgCl₂、50 mM KCl。

本发明所述的用于尿路感染病原菌检测的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

S1：提取待测样本的核酸，得到核酸样本；

S3：将核酸样本与步骤S2反应体系混合，进行检测结果判读。

其中，步骤S3中将制备的混合液37℃孵育30-60 min，在孵育过程中用荧光信号采集装置每分钟读取一次荧光信号，绘制荧光强度随时间变化的曲线。或者，步骤S3中将制备的混合液形成大量直径不超过100 µm的油包水离散微液滴，微液滴的数目不少于12000个，置于37℃孵育30-60 min，孵育反应结束后读取微液滴光学信号，分别统计总液滴数目和荧光液滴数目，计算阳性液滴比例并根据泊松公式计算原始样品靶标序列的拷贝数。

本发明所述的用于尿路感染病原菌检测的试剂盒利用了病原菌中16S rRNA的种属差异特异性，采用靶向16S rRNA的核酸检测进行尿路感染病原菌检测。其中，本发明所述的试剂盒可检测的尿路感染病原菌（16S rRNA序列）及对应的crRNA包括：大肠埃希菌（SEQID NO:1）、铜绿假单胞菌（SEQ ID NO:3）、粪肠球菌（SEQ ID NO:5）、金黄色葡萄球菌（SEQID NO:7）、肺炎克雷伯菌（SEQ ID NO:9）。本发明通过CRISPR-Cas13/crRNA 复合体体系（Cas13体系）的特异性识别RNA序列且非特异性剪切周边单链RNA的特性，结合所形成的微液滴的限域作用，使得Cas13体系的RNA触发剪切效率更高，荧光信号强度也相对提高，便于靶分子RNA信号的识别或读取，从而达到达到无需核酸预扩增即可检测单个RNA分子的目的。本发明所述试剂盒包含的尿路感染病原菌crRNA序列包括：大肠埃希菌crRNA（SEQ IDNO:2）、铜绿假单胞菌crRNA（SEQ ID NO:4）、粪肠球菌crRNA（SEQ ID NO:6）、金黄色葡萄球菌crRNA（SEQ ID NO:8）、肺炎克雷伯菌crRNA（SEQ ID NO:10）。

以下实施例便于理解本发明，但并不限定本发明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1、实时定量检测尿路感染铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa

为了验证本发明提供的是技术方案可以兼容常规实时定量PCR检测装置，并用于铜绿假单胞菌16S rRNA检测的可行性。本实施例进行了如下测试：

（1）选用对铜绿假单胞菌的16S rRNA具有物种特异性的 P.a.crRNA，其具体序列为GACCACCCCA AAAAUGAAGG GGACUAAAACGUGGUAACCG UCCCCCUUGC（SEQ ID NO.4）。

（2）配制反应体系，总体积为18 μL反应预混液，其组分主要包含20 nM LbuCas13a蛋白、10 nM P.a.crRNA，300nM FQ 5U RNA 荧光报告探针（FAM-UUUUU-BHQ1）和1×反应缓冲液，其中反应缓冲液包含 10 mM Tris-HCl、1.5 mM MgCl₂，50 mM KCl，溶液pH 8.9。

（3）利用紫外分光光度计（Nanodrop2000，Thermo Fisher）将包含待测样品总RNA梯度稀释成浓度分别为100 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL。

（4）分别取2 μL上述（3）所稀释的总RNA样品及无模板对照与上述（2）反应体系混合，随即置于荧光定量PCR仪（Takara）中，设置孵育温度37℃，每分钟执行一次荧光采集，持续采集45分钟。

（5）根据荧光强度随时间变化曲线计算荧光强度增长率K，若无模板反应体系对应的荧光平均增长率为K₀，则当待测样品的荧光平均增长率K≤K₀时，其中判定待测样品中不包含铜绿假单胞菌；当K>K₀时，根据标准品测定的校正曲线推算样品中铜绿假单胞菌16SrRNA含量。

该实验结果如图1所示，100 ng/μL 对应的荧光平均增长率为658.94497，10 ng/μL 对应的荧光平均增长率为384.84647，1 ng/μL 对应的荧光平均增长率为56.72121，无模板对照对应荧光平均增长率为7.95586。需要指出的是，使用不同的荧光实时定量检测装置对应的荧光平均增长率存在数值上的不同，这是由不同仪器所用检测器参数和算法差异造成的，但都会呈现出如下规律：有靶标的样品对应的K>K₀，且K随输入模板浓度的升高而增大。由此证明本发明提供的技术方案用于铜绿假单胞菌16S rRNA定性或半定量检测的可行性。

利用其他四种尿路感染病原菌样品测试 P.a.crRNA的特异性的操作与上述操作步骤相同，只需将相应的待测样品总RNA梯度稀释成浓度为100 ng/μL进行测试。在该实验条件下， P.a.crRNA的特异性验证结果如图2所示。当加入的样品总RNA提取物来自铜绿假单胞菌时，对应的荧光增长率K远远大于无模板对照的荧光增长率K₀，当加入的样品总RNA提取物来自大肠埃希菌、粪肠球菌属、铜绿假单胞菌、葡萄球菌属细菌、肺炎克雷伯菌时，对应的荧光增长率K与大无模板对照的荧光增长率K₀无明显差异。该结果表明，本发明提供的技术方案中针对16S rRNA设计的物种特异性crRNA可以实现大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌属、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等尿路感染病原菌准确区分。

实施例2、微滴法绝对定量检测尿路感染铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa

为了进一步显示本发明提供的技术方案也具利用微滴法对尿路感染病原16SrRNA进行的精确绝对定量检测的可行性，本实施例进行了如下测试：

（1）选用对铜绿假单胞菌16S rRNA具有物种特异性的 P.a.crRNA，其具体序列为GACCACCCCA AAAAUGAAGG GGACUAAAACGUGGUAACCG UCCCCCUUGC（SEQ ID NO.4）。

（2）配制反应体系，其组分主要包含20 nM LbuCas13a蛋白、10 nM P.a.crRNA、300nM FQ 5U RNA 荧光报告探针（FAM-UUUUU-BHQ1）和1×反应缓冲液，其中反应缓冲液包含 10 mM Tris-HCl、1.5 mM MgCl₂，50 mM KCl，溶液pH 8.9。

（3）将包含待测样品总RNA提取物与上述（2）反应体系混合，随即在液滴发生芯片上形成大量直径为20 µm的油包水离散微液滴，微液滴的数目约为60000个。

（4）37℃孵育上述制备的液滴，持续时间为60分钟；

（5）将已完成步骤（4）的液滴至于荧光显微镜下扫描成像并测量液滴直径 D；

（6）设定液滴信号判定阈值为S/N≥3，其中S为液滴信号强度，N为平均背景信号。根据液滴的荧光强度阈值将液滴信号二值化，荧光强度高于判定阈值即为阳性“1”，否则判定为阴性“0”。统计液滴总数和阳性液滴数，根据阳性液滴比例 p计算肺炎克雷伯菌16SrRNA的含量 C。

其中

梯度稀释铜绿假单胞菌样品总RNA提取物的阳性率结果如图3所示，稀释倍数与液滴阳性率之间的线性响应关系显示了其定量准确性。而且，相对于实时荧光定量检测法，本实施例所述微滴法可以从0.1 fg/μL铜绿假单胞菌总RNA提取物中检测到16S rRNA的存在，相应的灵敏度提高了1万倍。考虑到一个铜绿假单胞菌细胞内包含的16S rRNA拷贝数通常>10⁴个，且一个铜绿假单胞菌约含有170 fg的总RNA，因此目前这种灵敏度理论上可以允许从10 mL样品中检出6个铜绿假单胞菌。

实施例3、试剂盒检测尿路感染五种常见病原菌的特异性

为了检验本发明所述试剂盒的检测准确性，采用试剂盒中的五种crRNA分别对五种尿路感染病原菌进行检测。

（1）特异性测试的五种尿路感染病原菌标准株分别为：铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa（ATCC 15442）、金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus（ATCC 25923）、大肠埃希菌 Escherichia coli（ATCC 35150）、粪肠球菌 Enterococcus faecalis(ATCC 29212) 和肺炎克雷伯菌 Klebsiella Pneumoniae（ATCC 700603）。其中，铜绿假单胞菌（ATCC 15442）、金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）和大肠埃希菌（ATCC 35150）接种在LB液体培养基（上海生工）中，在温度为37℃，转速为160转每分钟的摇床上过夜培养；粪肠球菌（ATCC 29212）和肺炎克雷伯菌（ATCC 700603）接种在血培养平板培养基（郑州安图生物）上，37℃培养24小时。

（2）利用HiPure Bacterial RNA Kit细菌RNA提取试剂盒（广州美基生物）提取上述细菌的总RNA，并利用紫外分光光度计（Nanodrop 2000，赛默飞）测定提取的总RNA含量，最终将上述五种细菌的总RNA浓度调整至1ng/μL备用，得到核酸样本。

（3）配制基础反应体系，其组分主要包含20 nM LbuCas13a蛋白、300nM FQ 5U RNA荧光报告探针（FAM-UUUUU-BHQ1）、1×反应缓冲液和0.02%（v/v）RNase 抑制剂，其中反应缓冲液包含 10 mM Tris-HCl、1.5 mM MgCl₂，50 mM KCl，溶液pH 8.9。

（4）将靶向上述五种细菌16S rRNA检测的crRNA与上述五种细菌的总RNA提取物进行正交配对混合，使各混合液中相应的crRNA浓度为10 nM，总RNA提取物含量为1 fg/μL。随即分别用液滴发生芯片形成大量直径为60 µm的油包水离散微液滴，微液滴的数目约为20000个。

（5）37℃孵育上述制备的液滴，持续时间为60分钟；

（6）让上述液滴通过激光诱导荧光检测器，逐一采集每一个液滴的荧光强度信号并统计液滴总数；根据液滴的荧光强度阈值将液滴信号二值化，荧光强度高于判定阈值即为阳性“1”，否则判定为阴性“0”，计算样品的液滴阳性率。

其正交测试的典型结果如图4所示，当仅当样品RNA提取物与对应crRNA匹配时才能产生阳性液滴，且同等浓度水平的RNA提取物最终产生的阳性液滴比例趋于一致，测试结果说明本发明所述的用于尿路感染病原菌检测的试剂盒可以特异性检测五种尿路感染病原菌，包括铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、粪肠球菌属和肺炎克雷伯菌，检测结果准确且效率高耗时短。

以上所述实施例仅表达了本发明的两种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 广州市第一人民医院（广州消化疾病中心、广州医科大学附属市一人民医院、华南理工大学附属第二医院）、华南师范大学

<120> 一种用于尿路感染病原菌检测的试剂盒及其使用方法

<160> 10

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1510

<212> DNA

<213> 大肠埃希菌

<400> 1

agtttgatca tggctcagat tgaacgctgg cggcaggcct aacacatgca agtcgaacgg 60

taacaggaag cagcttgctg ctttgctgac gagtggcgga cgggtgagta atgtctggga 120

aactgcctga tggaggggga taactactgg aaacggtagc taataccgca taacgtcgca 180

agcacaaaga gggggacctt agggcctctt gccatcggat gtgcccagat gggattagct 240

agtaggtggg gtaacggctc acctaggcga cgatccctag ctggtctgag aggatgacca 300

gcaacactgg aactgagaca cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg 360

cacaatgggc gcaagcctga tgcagccatg cngcgtgtat gaagaaggcc ttcgggttgt 420

aaagtacttt cagcggggag gaagggagta aagttaatac ctttgctcat tgacgttacc 480

cgcagaagaa gcaccggcta actccgtgcc agcagccgcg gtaatacgga gggtgcaagc 540

gttaatcgga attactgggc gtaaagcgca cgcaggcggt ttgttaagtc agatgtgaaa 600

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ggtagaattc caggtgtagc ggtgaaatgc gtagagatct ggaggaatac cggtggcgaa 720

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gcgaagaacc ttacctggtc ttgacatcca cggaagtttt cagagatgag aatgtgcctt 1020

cgggaaccgt gagacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct cgtgttgtga aatgttgggt 1080

taagtcccgc aacgagcgca acccttatcc tttgttgcca gcggtccggc cgggaactca 1140

aaggagactg ccagtgataa actggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc atcatggccc 1260

ttacgaccag ggctacacac gtgctacaat ggcgcataca aagagaagcg acctcgcgag 1320

agcaagcgga cctcataaag tgcgtcgtag tccggattgg agtctgcaac tcgactccat 1380

gaagtcggaa tcgctagtaa tcgtggatca gaatgccacg gtgaatacgt tcccgggcct 1440

tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt gggttgcaaa agaagtaggt agcttaactt 1500

cgggagggcg 1510

<210> 2

<211> 50

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaccacccca aaaaugaagg ggacuaaaac cgcccucccg aaguuaagcu 50

<210> 3

<211> 1470

<212> DNA

<213> 铜绿假单胞菌

<400> 3

atcatggctc agattgaacg ctggcggcag gcctaacaca tgcaagtcga gcggatgaag 60

ggagcttgct cctggattca gcggcggacg ggtgagtaat gcctaggaat ctgcctggta 120

gtgggggata acgtccggaa acgggcgcta ataccgcata cgtcctgagg gagaaagtgg 180

gggatcttcg gacctcacgc tatcagatga gcctaggtcg gattagctag ttggtggggt 240

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<210> 4

<211> 50

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

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<210> 5

<211> 1519

<212> DNA

<213> 粪肠球菌

<400> 5

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caggctgcaa ctcgcctgca tgaagccgga atcgctagta atcgcggatc agcacgccgc 1380

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ccgaagtcgg tgaggtaacc tttttggagc cagccgccta aggtgggata gatgattggg 1500

gtgaagtcgt aacaaggta 1519

<210> 6

<211> 50

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaccacccca aaaaugaagg ggacuaaaac agcactcggg aggaaagaag 50

<210> 7

<211> 1551

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 7

tttatggaga gtttgatcct ggctcaggat gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa 60

gtcgagcgaa cggacgagaa gcttgcttct ctgatgttag cggcggacgg gtgagtaaca 120

cgtggataac ctacctataa gactgggata acttcgggaa accggagcta ataccggata 180

atattttgaa ccgcatggtt caaaagtgaa agacggtctt gctgtcactt atagatggat 240

ccgcgctgca ttagctagtt ggtaaggtaa cggcttacca aggcaacgat gcatagccga 300

cctgagaggg tgatcggcca cactggaact gagacacggt ccagactcct acgggaggca 360

gcagtaggga atcttccgca atgggcgaaa gcctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg 420

aaggtcttcg gatcgtaaaa ctctgttatt agggaagaac atatgtgtaa gtaactgtgc 480

acatcttgac ggtacctaat cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 540

tacgtaggtg gcaagcgtta tccggaatta ttgggcgtaa agcgcgcgta ggcggttttt 600

taagtctgat gtgaaagccc acggctcaac cgtggagggt cattggaaac tggaaaactt 660

gagtgcagaa gaggaaagtg gaattccatg tgtagcggtg aaatgcgcag agatatggag 720

gaacaccagt ggcgaaggcg actttctggt ctgtaactga cgctgatgtg cgaaagcgtg 780

gggatcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt 840

tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta 900

cgaccgcaag gttgaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcgg tggagcatgt 960

ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaaatctt gacatccttt gacaactcta 1020

gagatagagc cttccccttc gggggacaaa gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct 1080

cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttaagc ttagttgcca 1140

tcattaagtt gggcactcta agttgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga 1200

cgtcaaatca tcatgcccct tatgatttgg gctacacacg tgctacaatg gacaatacaa 1260

agggcagcga aaccgcgagg tcaagcaaat cccataaagt tgttctcagt tcggattgta 1320

gtctgcaact cgactacatg aagctggaat cgctagtaat cgtagatcag catgctacgg 1380

tgaatacgtt cccgggtctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc 1440

gaagccggtg gagtaacctt ttaggagcta gccgtcgaag gtgggacaaa tgattggggt 1500

gaagtcgtaa caaggtagcc gtatcggaag gtgcggctgg atcacctcct t 1551

<210> 8

<211> 50

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

gaccacccca aaaaugaagg ggacuaaaac gccgcacctt ccgatacg gc 50

<210> 9

<211> 1436

<212> DNA

<213> 肺炎克雷伯菌

<400> 9

atcctggctc agattgaacg ctggcggcag gcctaacaca tgcaagtcga acggtagcac 60

agagagcttg ctctcgggtg acgagtggcg gacgggtgag taatgtctgg gaaactgccc 120

gatggagggg gataactact ggaaacggta gctaataccg cataacgtcg caagaccaaa 180

gagggggacc ttcgggcctc ttgccatcgg atgtgcccag atgggattag cttgtaggtg 240

aggtaacggc tcacctaggc gacgatccct agctggtctg agaggatgac cagccacact 300

ggaactgaga cacggtccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg 360

gcgcaagcct gatgcagcca tgccgcgtgt atgaagaagg ccttcgggtt gtaaagtact 420

ttcagcgggg aggaagggag tgaggttaat aaccttattc attgacgtta cccgcagaag 480

aagcaccggc taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg gagggtgcaa gcgttaatcg 540

gaattactgg gcgtaaagcg cacgcaggcg gtctgtcaag tcggatgtga aatccccggg 600

ctcaacctgg gaactgcatt cgaaactggc aggctggagt cttgtagagg ggggtagaat 660

tccaggtgta gcggtgaaat gcgtagagat ctggaggaat accggtggcg aaggcggccc 720

cctggacaaa gactgacgct caggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc 780

tggtagtcca cgctgtaaac gatgtcgact tggaggttgt tcccttgagg agtggcttcc 840

ggagctaacg cgttaagtcg accgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa aactcaaatg 900

aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgatgc aacgcgaaga 960

accttaccta ctcttgacat ccagagaact tagcagagat gctttggtgc cttcgggaac 1020

tctgagacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgttg tgaaatgttg ggttaagtcc 1080

cgcaacgagc gcaaccctta tcctttgttg ccagcgattc ggtcgggaac tcaaaggaga 1140

ctgccagtga taaactggag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcatcatgg cccttacgag 1200

tagggctaca cacgtgctac aatggcatat acaaagagaa gcgacctcgc gagagcaagc 1260

ggacctcata aagtatgtcg tagtccggat tggagtctgc aactcgactc catgaagtcg 1320

gaatcgctag taatcgtgga tcagaatgcc acggtgaata cgttcccggg ccttgtacac 1380

accgcccgtc acaccatggg agtgggttgc aaaagaagta ggtagcttaa ccttcg 1436

<210> 10

<211> 50

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 10

gaccacccca aaaaugaagg ggacuaaaac tgaataaggt tattaacctc 50

Claims

1. 一种用于尿路感染病原菌检测的试剂盒，其特征在于，包括靶向大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌属、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌中的一种或多种病原菌16S rRNA中具有物种特异性序列的crRNAs，Cas13a蛋白，单链RNA探针，RNase 抑制剂和缓冲液；

所述crRNAs的序列如SEQ ID NO: 2、4、6、8、10中的一种或多种所示。

2. 根据权利要求1所述的用于尿路感染病原菌检测的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液pH为8.9，包括以下组分：10 mM Tris-HCl、1.5 mM MgCl₂、50 mM KCl。