CN114214319B

CN114214319B - 一种快速、简易、低成本筛查尿路感染病原菌的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN114214319B
Application number: CN202111625162.0A
Authority: CN
Inventors: 赵醴; 单红梅; 刘建全
Original assignee: Shanghai Youjia Medical Technology Co ltd; Shanghai Childrens Medical Center Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Shanghai Youjia Medical Technology Co ltd; Shanghai Childrens Medical Center Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2021-12-28
Filing date: 2021-12-28
Publication date: 2024-05-10
Anticipated expiration: 2041-12-28
Also published as: CN114214319A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体是一种快速、简易、低成本筛查尿路感染病原菌的试剂盒及其应用，所述试剂盒包含序列SEQ ID NO:1‑12所示的引物，并记载有适当的PCR反应体系、反应条件以及序列SEQ ID NO:13‑18所示的探针。本发明的筛查尿路感染病原菌的多重PCR检测方法以及试剂盒结果可靠、快速、成本低，实验结果表明本发明的检测方法以及试剂盒对大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、无乳链球菌、奇异变形杆菌等尿路感染病原菌的识别速度快，提高了病原体鉴定的时效性和精确性，从而对改善公共健康以及实现精准医疗提供了可能。

Description

一种快速、简易、低成本筛查尿路感染病原菌的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种快速、简易、低成本筛查尿路感染病原菌的试剂盒及其应用。

背景技术

尿路感染又称泌尿系感染，是病原微生物引起的肾脏、输尿管、膀胱和尿道等泌尿系统各个部位感染的总称。尿路感染是常见的感染性疾病，全世界每年发生尿路感染近1.5亿人次，40％～50％女性一生中发生过尿路感染。在我国发生的院内感染中9.4％～50％来自尿路感染。严重的尿路感染，如复杂性尿路感染和肾盂肾炎易引起脓毒症，甚至引起感染性休克。最常见的病原菌包括大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、肠球菌和克雷伯氏菌等。

快速的临床微生物诊断方法可对感染性疾病做出快速、准确的病原学诊断确诊依据，为临床医生提供治疗、预防建议和咨询服务；同时可检测和预警感染的爆发，确定爆发的来源并及时控制其播散、提供药敏检测数据，为临床经验用药提供指导。因此，亟待开发一种能够快速、准确、低成本筛查病原菌的检测方法以及试剂、试剂盒。

中国专利申请：CN201610318778.6公开了一种检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒及其检测方法。所述包括用于检测的基因芯片和检测体系，其中，所述基因芯片包括工作电极、参比电极和辅助电极，所述工作电极上标记有捕获探针；所述检测体系包括相互独立的DNA提取液、PCR扩增反应液、PCR产物酶液、杂交液、检测液、空白对照、阳性质控品和阴性质控品。中国专利申请：CN201510022361.0公开了一种基于菌毛多样性的尿路感染大肠杆菌的分型方法，特别是涉及对尿路感染大肠杆菌的分型方法，该方法通过三种菌毛抗原基因(yagV,fimF,fimH)的进化分析以及菌毛抗原类型的鉴定确定尿路感染大肠杆菌的型别，包括样品预处理—扩增—电泳检测结果—切胶回收电泳样品—测序—序列比对，构建进化树。同时也公开了菌毛抗原多样性在尿路感染大肠杆菌分型中的应用。但是关于本发明一种快速、简易、低成本筛查尿路感染病原菌的试剂盒及其应用目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种快速、简易、低成本筛查尿路感染病原菌的试剂盒及其应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

第一方面，本发明提供了一种筛查尿路感染病原菌的引物组合，包含序列如SEQID NO:1-12所示的引物，

AAGAGAGTTTCTAATTGAGCACAGGT(SEQ ID NO:1)

CGATGTTAGTGCAAACTCATATTGTT(SEQ ID NO:2)

CGATCTGTTYGGCTGGTTTG(SEQ ID NO:3)

AGGCGAGTATGRTGCAGCA(SEQ ID NO:4)

GCGTATACGTAGCACTTGTAACGG(SEQ ID NO:5)

GCTACAGGTGGTATGGGTGATAC(SEQ ID NO:6)

CGATTCGTAAAGAAGCCAAAGC(SEQ ID NO:7)

GCTACATTGGAAACTGTTAAAGGATTATC(SEQ ID NO:8)

TGCTAATTTTCCTCCCTCTTTATTAT(SEQ ID NO:9)

TTATTACAACACACGATTTCACCA(SEQ ID NO:10)

TGGAGTTTTATTCGTTTGTTAGTTTTAA(SEQ ID NO:11)

CCATAACATGACGATAATGATTGG(SEQ ID NO:12)

第二方面，本发明提供了一种筛查尿路感染病原菌的试剂盒，包含如上所述的筛查尿路感染病原菌的引物组合。

优选地，所述试剂盒还包含序列如SEQ ID NO:13-18所示的探针。

CCTAAATCTGTAGCCCCTACCGACGATC(SEQ ID NO:13)

ATCCCGACGCCGGTATGGATC(SEQ ID NO:14)

TTGAATTGGCCGACAAAGCTTGTAATCATAC(SEQ ID NO:15)

GAATATTTCGCTGAACAAAATGTGGCYA(SEQ ID NO:16)

AAAACGCCGTACTGTGTTTCTTGATTAACG(SEQ ID NO:17)

AATATCAGCGCTTTACTTTTCCTTYAGRTGC(SEQ ID NO:18)

优选地，进行筛查尿路感染病原菌时采取多重PCR。

优选地，所述尿路感染病原菌包括大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、无乳链球菌、奇异变形杆菌。

优选地，所述试剂盒含有：

(1)样本预处理试剂；

(2)实时定量PCR反应试剂；

(3)PCR引物和探针组合；

(4)阴性质控样本；

(5)阳性质控样本。

第三方面，本发明提供了如上所述的引物组合、试剂盒在筛查尿路感染病原菌中的应用。

第四方面，本发明提供了一种非诊断和治疗目的的筛查尿路感染病原菌的方法，所述的方法使用了如上所述的筛查尿路感染病原菌的引物组合、筛查尿路感染病原菌的试剂盒。

本发明拟采用多色荧光PCR技术(Taqman探针法)检测6种尿道病原体。首先6种尿道病原体被分成2组：其中A管包括大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和屎肠球菌；B管包括粪肠球菌、铜绿假单胞菌和奇异变形杆菌。每管试剂组分有：针对各个目标病原体基因组中的保守区所设计的特异性引物和Taqman探针，反应缓冲液，dNTP和Taq酶。

在多重qPCR体系中，每一个靶标都被一套不同的引物扩增，且每一个靶标的特异性探针分别标记不同光谱范围的荧光基团，用以区分不同靶标的扩增过程。Taqman探针的5’端标记一个荧光报告基团，3’端标记一个荧光淬灭基团,在扩增过程中，当探针完整时，由于淬灭基团靠近报告基团，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收，不发出荧光信号。当有模板存在时，引物和探针会特异性结合到对应的模板上，在Taq酶的作用下，当引物延伸时，与模板结合的荧光探针被Taq酶(5’→3’外切酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号。荧光定量PCR仪可根据检测到的荧光信号自动绘制出实时扩增曲线，最终通过各个通道检测到的荧光信号来判定不同的扩增产物，从而实现在一管内同时对多个检测目标在核酸水平上的多重定性检测。

本发明优点在于：

1、本发明拟采用多色荧光PCR技术(Taqman探针法)，可实现在一管内同时对多个检测目标在核酸水平上的多重定性检测，能够快速、简易、低成本筛查包括大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、无乳链球菌、奇异变形杆菌等在内的多种常见尿路细菌感染。

2、准确快速地识别病原微生物是尿路感染治疗的关键，新型检测手段的探索成为尿路感染诊疗的关键；本发明开发的快速、简易、低成本筛查尿路感染的直扩PCR检测，提高病原体鉴定的时效性和精确性，从而对改善公共健康以及实现精准医疗提供了可能

附图说明

附图1是荧光定量PCR(Taqman探针)的原理。

附图2A-I是相同初始模板浓度下各靶标单重与多重qPCR扩增曲线比较，其中A表格记载的是各组反应体积、引物、探针以及质粒模板；B是S1组大肠杆菌单重扩增；C是S2组肺炎克雷伯菌单重扩增；D是S3组腐生葡萄球菌单重扩增；E是M1组Group1三个靶标多重扩增；F是S4组粪肠球菌单重扩增；G是S5组无乳链球菌单重扩增；H是S6组奇异变形杆菌单重扩增；I是M2组Group2三个靶标多重扩增。

附图3A-C是相同初始模板浓度下各靶标单重与多重qPCR扩增CT值比较。

附图4A-K是标曲制作及各靶标扩增效率评估，其中A是各组的反应体系、模板以及模板浓度，B是M1-梯度浓度标准品多重扩增曲线，C是M2-梯度浓度标准品多重扩增曲线，D是尿路感染各种细菌荧光通道及LogN0/CT均值结果，E是M1-大肠杆菌标准曲线，F是M1-肺炎克雷伯菌标准曲线，G是M1-腐生葡萄球菌标准曲线，H是M2-粪肠球菌标准曲线，I是M2-无乳链球菌标准曲线，J是M2-奇异变形杆菌标准曲线，K是尿路感染各种细菌扩增效率结果。

附图5A-D是M1和M2多重反应体系中检测下限LOD的评估，其中A是各组反应体系、模板及模板浓度，B是M1多重反应体系中检测下限的评估，C是M2多重反应体系中检测下限的评估，D是尿路感染各种细菌的荧光通路及模板拷贝数/Ct值。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1检测方法

1.1样本预处理与核酸提取

取本院的待测尿液样本(1-2ml)13000rpm离心10min，然后去掉上清。这一步的目的是通过离心富集尿液中的病原微生物，以提高检出率。然后使用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根，DP302)，按照说明书中的标准操作提取核酸。提取的核酸产物应立即用于下游检测，或者保存在-20℃。

1.2多重qPCR检测

首先将所有试剂解冻，颠倒混匀并短暂离心后备用。然后每个样本按照分别配制检测反应液A和B，总体积均为20ul，反应体系置于光学平盖PCR反应管中，并保持低温避光；配好反应体系后，盖紧反应管，瞬时低速离心，使反应液集中在PCR管底部，并确保没有气泡。然后将PCR管放入real-time PCR仪的加热模块上，关闭仓门。

荧光通道选择：以ABI7500为例，Target及Reporter Dye按照下面表格中各组检测试剂对应的检测目标及通道信息进行设置，Quencher Dye设置为“None”。然后按照仪器操作规程编辑各反应孔的样本信息并选择相应的检测目标，然后将仪器的荧光内参设置为“None”。

荧光通道FAM VIC Texas Red

反应组A致病菌大肠杆菌肺炎克雷伯菌腐生葡萄球菌

反应组B粪肠球菌无乳链球菌铜绿假单胞菌奇异变形杆菌

1.3结果分析判定

请参照仪器使用说明书进行。以ABI7500为例：反应结束后自动保存结果。根据分析后图像调整Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可在5～20，在Log图谱窗口设置Threshold的Value值，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击Analysis自动获得分析结果，在“Report”窗口读取检测结果，一般以ABI7500仪器自动Ct值计算数值为准。

检验结果判断：阳性对照各个通道检测目标的CT值≤33，阴性对照各个通道检测目标无CT值或CT值>38则视为检验合格。样本中各个检测目标CT值≤38为阳性，无CT值或CT值>38为阴性。

2结果与结论

见图1-图5，图3表明：单重反应和多重反应体系中，各通道检测靶点在相同初始模板浓度下CT值无明显差异，彼此扩增不存在相互干扰。图4：(1)R2均大于0.98，且非常趋近于1，说明数据线性关系好，结果可重复性高，且不同浓度的初始模板均具有相同的扩增效率。(2)扩增效率E均介于90％-11％之间，扩增不效率适中，反应体系和反应条件较优。图5：(1)综合M1和M2多重反应LOD检测结果，每个反应最低可检测4拷贝的模板；(2)按照每反应体系8μl模板的投入量大约相当于0.5拷贝/μl的核酸，若核酸抽提效率为100％，假设上样量为200μl，洗脱体积50μl，则LOD约为125拷贝/ml样本。(3)阳性阈值为CT≤38；若CT>38或者NoCt，则为阴性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心

上海优甲医疗科技限公司

<120> 一种快速、简易、低成本筛查尿路感染病原菌的试剂盒及其应用

<130> /

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aagagagttt ctaattgagc acaggt 26

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgatgttagt gcaaactcat attgtt 26

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgatctgtty ggctggtttg 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aggcgagtat grtgcagca 19

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcgtatacgt agcacttgta acgg 24

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gctacaggtg gtatgggtga tac 23

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgattcgtaa agaagccaaa gc 22

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gctacattgg aaactgttaa aggattatc 29

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgctaatttt cctccctctt tattat 26

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttattacaac acacgatttc acca 24

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tggagtttta ttcgtttgtt agttttaa 28

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccataacatg acgataatga ttgg 24

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cctaaatctg tagcccctac cgacgatc 28

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

atcccgacgc cggtatggat c 21

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ttgaattggc cgacaaagct tgtaatcata c 31

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gaatatttcg ctgaacaaaa tgtggcya 28

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

aaaacgccgt actgtgtttc ttgattaacg 30

<210> 18

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aatatcagcg ctttactttt ccttyagrtg c 31

Claims

1.一种筛查尿路感染病原菌的试剂盒，其特征在于，包含序列如SEQ ID NO:1-12所示的引物和包含序列如SEQ ID NO:13-18所示的探针。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，进行筛查尿路感染病原菌时采取多重PCR。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述尿路感染病原菌包括大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、无乳链球菌、奇异变形杆菌。

4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有：

(1)样本预处理试剂；

(2)实时定量PCR反应试剂；

(3)PCR引物和探针组合；

(4)阴性质控样本；

(5)阳性质控样本。

5.权利要求1-4任一所述的试剂盒在制备筛查尿路感染病原菌试剂盒中的应用。