CN110714090B - 一种检测血浆中血流感染病原体游离核酸的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请属于生物技术领域，公开了一种检测血浆中血流感染病原体游离核酸的试剂盒及检测方法。本发明所述检测血浆中血流感染病原体游离核酸的试剂盒，包括扩增血流感染病原体游离DNA的靶序列的引物组和检测探针。本发明所述试剂盒针对血浆样本中血流感染病原体肺炎克雷伯菌、黄曲霉、铜绿假单胞菌的游离核酸DNA具有良好的特异性，能够实现对血浆样本中肺炎克雷伯菌、黄曲霉、铜绿假单胞菌等血流感染病原体的快速、准确、灵敏的鉴定。本发明所述试剂盒及检测方法操作简便，检测特异性好、灵敏度高、检测范围宽。实验表明，本发明所述试剂盒检测肺炎克雷伯菌、黄曲霉、铜绿假单胞菌的最低检测限分别为0.2、0.4、0.3CFU/ml。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测血浆中血流感染病原体游离核酸的试剂盒，尤其是一种应用QPCR技术检测血浆中血流感染病原体游离核酸的试剂盒。
背景技术
血流感染(bloodstream infection，BSI)，是临床上重症感染性疾病之一，根据症状不同，可分为败血症、脓毒症和脓毒性休克。血流感染是致病菌侵入血液系统，并在血中生长繁殖，产生大量毒素进而引发急性全身性感染，具有较高的发病率和致死率，其常见感染源包括细菌、真菌。
目前针对血流感染缺乏快速准确的检测方法。血流感染诊断的金标准是血培养，通过生化方法或显微镜观察确定病原体，但该方法耗时长，通常需要数天时间才能确定结果，且对于难培养或无法培养的病原体，则难以准确检测。在缺乏准确诊断结果的情况下，临床医师为了缓解病症，可能盲目使用抗生素，导致患者的生存率降低、细菌耐药性的出现以及治疗费用的增加等。
在疾病感染的早期，病原体的早期鉴定是有效治疗的关键，市场上现有的检测试剂盒中，多依靠血培养方法进行病原体检测，检测时间往往需要24h以上，同时抗菌药物滥用影响，培养检出率大大降低，不能满足临床对血流感染这种严重并且紧急病症的诊治。
分子检测技术可应用于血流感染病原的检测。但因血液中病原微生物含量低，病原微生物DNA检测受到全血样本中大量红细胞、血红素、白细胞、人基因组等干扰，严重影响了检测的敏感度。Biofire公司的用于血流感染病原的检测的上市产品采用分子检测技术，仅仅用于培养后阳性培养物的病原微生物的检测，无法直接从原始全血直接检测，仍需要血培养才能检测，大大限制了其产品应用。
针对临床血流感染患者，其血液样本中致病菌的含量不大于10CFU/mL，甚至更低的情况。临床需要一种能克服全血样本中大量红细胞、血红素、白细胞、人基因组干扰的检测血流感染病原体的新技术，高敏感、快速的测定引发血流感染的病原，指导抗生素的选择和使用，减少盲目用药，缩短患者治疗时间。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种应用QPCR技术检测血浆中血流感染病原体的方法及相应的检测试剂盒，该试剂盒和检测方法能够准确、快速、灵敏的实现对血流感染病原体的鉴定。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测血浆中血流感染病原体游离核酸的试剂盒，包括扩增血流感染病原体游离DNA的靶序列的引物组和检测探针。
本发明所述试剂盒可采用QPCR技术采用血浆作为检测样本，血流感染病原体游离核酸DNA为检测标志物对血浆中血流感染病原体游离核酸DNA进行检测，而非基因组DNA，可以规避全血样本中大量红细胞、血红素、白细胞、人基因组对血流感染病原体检测的干扰。本发明所述试剂盒可以通过提取血浆中的病原体游离核酸DNA，检测病原体特征性的游离核酸DNA，从而鉴定出血流感染的病原体类型。
在本发明中，所述血流感染病原体为肺炎克雷伯菌、黄曲霉、铜绿假单胞菌中的至少一种。
在一些实施方案中，所述血流感染病原体为肺炎克雷伯菌、黄曲霉和铜绿假单胞菌。
在本发明中，所述靶区段序列为高丰度靶序列。
在一些实施方案中，所述试剂盒中，
所述肺炎克雷伯菌游离DNA的靶序列的扩增引物组的序列如SEQ ID NO：1和2所示，检测探针的序列如SEQ ID NO：3所示；
所述黄曲霉游离DNA的靶序列的扩增引物组的序列如SEQ ID NO：4和5所示，检测探针的序列如SEQ ID NO：6所示；
所述铜绿假单胞菌游离DNA的靶序列的扩增引物组的序列如SEQ ID NO：7和8所示，检测探针的序列如SEQ ID NO：9所示。
在本发明中，所述试剂盒还可以包括用于扩增内标片段的引物组和/或检测探针。
在一些实施方案中，所述内标片段的序列如SEQ ID NO：10(5’-3’gatgaagttg gtggtgaggccctgggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggca)所示。
在一些具体实施例中，所述扩增内标片段的引物组的序列如SEQ ID NO：11和12所示，检测探针的序列如SEQ ID NO：13所示。
进一步的，在本发明中，所述试剂盒还可以包括血浆核酸游离DNA提取试剂、PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、阳性对照、阴性对照、酶混合液中的至少一种。
所述血浆核酸游离DNA提取试剂可用于提取血浆中的病原体游离核酸DNA。本领域技术人员可以理解，所述核酸游离DNA提取试剂也可以按照现有配方自行配制提取试剂，亦可采用核酸游离DNA提取试剂盒预先提取游离核酸DNA。比如QIAamp Circulating NucleicAcid Kit。
所述PCR反应缓冲液为PCR反应常用试剂，主要成份为缓冲盐溶液、表面活性剂、PCR增强剂等，可以按照现有配方配制获得。在一些实施方案中，所述PCR反应缓冲液的配方为50mM Tirs-HCl，100mM KCl，2.5mMMgCl2，1mM DTT，0.04％吐温-20，3％海藻糖。
在本发明中，所述试剂盒中所述酶混合液由耐热DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶组成。
本发明还提供了一种检测血浆中血流感染病原体游离核酸的方法，以血浆作为检测样本，血流感染病原体游离核酸DNA为检测标志物，以血流感染病原体游离DNA的靶序列的引物组和检测探针对血浆中血流感染病原体游离核酸进行QPCR检测。
本发明所述检测方法可以规避全血样本中大量红细胞、血红素、白细胞、人基因组对血流感染病原体检测的干扰，通过提取血浆中的病原体游离核酸DNA，检测病原体特征性的游离核酸DNA，从而鉴定出血流感染的病原体类型。本发明所述检测方法采用QPCR方法，而非测序方法，便于临床应用。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种应用QPCR技术检测血浆中血流感染病原体游离核酸的试剂盒及检测方法。本发明所述检测血浆中血流感染病原体游离核酸的试剂盒，包括扩增血流感染病原体游离DNA的靶序列的引物组和检测探针。本发明所述试剂盒针对血浆样本中血流感染病原体肺炎克雷伯菌、黄曲霉、铜绿假单胞菌的游离核酸DNA具有良好的特异性，结合QPCR检测方法，能够实现对血浆样本中肺炎克雷伯菌、黄曲霉、铜绿假单胞菌等血流感染病原体的快速、准确、灵敏的鉴定，为诊断肺炎克雷伯菌、黄曲霉、铜绿假单胞菌核酸提供可靠的实验依据，解决了现有试剂盒效率低、特异性差和灵敏度低的技术问题。本发明所述试剂盒及检测方法操作简便，检测特异性好、灵敏度高、检测范围宽。实验表明，本发明所述试剂盒检测肺炎克雷伯菌、黄曲霉、铜绿假单胞菌的最低检测限分别为0.2CFU/ml、0.4CFU/ml、0.3CFU/ml。
具体实施方式
本发明公开了一种检测血浆中血流感染病原体游离核酸的试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂、仪器均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1血浆样本中血流感染病原体游离核酸的提取
用无菌的5ml离心管收集1.2ml经K2EDTA处理的人血浆样本，采用凯杰公司游离核酸提取试剂盒QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit进行提取，操作步骤按照说明书进行，提取后核酸放在-75℃温度以下保存备用。
实施例2、引物、探针优化实验
因游离DNA均为短片段，不同靶序列在血浆中丰度有差异。针对肺炎克雷伯菌、黄曲霉、铜绿假单胞菌设计不同靶基因序列，不同扩增片段长度，采用阳性患者的血浆，提取游离DNA，对引物、探针进行筛选。
表1引物、探针的筛选序列
针对同一份样本，检测Ct值越小说明引物、探针组合检测敏感度越高。根据表1结果确定了高敏感性的引物、探针，序列如表2所示。
表2高敏感性的引物、探针序列
实施例3、肺炎克雷伯菌、黄曲霉、铜绿假单胞菌三联核酸检测试剂盒的制备
试剂盒中的引物、探针序列如表2所示。
试剂盒中还包括内标引物和内标探针，序列如下：
内标正向引物：5’-3’gatgaagttggtggtgaggcc(SEQ ID NO：11)；
内标反向引物：5’-3’tgcccagtttctattggtctcc(SEQ ID NO：12)；
内标探针：5’-3’gttccaccagaaaaaggaaccagacagg(SEQ ID NO：13)；
试剂盒中还包括：10mM的dNTPs，5U/μl的Taq酶、50mM的MgCl2。试剂盒还包括阴性对照(无菌水)和阳性对照(人工合成的浓度1×106Copies/ml的假病毒)。
实施例4、本发明的检测方法
本发明的检测方法为Real time QPCR，每个检测体系的组成如表3。
表3检测体系
| 成分 | 用量 |
| 10mM的dNTPs | 2μl |
| 5U/μl的Taq酶 | 0.5μl |
| 50mM的MgCl2 | 1.5μl |
| 20mM的肺炎克雷伯菌正向引物 | 1μl |
| 20mM的肺炎克雷伯菌反向引物 | 1μl |
| 20mM的肺炎克雷伯菌探针 | 0.5μl |
| 20mM的黄曲霉正向引物 | 1μl |
| 20mM的黄曲霉反向引物 | 1μl |
| 20mM的黄曲霉探针 | 0.5μl |
| 20mM的铜绿假单胞菌正向引物 | 1μl |
| 20mM的铜绿假单胞菌反向引物 | 1μl |
| 20mM的铜绿假单胞菌探针 | 0.5μl |
| 20mM的内标正向引物 | 0.7μl |
| 20mM的内标反向引物 | 0.7μl |
| 20mM的内标探针 | 0.4μl |
| 灭菌纯化水 | 补足至25μl |
荧光检测通道选择：
(1)选择FAM通道(ReporTer：FAM，QuenCher：none)，检测肺炎克雷伯菌；
(2)选择ROX通道(ReporTer：ROX，QuenCher：none)，检测黄曲霉；
(3)选择CY5通道(ReporTer：CY5，QuenCher：none)，检测铜绿假单胞菌；
(4)选择HEX通道，检测内标；
(5)参比荧光(PAssive ReferenCe)设置为none。
反应结束后，荧光定量PCR仪器自动保存结果，利用荧光定量PCR仪器自带的QPCR数据分析软件进行自动分析或手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析，然后记录样本CT值和定值结果。具体测试结果分析如下：
SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.9所示探针通道无荧光值，且SEQ IDNO.13所示探针通道的CT值≤35，报告检测结果为阴性；
SEQ ID NO.3所示探针通道的CT值≤38，但SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.9所示探针通道的CT值≥38，且SEQ ID NO.13所示探针通道CT值≤35，报告为肺炎克雷伯菌阳性；
SEQ ID NO.6所示探针通道CT值皆≤38，但SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.9所示探针通道的CT值≥38，且SEQ ID NO.13所示探针通道CT值≤35，报告为黄曲霉阳性；
SEQ ID NO.9所示探针通道CT值皆≤38，但SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示探针通道CT值≥38，报告为铜绿假单胞菌阳性；
当SEQ ID NO.13所示探针通道CT值>35，出现阴性对照有CT值或呈典型S扩增曲线、阳性对照无CT值或无扩增曲线两种情况中的任一种时，该检测结果无效，应查找并排除原因，并重复试验。
实施例5、本发明试剂盒的可行性试验
1、最低检测限(LOD)试验
(1)肺炎克雷伯菌、黄曲霉、铜绿假单胞菌三联核酸检测试剂配制：采用实施例3的方法制备肺炎克雷伯菌、黄曲霉、铜绿假单胞菌三联核酸检测试剂。
(2)血浆样本中血流感染病原体游离核酸的提取：通过实施例1的方法提取样本中核酸备用。
(3)样本检测
将25μl处理好的标本上清加入到肺炎克雷伯菌、黄曲霉、铜绿假单胞菌三联核酸检测试剂反应管中，每个浓度20个复孔，同时加入25μl纯净水到检测液中作为阴性对照，按照实施例4的检测方法进行检测。
(4)结果分析
通过采用实施例3制备的试剂盒和采用实施例4的检测方法对肺炎克雷伯菌、黄曲霉、铜绿假单胞菌三联核酸检测试剂各浓度梯度的样本进行检测，结果显示，所述检测方法的检测灵敏度：LOD肺炎克雷伯菌为0.2CFU/ml，黄曲霉为0.4CFU/ml，铜绿假单胞菌为为0.3CFU/ml。具体数据见表5、表6、表7。
表5肺炎克雷伯菌检测限确认
| 样本浓度(CFU/ml) | 检测重复数 | 阳性检测数 | 阳性检出率 |
| 0 | 21 | 0 | 0.00％ |
| 0.075 | 21 | 16 | 76.19％ |
| 0.2 | 21 | 21 | 100.00％ |
| 0.4 | 21 | 21 | 100.00％ |
| 0.8 | 21 | 21 | 100.00％ |
表6黄曲霉检测限确认
| 样本浓度(CFU/ml) | 检测重复数 | 阳性检测数 | 阳性检出率 |
| 0 | 21 | 0 | 0.00％ |
| 0.15 | 21 | 15 | 71.43％ |
| 0.4 | 21 | 21 | 100.00％ |
| 0.8 | 21 | 21 | 100.00％ |
| 1.6 | 21 | 21 | 100.00％ |
表7铜绿假单胞菌检测限确认
| 样本浓度(CFU/ml) | 检测重复数 | 阳性检测数 | 阳性检出率 |
| 0 | 21 | 0 | 0.00％ |
| 0.12 | 21 | 14 | 66.67％ |
| 0.3 | 21 | 21 | 100.00％ |
| 0.6 | 21 | 21 | 100.00％ |
| 1.2 | 21 | 21 | 100.00％ |
2、与其它疾病的交叉反应情况
(1)肺炎克雷伯菌、黄曲霉、铜绿假单胞菌三联核酸检测试剂配制：采用实施例3的方法制备肺炎克雷伯菌、黄曲霉、铜绿假单胞菌三联核酸检测试剂。
(2)交叉病原体样本提取
将管中的金黄色葡萄球菌、新生隐球菌、白喉杆菌、流感嗜血杆菌、变性杆菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、米根霉、白色念珠菌、白假丝酵母通过实施例1的方法提取样本中核酸备用。
(3)样本检测
将25μl处理好的标本上清加入到肺炎克雷伯菌、黄曲霉、铜绿假单胞菌三联核酸检测试剂反应管中，同时加入25μl纯净水到检测液中作为阴性对照，提取的肺炎克雷伯菌、黄曲霉、铜绿假单胞菌作为阳性对照试验，按照实施例4中检测方法进行检测。
(4)结果分析
通过采用实施例3制备的试剂盒和采用实施例4的检测方法对肺炎克雷伯菌、黄曲霉、铜绿假单胞菌以外的其它病原体进行检测，结果显示：本发明所述试剂盒对肺炎克雷伯菌、黄曲霉、铜绿假单胞菌阳性对照检测结果为阳性，阴性对照检测结果为阴性，与金黄色葡萄球菌、新生隐球菌、白喉杆菌、流感嗜血杆菌、变性杆菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、米根霉、白色念珠菌、白假丝酵母等病原体感染样本无交叉反应，表明本发明所述试剂盒具有高特异性。具体结果如表8。
表8交叉反应实验
| 样本名称 | 检测结果 | 样本名称 | 检测结果 |
| 肺炎克雷伯菌 | 阳性 | 变性杆菌 | 阴性 |
| 黄曲霉 | 阳性 | 肺炎链球菌 | 阴性 |
| 铜绿假单胞菌 | 阳性 | 大肠埃希菌 | 阴性 |
| 金黄色葡萄球菌 | 阴性 | 米根霉 | 阴性 |
| 新生隐球菌 | 阴性 | 白色念珠菌 | 阴性 |
| 白喉杆菌 | 阴性 | 白假丝酵母 | 阴性 |
| 流感嗜血杆菌 | 阴性 | 阴性对照 | 阴性 |
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 郑州安图生物工程股份有限公司
<120> 一种检测血浆中血流感染病原体游离核酸的试剂盒
<130> MP1927517
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccccgtcaat tcatttgagt tt 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggagctaacg cgttaaatcg ac 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccttgcggcc gtactcccca g 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccatggcgac gaactttgg 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcgggttgcc tgaaacagta g 21
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agcatctcca ggcacacatg atggtc 26
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggcatgcgcc gacctact 18
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctggttcctt tttctggtgg aac 23
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttgcctcagg atcgaggcgg c 21
<210> 10
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gatgaagttg gtggtgaggc cctgggcagg ttggtatcaa ggttacaaga caggtttaag 60
gagaccaata gaaactgggc a 81
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gatgaagttg gtggtgaggc c 21
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgcccagttt ctattggtct cc 22
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gttccaccag aaaaaggaac cagacagg 28
Claims (6)
1.一种检测血浆中血流感染病原体游离核酸的试剂盒，包括：
肺炎克雷伯菌游离DNA的靶序列的扩增引物组的序列如SEQ ID NO：1和2所示，检测探针的序列如SEQ ID NO：3所示；
黄曲霉游离DNA的靶序列的扩增引物组的序列如SEQ ID NO：4和5所示，检测探针的序列如SEQ ID NO：6所示；
铜绿假单胞菌游离DNA的靶序列的扩增引物组的序列如SEQ ID NO：7和8所示，检测探针的序列如SEQ ID NO：9所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，还包括用于扩增内标片段的引物组和/或检测探针。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，所述内标片段的序列如SEQ ID NO：10所示。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，所述扩增内标片段的引物组的序列如SEQ ID NO：11和12所示，检测探针的序列如SEQ ID NO：13所示。
5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，还包括血浆核酸游离DNA提取试剂、PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、阳性对照、阴性对照、酶混合液中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，所述酶混合液由耐热DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶组成。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911221222.5A CN110714090B (zh) | 2019-12-03 | 2019-12-03 | 一种检测血浆中血流感染病原体游离核酸的试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
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