CN114592080B - 检测四种病原菌的RT-ddPCR试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及核酸检测技术领域，尤其涉及检测四种病原菌的RT‑ddPCR试剂。本发明提供了检测四种病原菌的RT‑ddPCR引物探针组和检测试剂和检测方法。该引物探针组制成的试剂盒适合用于对同时含有DNA和RNA的样品的检测，样品裂解后的上清液直接作为检测的模板即可获得良好的检测效果，检测的灵敏性优于仅对DNA进行检测，且不对特异性产生不良影响。

Description

检测四种病原菌的RT-ddPCR试剂
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域，尤其涉及检测四种病原菌的RT-ddPCR试剂。
背景技术
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)原称绿脓杆菌。在自然界分布广泛，为土壤中存在的最常见的细菌之一。经常引起术后伤口感染，也可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等。本菌引起的感染病灶可导致血行散播，而发生菌血症和败血症。烧伤后感染了铜绿色假单胞菌可造成死亡。
大肠杆菌(Escherichia coli)，又叫大肠埃希氏菌，Escherich在1885年发现的。大肠杆菌是条件致病菌，在一定条件下可以引起人和多种动物发生胃肠道感染或尿道等多种局部组织器官感染。
鲍曼不动杆菌(学名：Acinetobacter baumannii，俗称：AB菌)，又称鲍氏不动杆菌，属于革兰氏阴性菌，是一种严格需氧、非乳糖发酵的条件致病菌，通常会引起菌血症，肺炎，脑膜炎，腹膜炎，心内膜炎，以及泌尿道和皮肤感染。
肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)是肠杆菌科克雷伯氏菌属中最为重要的一类菌(俗称肺炎杆菌)，其所致疾病占克雷伯氏菌属感染的95％以上。存在于人体上呼吸道和肠道，当机体抵抗力降低时，便经呼吸道进入肺内而引起大叶或小叶融合性实变，以上叶较为多见。
铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌是临床上常见的致病菌，在环境中存在也十分的广泛，现有技术中对治病菌的检测往往仅对样品的DNA进行检测，这样可以提高检测的准确性，但灵敏性往往不足，Chelex裂解产物为总核酸，即同时包括DNA和RNA，对DNA和RNA同时检测可以提高检测的灵敏性，但因Chelex裂解产物成分复杂，对检测的引物存在更高的要求。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供以含有DNA和RNA的样品为对象，检测四种病原菌的RT-ddPCR试剂。
本发明提供了检测铜绿假单胞菌的引物探针组，其包括：
如SEQ ID NO:1所示序列的上游引物、
如SEQ ID NO:2所示序列的下游引物、
和如SEQ ID NO:3所示序列的探针。
其中，如SEQ ID NO:3所示序列的探针的两端分别修饰荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1。
本发明提供了检测大肠杆菌的引物探针组，其包括：
如SEQ ID NO:4所示序列的上游引物、
如SEQ ID NO:5所示序列的下游引物、
和如SEQ ID NO:6所示序列的探针。
其中，如SEQ ID NO:6所示序列的探针的两端分别修饰荧光基团VIC和淬灭基团BHQ1。
本发明提供了检测肺炎克雷伯菌的引物探针组，其包括：
如SEQ ID NO:7所示序列的上游引物、
如SEQ ID NO:8所示序列的下游引物、
和如SEQ ID NO:9所示序列的探针。
其中，如SEQ ID NO:9所示序列的探针的两端分别修饰荧光基团ROX和淬灭基团BHQ2。
本发明提供了检测鲍曼不动杆菌的引物探针组，其包括：
如SEQ ID NO:10所示序列的上游引物、
如SEQ ID NO:11所示序列的下游引物、
和如SEQ ID NO:12所示序列的探针。
其中，如SEQ ID NO:12所示序列的探针的两端分别修饰荧光基团CY5和淬灭基团BHQ2。
本发明还提供了一种检测四种病原菌的试剂盒，其包括所述的引物探针组。
本发明所述的试剂盒中，还包括内参基因的检测引物探针组合。
本发明选择外源基因片段作为内参，其上游引物如SEQ ID NO:13所示，其下游引物如SEQ ID NO:14所示，其探针的核酸序列如SEQ ID NO:15所示。其探针的两端分别修饰A425荧光基团，和BHQ1淬灭基团。
本发明所述的试剂盒中还包括RT-ddPCR检测试剂和样品前处理试剂。
本发明中，所述样品前处理试剂包括Chelex裂解液。
本发明中，所述四种病原菌为铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌。
本发明还提供了同时检测四种病原菌的方法，其以本发明所述的试剂盒对样品进行检测，所述样品为含有DNA和RNA的样品。
本发明提供的检测试剂盒不仅能够实现对人体或动物体样本进行检测，还能够对来自环境的样本进行检测，例如实验室物品、生活用品、动物饲料、土壤和/或水样。
本发明中，所述检测的体系包括：5×ddPCR Mix、2×RT ddPCR Mix 7.5μL、样品2μL、引物各0.15μL，探针各0.0375μL，水补足15μL。
本发明中，所述探针的储存浓度为100μM，所述的引物的储存浓度为100μM。
本发明中，所述检测的程序包括：42℃30min，98℃5min，(98℃15s，60℃60s)×40。
本发明提供了检测四种病原菌的RT-ddPCR引物探针组和检测试剂和检测方法。该引物探针组制成的试剂盒适合用于对同时含有DNA和RNA的样品的检测，样品裂解后的上清液直接作为检测的模板即可获得良好的检测效果，检测的灵敏性优于仅对DNA进行检测，且不对特异性产生不良影响。
具体实施方式
本发明提供了检测四种病原菌的RT-ddPCR试剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1引物探针设计
1、依据铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌的序列分别设计相应的引物探针。具体信息如下：
2、样品来源
铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌菌株来自于外部采购。
3、菌液核酸提取
3.1取1mL菌液采用1mL生理盐水充分混匀菌液，12000rpm离心5min，弃上清。
3.2加入200μLChelex-100裂解液，充分震荡5min，瞬时离心，沸水煮5min，12000rpm离心5min，取上清液进行后续测试。
3.3以天根细菌DNA提取试剂提取相同的1mL菌液DNA作为对照。
4、检测
以本发明提供的引物探针分别对菌液DNA和裂解液(总核酸)进行检测：
4.1 DNA检测
4.2总核酸检测
5、检测结果
5.1以5XddPCR Mix作为扩增试剂检测DNA的结果
5.2以2XRT ddPCR Mix作为扩增试剂同时检测总核酸(DNA和RNA)的结果
6结论
本试剂盒包含的5重体系，分别检测DNA和总核酸，总核酸的检测值远高于单独检测DNA，说明本发明提供的引物、探针更适合用于总核酸的检测。且对样品的总核酸进行检测能够进一步提高检测体系的敏感性；并且阳性样品做了两个重复，检测的结果也比较稳定，说明了检测体系的稳定性；体系内部的特异性也正常，四种菌没有交叉。但实验中，采用其他序列的引物或探针组合无法获得如此良好的检测效果，例如，在灵敏性方面，改变引物探针序列则无法达到类似效果。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 领航基因科技（杭州）有限公司
<120> 检测四种病原菌的RT-ddPCR试剂
<130> MP22002394
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacggatgga tgagcgc 17
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcaggaagcg cagcaact 18
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgtctcgca tgcctatcag gc 22
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaagaaggcc ttcgggttg 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tctgcgggta acgtcaatga g 21
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cagcggggag gaagggagta aaattaatac c 31
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggacgccact tgctggttc 19
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
catcacccga agatgagttt tg 22
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agtgaaagac gcgtgccgat gtatc 25
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aggcgctcta ccaactaagc taag 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggggtcacaa gttcaagtct tgtc 24
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctataacttc aaccagtcaa agtcatggtg gg 32
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcttcttgtg gagctcgaca a 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccgtcagcaa cttcgttttc a 21
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgcgacggat ctacgtcaca gcg 23

Claims (6)

1.检测四种病原菌的试剂盒，其特征在于，包括如下所述的引物探针组：
检测铜绿假单胞菌的引物探针组，其包括：
如SEQ ID NO:1所示序列的上游引物、
如SEQ ID NO:2所示序列的下游引物、
和如SEQ ID NO:3所示序列的探针；
检测大肠杆菌的引物探针组，其包括：
如SEQ ID NO:4所示序列的上游引物、
如SEQ ID NO:5所示序列的下游引物、
和如SEQ ID NO:6所示序列的探针；
检测肺炎克雷伯菌的引物探针组，其包括：
如SEQ ID NO:7所示序列的上游引物、
如SEQ ID NO:8所示序列的下游引物、
和如SEQ ID NO:9所示序列的探针；
检测鲍曼不动杆菌的引物探针组，其包括：
如SEQ ID NO:10所示序列的上游引物、
如SEQ ID NO:11所示序列的下游引物、
和如SEQ ID NO:12所示序列的探针。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，
如SEQ ID NO:3所示序列的探针的两端分别修饰荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1；
如SEQ ID NO:6所示序列的探针的两端分别修饰荧光基团VIC和淬灭基团BHQ1；
如SEQ ID NO:9所示序列的探针的两端分别修饰荧光基团ROX和淬灭基团BHQ2；
如SEQ ID NO:12所示序列的探针的两端分别修饰荧光基团A425和淬灭基团BHQ1。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括RT-ddPCR检测试剂和样品前处理试剂，所述样品前处理试剂包括Chelex裂解液。
4.非诊断目的检测四种病原菌的方法，其特征在于，以权利要求1～3任一项所述的试剂盒对样品进行检测，所述样品为含有DNA和RNA的样品。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述检测的体系包括：
5×ddPCR Mix、样品2μL、引物各0.15μL，探针各0.0375μL，水补足15μL以及2×ddPCRRT Mix 7.5μL、样品2μL、引物各0.15μL，探针各0.0375μL，水补足15μL。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述检测的程序包括：98℃5min，(98℃15s，60℃60s)×40以及42℃30min，98℃5min，(98℃15s，60℃60s)×40。
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