CN104560981B - 一种检测细菌喹诺酮类耐药基因的引物及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测细菌喹诺酮类耐药基因的引物及试剂盒，属于微生物检测技术领域。本发明提供的检测细菌喹诺酮类耐药基因的引物如SEQ ID NO：1～6所示，这三种引物对能特异地扩增出多种细菌的qnrA、qnrB、qnrS三种喹诺酮类耐药基因。本发明还公开了检测细菌喹诺酮类耐药基因的试剂盒，该试剂盒中含有EvaGreen荧光染料，能实现快速检测细菌喹诺酮类抗生素相关耐药基因。本发明具有操作简便、特异性强、敏感性高、成本低廉及高通量等优点，可用于临床致病性细菌喹诺酮类耐药基因相关耐药基因的快速检测，为临床治疗提供参考。

Description

一种检测细菌喹诺酮类耐药基因的引物及试剂盒

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种检测细菌喹诺酮类耐药基因的引物及试剂盒。

背景技术

喹诺酮类是近年来临床引用较广的一种新型广谱抗菌剂，是人工合成的含4-喹诺酮基本结构的抗菌药。喹诺酮类和其他抗菌药的作用点不同，它们以细菌的脱氧核糖核酸(DNA)为靶。细菌的双股DNA扭曲成为袢状或螺旋状(称为超螺旋)，使DNA形成超螺旋的酶称为DNA回旋酶，喹诺酮类妨碍此种酶，进一步造成细菌DNA的不可逆损害，而使细菌细胞不再分裂。

喹诺酮类抗生素在临床上不仅对革兰氏阴性菌有较强的抗菌作用，而且对革兰阳性菌也有较强的抗菌作用。由于具有抗菌作用强、感染部位浓度高、不良反应轻微、血半衰期长、使用方便、患者耐受性好及价格相对较低等特点，使其在细菌性感染治疗中具有一定的优势。普遍用于伤寒、急性细菌性痢疾、单纯尿道感染、急性淋病性尿道炎、急性呼吸道感染、军团病、肺结核等。另外，近年来喹诺酮类抗生素在儿科领域也得到了广泛应用，此外，喹诺酮类抗生素是一类人畜通用的药物。因其具有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性和毒副作用小等特点，被广泛应用于畜牧、水产等养殖业中，包括在鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊、鱼、虾、蟹等的养殖中用于疾病防治。

近30年来，由于大量治疗用抗生素在临床的不合理应用，临床疾病相关细菌的耐药性不断增加，引起正常菌群失调和大量耐药菌株出现。耐药菌能够承受住抗生素药物的攻击，这样一来标准的治疗就失去了效果，感染持续存在并可传染他人。喹诺酮类抗菌药由于其高效的抗菌活性，已被越来越多的使用于临床，这当中不免有抗生素滥用的情况，并且其耐药机制多样，使得此类药物的耐药性问题也日益突出。另外，因为在畜牧养殖业中广泛使用喹诺酮类抗生素的情况非常普遍，不仅动物、禽类及鱼类体内残留的抗生素会转移到人体，它们体内产生的耐药菌和耐药基因也会传播给人类。这样就需要一种能方便快捷的检测细菌耐药性的方法，从而来及早发现耐药细菌，进而改变用药方案，指导临床治疗。

耐药性的检测可以分为常规表型检测(即药敏试验)和耐药基因型检测。常规药敏试验首先需要通过培养的方法从临床标本中分离到菌株，而许多生长较慢和不易培养的细菌，是无法通过常规药敏试验检测其耐药性的。在过去的2O年，为适应临床需要，以DNA探针和聚合酶链反应(PCR)为基础的分子手段检测耐药基因取得了很大进展，其中部分方法已被美国食品和药品管理局(FDA)批准用于临床工作。从最初的定性PCR和电泳到后期的基因芯片等技术都可以检测细菌抗生素相关耐药基因，但定性PCR及电泳法具有容易污染、操作繁琐等缺陷，基因芯片技术可同时检测多个耐药基因，但成本也非常高，操作复杂，所需时间长，不适宜临床大规模推广应用。

实时荧光定量PCR技术(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction简称Real Time PCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(或cDNA)进行定量检测的方法。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、成本低廉等特点。目前已有多种运用定量PCR技术的试剂盒应用于临床疾病相关的病原体检测、基因分型、突变研究等。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是，提供一种灵敏、准确、操作简便的新型检测试剂盒，实现对常见细菌喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB、qnrS的快速检测，以弥补现有检测方法的不足。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

检测细菌喹诺酮类耐药基因的引物，它包括如下引物：

(1)扩增qnrA耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示；

(2)扩增qnrB耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示；

(3)扩增qnrS耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5～6所示；

上述3对引物对在一次检测中共同使用。

上述检测细菌喹诺酮类耐药基因的引物在制备检测细菌喹诺酮类耐药基因试剂中的应用也在本发明的保护范围之内。

一种检测细菌喹诺酮类耐药基因的试剂盒，该试剂盒包括如下试剂：

(1)PCR反应液：该PCR反应液中含有DNA聚合酶、EvaGreen荧光染料、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、dATP、dCTP、dTTP和dGTP；

(2)引物混合液：将SEQ ID NO：1～6所示的6种引物混合，用双蒸水溶解，每条引物的浓度为1μmol/L；

(3)阳性对照：分别含有qnrA、qnrB、qnrS耐药基因的三种细菌基因组DNA和大肠杆菌基因组DNA的水溶液；

(4)阴性对照：大肠杆菌基因组DNA的水溶液。

其中，阳性对照中，每一种含耐药基因的细菌基因组DNA浓度为10ng/μL，大肠杆菌基因组DNA浓度为50ng/μL。

其中，阴性对照中，大肠杆菌基因组DNA的浓度为100ng/Μl。

上述的检测细菌喹诺酮类耐药基因的试剂盒在制备细菌喹诺酮类耐药基因检测试剂中的应用也在本发明的保护范围之内。

因为细菌的生长繁殖速度很快，其基因组也经常会发生变异而具有异质性，包含本发明所述的3种耐药基因qnrA、qnrB、qnrS的不同种类的临床致病菌和同一种菌的不同临床隔离菌株所含的基因DNA序列会有所差异，本发明通过从NCBI的基因序列库中比对多种菌及临床隔离株的基因序列，在保守位点设计的特异性引物能扩增临床常见致病菌(主要包括革兰氏阴性杆菌和革兰氏阳性球菌，如大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、金黄色葡萄球菌、粘质沙雷菌、奇异变形杆菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌等)的qnrA、qnrB、qnrS耐药基因。

有益效果：

(1)本发明通过对临床多种细菌及隔离株的喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB、qnrS的序列进行分析，选取保守序列设计引物，能特异性扩增临床常见致病菌的喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB、qnrS。

(2)在检测喹诺酮类耐药基因试剂盒中加入稳定性强、双链结合特异性高、对PCR反应抑制小的EvaGreen荧光染料，能快速、准确地扩增出喹诺酮类耐药基因。

(3)本发明所述的核酸序列和试剂盒具有操作简便、灵敏度高、特异性强、成本低廉及高通量等优点，可用于辅助临床快速诊断致病性细菌喹诺酮类耐药基因的耐药情况，为临床治疗提供参考依据。

附图说明

图1为阳性对照品检测结果图。

图2为阴性对照品检测结果图。

图3为1例大环内酯类抗生素耐药大肠杆菌的耐药基因检测结果图。

图4为1例大环内酯类抗生素敏感肺炎克雷伯菌检测结果图。

图中英文字母对应的中文名称为：

Cycles：循环数；Fluorescence：荧光值；Amplification Curves：扩增曲线；Select：选择；Zoom：放大。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：检测细菌喹诺酮类3种耐药基因耐药基因qnrA、qnrB、qnrS的核酸序列。3对特异性引物委托英潍捷基(上海)贸易有限公司合成：

扩增qnrA耐药基因的引物对：

F1(SEQ ID NO：1)：5′-TTTGATGGTTGCCGCTTTGTC-3′，

R1(SEQ ID NO：2)：5′-CTCTTGACGGTGATCTGGTTGG-3′；

扩增qnrB耐药基因的引物对：

F2(SEQ ID NO：3)：5′-TGAGCGGCACTGAATTTATCG-3′，

R2(SEQ ID NO：4)：5′-CCAACGGTTTTCCCACAGC-3′；

扩增qnrS耐药基因的引物对：

F3(SEQ ID NO：5)：5′-TTTCCAACAATGCCAACTTGC-3′，

R3(SEQ ID NO：6)：5′-TCCAGCGATTTTCAAACAACTC-3′。

实施例2：试剂盒的制备方法。

(1)PCR反应液：Fast EvaGreen qPCR Master Mix(购于美国Biotium公司)，为2*PCR反应酶预混液，其中含有本发明所述的PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、EvaGreen荧光染料、Mg²⁺及dNTPs，-20℃保存；

(2)引物混合液：将SEQ ID NO：1～6所示的核苷酸序列交由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，然后混合于一管中，用双蒸水溶解，每一条引物的终浓度均为1μmol/L，-20℃保存；

(3)阳性对照：分别含有qnrA、qnrB、qnrS耐药基因的三种细菌基因组DNA和大肠杆菌基因组DNA，其中，每一种含耐药基因的细菌基因组DNA浓度为10ng/μL，大肠杆菌基因组DNA浓度为50ng/μL，-20℃保存；

(4)阴性对照：大肠杆菌基因组DNA浓度为100ng/μL，-20℃保存。

实施例3：检测方法。

仪器：Roche480荧光定量PCR检测仪，BECKMAN22R台式微量冷冻离心机，Eppendorf 5810R台式冷冻离心机，太仓华利达实验室设备公司WH-866型涡旋振荡器。

(1)细菌基因组DNA模板的制备：参考公开的文献，不同种类的细菌标本，采用相应的商品化DNA抽提试剂盒，按照试剂盒说明书制备细菌基因组DNA，作为PCR反应模板备用。

(2)以步骤(1)所述基因组DNA为模板，利用5对特异性引物和高性能荧光染料进行细菌喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB、qnrS的扩增检测，具体包括如下步骤；

(2a)PCR反应液配制：从-20℃冰箱取出试剂盒的各组分，室温融化，放冰盒上备用。加样前10分钟之内，按检测样本数配置PCR反应液Xμl：

X＝(10μl PCR反应液A+3μl PCR反应液B+5μl双蒸水)×(n份样本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)。

振荡混匀后，2000rpm离心5s，按每人份18μl分装到96孔PCR反应板中，传至样本制备区备用。

(2b)加样：向分装好试剂的反应孔中，分别加入细菌样本DNA模板2μl(若样本裂解产物保存在-20℃，使用前置室温解冻，以13000rpm离心5min)，阳性对照孔加入2μl阳性对照品，阴性对照孔加入2μl阴性对照品，空白对照孔加入2μl双蒸水，加样过程要求冰上操作。贴好封口膜，3000rpm离心30s，放入仪器进样槽。

(2c)PCR扩增：Roche480荧光定量PCR仪进行细菌喹诺酮类耐药基因检测，反应条件如下：95℃预变性3min；95℃10s，60℃40s，40个循环，荧光采集点在60℃，检测模式设置为染料法，反应体积设置为20。保存文件，运行。

(2d)结果分析，具体包括如下步骤：

Roche480荧光PCR检测仪点击分析，选取定量模式，进入分析窗口，选定噪音线项，阈值设定为刚好超过无规则的噪音线的最高点(可根据实际情况适当调整)，且阳性曲线无拐点，保证噪音线项下的数值和分析项下的域值一致。每次实验空白对照孔无Ct值，结果合格。点击计算，自动计算得到每个测试的CT值。

(2e)阴阳性对照品结果标准及处理，具体按照如下步骤判定：

阴性对照品PCR扩增的Ct值应无数值或大于40且增长曲线不规则；阳性对照品PCR扩增增长曲线呈S型曲线且CT值小于35。

(3)步骤(2)所得的样本耐药基因检测结果判断，具体按照如下标准：

(3a)如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值为无数值或大于40，则判样本结果为阴性。

(3b)如果增长曲线呈S型曲线且Ct值<40，则按以下方法判断：

若样本的CT<35，则判样本结果为阳性；

检测样本Ct≥35，重新配制PCR反应液进行PCR扩增，复查结果如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值为无数值或大于40，则判样本结果为阴性。如果增长曲线呈S型且Ct值仍旧小于40则判样本结果为阳性。

实施例4：临床患者细菌样品检测。

将本发明所述的试剂盒用于40例临床微生物患者细菌样本3种喹诺酮类耐药基因检测，检测体系及检测方法参照实施例3，检测结果与基因芯片法结果进行对比，检测结果如表1所示：

表1样品检测结果对照表

样本号	采用本试剂盒结果	采用基因芯片法结果
			1	阴性	阴性
2	阴性	阴性
			3	阴性	阴性
4	阳性	阳性
			5	阴性	阴性
6	阳性	阳性

7	阴性	阴性
			8	阳性	阳性
9	阳性	阳性
			10	阳性	阳性
11	阴性	阴性
			12	阴性	阴性
13	阳性	阳性
			14	阴性	阴性
15	阴性	阴性
			16	阳性	阳性
17	阴性	阴性
			18	阳性	阳性
19	阴性	阴性
			20	阳性	阳性
21	阳性	阳性
			22	阴性	阴性
23	阴性	阴性
			24	阳性	阳性
25	阴性	阴性
			26	阴性	阴性
27	阴性	阴性
			28	阳性	阳性
29	阳性	阳性
			30	阴性	阴性
31	阳性	阳性
			32	阳性	阳性
33	阴性	阴性
			34	阴性	阴性

35	阴性	阴性
			36	阳性	阳性
37	阴性	阴性
			38	阴性	阴性
39	阳性	阳性
			40	阴性	阴性

利用本发明提供的检测细菌喹诺酮类耐药基因试剂盒分析40例细菌样本得到的检测结果与基因芯片法得到的检测结果一致。利用本发明提供的试剂盒检测的结果的部分图如图1～4所示。其中，图1为阳性对照品检测结果图，Ct值为22.41；图2为阴性对照品检测结果图，Ct值为无数值；图3为1例大环内酯类抗生素耐药大肠杆菌耐药基因检测结果图，阳性对照品Ct值为22.51，阴性对照品Ct值为无数值；患者样本号“14”，Ct值为27.53，结果为耐药基因阳性；图4为1例大环内酯类抗生素敏感肺炎克雷伯菌检测结果图，阳性对照品Ct值为22.51，阴性对照品Ct值为无数值；患者样本号“40”，Ct值为无数值，结果为耐药基因阴性。

40例样品中，17例为喹诺酮类耐药基因阳性，其余23例为阴性。17例喹诺酮耐药菌株主要是革兰氏阴性杆菌和革兰氏阳性球菌，如大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、金黄色葡萄球菌、粘质沙雷菌、奇异变形杆菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌等。本试剂盒具有操作简便快捷，灵敏、特异，成本低廉，能对细菌喹诺酮类耐药基因进行快速检测，用于临床能有利于医师进行快速诊断，改善治疗方案，减少抗生素药物的滥用。该技术方案技术门槛低，且适用于其他类型耐药基因的检测，易于推广，具有较好的应用前景。

Claims (2)

1.一种检测细菌喹诺酮类耐药基因的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如下试剂：

(1)PCR反应液：该PCR反应液中含有DNA聚合酶、EvaGreen荧光染料、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、dATP、dCTP、dTTP和dGTP；

(2)引物混合液：将SEQ ID NO：1～6所示的6种引物混合，用双蒸水溶解，每条引物的浓度为1μmol/L；

(3)阳性对照：分别含有qnrA、qnrB、qnrS耐药基因的三种细菌基因组DNA和大肠杆菌基因组DNA的水溶液；

(4)阴性对照：大肠杆菌基因组DNA的水溶液，

阳性对照中，每一种含耐药基因的细菌基因组DNA浓度为10ng/μL，大肠杆菌基因组DNA浓度为50ng/μL，

阴性对照中，大肠杆菌基因组DNA的浓度为100ng/μL。

2.权利1所述的检测细菌喹诺酮类耐药基因的试剂盒在制备细菌喹诺酮类耐药基因检测试剂中的应用。