CN100412206C - 一种动物源细菌四环素类药物耐药基因多重pcr检测技术 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种动物源细菌四环素类药物耐药基因多重PCR检测技术，该方法包括扩增待测细菌耐药基因的三对PCR引物以及PCR模板制备试剂和细菌耐药基因多重PCR扩增试剂，利用该多重PCR检测技术能扩增待测菌株四环素类药的耐药基因。它具有灵敏度高、特异性高、应用范围广，结果准确可靠的特点。
Description
[发明领域]
本发明涉及动物源细菌四环素类药物耐药基因多重PCR检测方法，属于医学分子生物学领域，具体是关于动物源细菌四环素类药物耐药基因多重PCR检测方法及其在耐药性检测中的应用。
[背景技术]
四环素类药物(Tetracycline，TET)是一类碱性广谱抗生素，包括由链霉菌产生金霉素、土霉素、四环素和去甲金霉素等以及半合成的多西环素和米诺环素。前者在我国较为常用。四环素类药物目前主要用于立克次体、衣原体、支原体及回归热螺旋体等非细菌性感染和布氏杆菌病，以及敏感菌引起的呼吸道、胆道、尿路及皮肤软组织等部位的感染。兽医临床上多用土霉素治疗肠道多种病原菌感染。如沙门菌引起的犊牛、雏鸡白痢及大肠杆菌性仔猪黄痢、白痢；鸡巴氏杆菌引起的禽霍乱；对猪喘气病和猪肺疫也有效，与卡那霉素联合使用可提高疗效；局部应用于各动物组织中坏死杆菌感染引起的坏死或子宫脓肿炎症；可用于血抱子虫感染的牛边缘边虫病、泰乐焦虫病、钩端螺旋体病等。
随着四环素类药物广泛而大量的使用，对这类抗生素耐药的耐药菌株也越来越多，而由于化学结构相似还易产生交叉耐药，耐药谱也越来越广，这极大限制了四环素类抗生素的发展。目前，通过DNA-DNA杂交，已鉴定出三十多种四环素耐药基因，其中革兰氏阴性菌32种，革兰氏阳性菌22种，且常见于多重耐药菌株。
目前我国畜禽耐药性检测控制与畜产品安全生产中，在四环素类药耐药性检测研究方面，对病原菌耐药性基因的研究开展得少，尚无配套的检测试剂盒。传统方法是通过测定细菌的最低抑菌浓度或抑菌圈大小测定细菌的耐药性。传统的药敏试验必须经过繁琐的细菌分离纯化、繁殖扩增等步骤，检测周期长，最快也要48h左右。不利于临床上及时的选药治疗。同时，药敏试验是在体外用药物试探性的检验细菌的表型耐药特性，不能检测细菌的隐型耐药性。
国内外已经从分子水平开展了细菌耐药机理的研究和耐药性相关基因的分子检测。从分子水平进行细菌耐药性的检测，不仅大大地缩短常规检测的时间，还能够查明细菌耐药性的传播及流行趋势，为控制耐药菌株的产生和流行，新型兽药的研制提供科学的依据，目前，耐药基因检测方法主要有质粒图谱、质粒指纹图谱、质粒消除试验、PCR及PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)、Southern blot、Dot blot、核酸探针检测、DNA的序列测定等。其中，PCR技术具有敏感、特异、快速等优点，可以检测极微量的目的基因进行检测，而不需要经过费时的细菌培养阶段，广泛的应用于细菌耐药性研究。而多重PCR技术是在同一反应体系中加入多对引物对多个目的基因同时进行扩增。它在检测基因过程中可设立内部对照；可指示出模板的数量；可同时扩增几个目的基因；消耗的时间和试剂少，减少准备时间提高效率；可大量地进行样品和目的基因的检测。自从Chamberlain(1988)首次应用多重PCR扩增多个人类肌营养不良蛋白基因以来，多重PCR已发展成为一种通用技术，广泛应用于病原体鉴别、性别筛选、连锁分析、法医研究、模板定量和遗传疾病诊断。在病原体鉴别方面具有突出的优点，多重PCR方法可指示许多病原体中的某一个，或区分同一属中的种或株。近年来，多重PCR技术越来越广泛的应用于细菌耐药性的检测上。
[发明内容]
本发明的目的是提供一种快速检测动物源细菌对四环素类药物耐药基因的多重PCR检测方法
本发明的目的是通过以下方法方案达到的：
一种动物源细菌四环素类药物耐药基因多重PCR检测方法，含有PCR模板制备试剂和细菌耐药基因多重PCR扩增试剂，其特征在于：所述PCR模板制备试剂是由洗涤液、样品处理液组成，所述细菌耐药基因多重PCR扩增试剂包括10倍PCR缓冲液，其组分为50mMKCl、pH8.3的10mM Tris.HCl和0.01％明胶，浓度均为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP，浓度为25mM/LMgCl2，浓度均为25mmol/L三种耐药基因特异性上下游引物，即tetA基因、tetC基因和tetM基因，浓度为2.5U/ULTaq DNA聚合酶和超纯水。所述动物源细菌四环素类药物耐药基因多重PCR扩增试剂各组分的终浓度如下：1倍PCR缓冲液，dGTP、dCTP、dATP和dTTP的终浓度各为0.25mmol/L，MgCl2的终浓度为2.5mM/L，四环素类药物耐药基因tetA、tetC、tetM引物的终浓度分别为1.0mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L，，Taq DNA聚合酶终浓度为1.75U/100UL。
一种优选方法方案，其特征在于：所述三种耐药基因即的特异性上下游引物序列如下表：
一种动物源细菌四环素类药物耐药基因多重PCR检测方法包括以下步骤：
1.PCR模板的制备方法如下：
(1)LB培养基摇瓶培养增菌，包括动物粪样、组织液、血液或其它体液；
(2)取1ml经LB培养基摇瓶培养3-6h的菌液于无菌1.5mlEP管中，8000r/min离心3min，弃上清，再加入1mlPCR模板制备试剂洗涤液，重复离心一次，弃上清，最后加入50-200ulPCR模板制备试剂样品处理液，震荡混匀后备用。
2.动物源细菌四环素类药物耐药基因多重PCR扩增方法如下：
(1)根据现有方法合成上述耐药基因特异性引物tetA、tetC、tetM，用1mmol Tris.Hcl-0.1mmolEDTA缓冲液稀释，使其浓度为25mmol/L；
(2)取10倍的PCR缓冲液，浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP混合物，浓度为25mM/LMgCl2，浓度均为25mmol/L三种耐药基因即tetA基因、tetC基因和tetM基因的特异性上下游引物，浓度为2.5U/ULTaq DNA聚合酶和超纯水装入一无菌的PCR反应薄壁管中。
(3)加入已制备好的模板5μl，补水至总体积50μl后加入20μl矿物油封顶即可。
3.PCR扩增循环参数为：
(1)94℃预变性5min；
(2)然后进入循环：94℃变性60s、56℃退火60s、72℃延伸90s，共35个循环，最后72℃延伸10min后，取出于4℃保存。
4.耐药基因检测结果判定
(1)取5μlPCR产物，与1μl Loadingbuffer混匀后，点样于2％琼脂糖凝胶电泳板孔中，80V电压，电泳40min，于紫外荧光成相仪下拍照判定，结果可见480bp、580bp、915bp的条带，分别指示tetA基因、tetC基因、tetM基因；
(2)直接测序鉴定法：将经过纯化的PCR产物50μl和20μl三基因的上下游引物一起进行DNA测序。
5.动物源细菌四环素类药物耐药基因检测试剂的保存：将动物源细菌四环素类药物耐药基因检测试剂保存于-20℃冰箱中。
一种优选方法方案，其特征在于：所述样品前处理方法只需离心收集菌体后，经样品处理液简单处理即可备用。
一种优选方法方案，其特征在于：所述PCR模板制备试剂洗涤液的成份为：5％的甘油。
一种优选方法方案，其特征在于：所述PCR模板制备试剂样品处理液的成份为：60％的甘油。
一种优选方法方案，其特征在于：所述的动物源细菌四环素类药物耐药基因的多重PCR扩增是将浓度配比适当的三种四环素类耐药基因上下游引物混在一起扩增。
[附图说明]
图1为四环素类耐药基因检测试剂盒阳性对照图。
Claims (3)
1. 一种动物源细菌四环素类药物耐药基因多重PCR检测方法，包括以下步骤：
[1]PCR模板的制备方法如下：
(1)LB培养基摇瓶培养增菌，包括动物粪样、组织液、血液或其它体液；
(2)取1ml经LB培养基摇瓶培养3-6h的菌液于无菌1.5mlEP管中，8000r/min离心3min，弃上清，再加入1mlPCR模板制备试剂洗涤液，重复离心一次，弃上清，最后加入50-200ulPCR模板制备试剂样品处理液，震荡混匀后备用；
[2]动物源细菌四环素类药物耐药基因多重PCR扩增试剂的配制方法如下：
(1)根据现有方法合成耐药基因tetA、tetC、tetM特异性引物，所述特异性引物序列如下：
tetA：For：5’-GGCACCGAATGCGTATGAT-3’Rev：5’-AAGCGAGCGGGTTGAGAG-3’
tetC：For：5’-CTGGGCTGCTTCCTAATGC-3’ Rev：5’-AGCTGTCCCTGATGGTCGT-3’
tetM：For：5’-GAGGTCCGTCTGAACTTTGCG-3’Rev：5’-AGAAAGGATTTGGCGGCACT-3’
用1mmol/L Tris.Hcl-0.1mmol/L EDTA缓冲液稀释上述引物，使其浓度为25mmol/L；
(2)取10倍PCR缓冲液，浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP混合物，浓度为25mM/L的MgCl2，浓度均为25mmol/L的三种耐药基因即tetA基因、tetC基因、tetM基因的上述特异性上下游引物，浓度为2.5U/μL的Taq DNA聚合酶和超纯水装入一无菌的PCR反应薄壁管中；
[3].动物源细菌四环素类药物耐药基因多重PCR检测方法中试剂的组成：
(1)取10倍PCR缓冲液5μl，浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP混合物4μl，浓度为25mM/LMgCl25μl，浓度为2.5U/ULTaq DNA聚合酶0.35μl，浓度均为25mmol/L的三种耐药基因即tetA基因、tetC基因、tetM基因的上述特异性上下游引物分别1.0μl、0.3μl、0.4μl于一无菌的PCR反应薄壁管中；
(2)加入已制备好的模板5μl，补水至总体积50μl后加入20μl矿物油封顶即可；
[4].PCR扩增循环参数为：
(1)94℃预变性5min；
(2)然后进入循环：94℃变性60s、56℃退火60s、72℃延伸90s，共35个循环，最后72℃延伸10min后，取出于4℃保存；
[5]耐药基因检测结果判定
(1)取5μl PCR产物，与1μl Loading buffer混匀后，点样于2％琼脂糖凝胶电泳板孔中，80V电压，电泳40min，于紫外荧光成相仪下拍照判定，如果可见480bp、580bp、910bp的条带，分别指示tetA基因、tetC基因、tetM基因的存在；
(2)直接测序鉴定法：将经过纯化的PCR产物50μl和20μl三基因的上下游引物一起进行DNA测序。
2. 根据权利要求1所述的耐药基因多重PCR检测方法，其特征在于：所述PCR模板制备试剂洗涤液的成份为：5％的甘油。
3. 根据权利要求1所述的耐药基因多重PCR检测方法，其特征在于：所述PCR模板制备试剂样品处理液的成份为：60％的甘油。
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