CN107164505A - 一种用于检测b族链球菌四环素耐药基因的分子标记及其应用 - Google Patents

一种用于检测b族链球菌四环素耐药基因的分子标记及其应用 Download PDF

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李苏杨
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Abstract

本发明公开了一种用于检测B族链球菌四环素耐药基因的分子标记及其应用，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。(1)本发明所述分子标记具有特异性好、灵敏度高、稳定性好的优点；(2)本发明所述分析标记能够有效检测耐药基因，确定造成耐药的原因，了解耐药流行株的发生、发展、传播规律，对预防和控制耐药发展起着非常重要的作用。

Description

一种用于检测B族链球菌四环素耐药基因的分子标记及其 应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段检测微生物耐药基因的方法，具体为一种用于检测B族链球菌四环素耐药基因的分子标记及其应用。
背景技术
B族链球菌学名为无乳链球菌，是一种有荚膜的细菌，能够引起牛乳房炎，危害牧业非常严重，所以早为畜医界注目。后来发现该细菌能够感染人类，尤其是新生儿。该细菌所引起的败血症、脑膜炎、肺炎等疾病的死亡率极高，并且通常伴有神经系统后遗症，由此又被医学界所重视。
B族链球菌是妇女生殖道常见的携带菌，也是妇女围产期感染、泌尿道感染、新生儿菌血症、心内膜炎等主要病原菌。目前治疗B族链球菌感染多选用β内酰胺类抗生素，对有过敏体质或轻微感染患者，常用大环内酯类抗生素替代。随着大环内酯类抗生素的使用显著增加，导致大量耐药菌株出现，我国有关B族链球菌耐药性及耐药基因谱的资料少见报道。
发明内容
本发明的目的是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种能够特异性检测B族链球菌耐药基因的方法，本发明提供了一种用于检测B族链球菌四环素耐药基因的分子标记及其应用。
技术方案：一种用于检测B族链球菌四环素耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
优选的，所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5’端进行氨基化修饰并附加10个碱基T。
表1分子标记序列
所述分子标记在制备检测B族链球菌四环素耐药基因试剂盒中的应用。
优选的，所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
优选的，所述试剂盒检测B族链球菌四环素耐药基因的步骤包括：
(1)取样：选取纯化后的B族链球菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌EP管中加入10～60μL 60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；
(2)以步骤(1)收集的菌体作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释50～200倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
优选的，所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LATaq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
优选的，所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
优选的，所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
优选的，所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
有益效果：(1)本发明所述分子标记具有特异性好、灵敏度高、稳定性好的优点；(2)本发明所述分析标记能够有效检测耐药基因，确定造成耐药的原因，了解耐药流行株的发生、发展、传播规律，对预防和控制耐药发展起着非常重要的作用。
附图说明
图1是实施例1～3检测结果图；
其中，1为分子量为2000bp的Maker；2为实施例1PCR产物电泳结果；3为实施例2PCR产物电泳结果；4为实施例3PCR产物电泳结果。
具体实施方式
实施例1
一种用于检测B族链球菌四环素耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5’端进行氨基化修饰并附加10个碱基T。
所述分子标记在制备检测B族链球菌四环素耐药基因试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
所述试剂盒检测B族链球菌四环素耐药基因的步骤包括：
(1)取样：选取纯化后的B族链球菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌EP管中加入10μL 60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；
(2)以步骤(1)收集的菌体作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释50倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LATaq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
实施例2
一种用于检测B族链球菌四环素耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5’端进行氨基化修饰并附加10个碱基T。
所述分子标记在制备检测B族链球菌四环素耐药基因试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
所述试剂盒检测B族链球菌四环素耐药基因的步骤包括：
(1)取样：选取纯化后的B族链球菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌EP管中加入30μL 60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；
(2)以步骤(1)收集的菌体作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释150倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释50倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LATaq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
实施例3
一种用于检测B族链球菌四环素耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5’端进行氨基化修饰并附加10个碱基T。
所述分子标记在制备检测B族链球菌四环素耐药基因试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
所述试剂盒检测B族链球菌四环素耐药基因的步骤包括：
(1)取样：选取纯化后的B族链球菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌EP管中加入60μL 60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；
(2)以步骤(1)收集的菌体作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释200倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LATaq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州乔纳森新材料科技有限公司
<120> 一种用于检测B族链球菌四环素耐药基因的分子标记及其应用
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aggaacgaat atcgcacctg aaat 24
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgctgggca atctacgttt ct 22
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgaaacgatt tatcgcacct gaaat 25
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgctgccca atcaatgttt ct 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgtactggga gctggtttag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cggcggtttg ctaagctgat 20

Claims (9)

1.一种用于检测B族链球菌四环素耐药基因的分子标记，其特征在于，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测B族链球菌四环素耐药基因的分子标记，其特征在于，所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5，端进行氨基化修饰并附加10个碱基T。
3.权利要求1或2所述分子标记在制备检测B族链球菌四环素耐药基因试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒检测B族链球菌四环素耐药基因的步骤包括：
(1)取样：选取纯化后的B族链球菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌EP管中加入10～60μL 60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；
(2)以步骤(1)收集的菌体作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释50～200倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LATaq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59109178A (ja) * 1982-12-16 1984-06-23 Meiji Milk Prod Co Ltd プラスミドｐＳＬ２及びその調製法
CN1944669A (zh) * 2006-10-20 2007-04-11 四川大学 一种动物源细菌四环素类药物耐药基因多重pcr检测技术
CN101560552A (zh) * 2008-12-31 2009-10-21 云南大学 猪源大肠杆菌中抗四环素基因tet(B)的PCR检测方法
CN104212902A (zh) * 2014-09-05 2014-12-17 郑秋月 用于耐四环素大肠杆菌检测的组合物
CN104561342A (zh) * 2015-01-23 2015-04-29 杭州迪安医学检验中心有限公司 一种检测细菌四环素类耐药基因的引物及试剂盒
CN105368951A (zh) * 2015-12-04 2016-03-02 中国人民解放军疾病预防控制所 用于检测艰难梭菌的四环素耐药基因（tet M）的LAMP试剂盒及其专用引物

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59109178A (ja) * 1982-12-16 1984-06-23 Meiji Milk Prod Co Ltd プラスミドｐＳＬ２及びその調製法
CN1944669A (zh) * 2006-10-20 2007-04-11 四川大学 一种动物源细菌四环素类药物耐药基因多重pcr检测技术
CN101560552A (zh) * 2008-12-31 2009-10-21 云南大学 猪源大肠杆菌中抗四环素基因tet(B)的PCR检测方法
CN104212902A (zh) * 2014-09-05 2014-12-17 郑秋月 用于耐四环素大肠杆菌检测的组合物
CN104561342A (zh) * 2015-01-23 2015-04-29 杭州迪安医学检验中心有限公司 一种检测细菌四环素类耐药基因的引物及试剂盒
CN105368951A (zh) * 2015-12-04 2016-03-02 中国人民解放军疾病预防控制所 用于检测艰难梭菌的四环素耐药基因（tet M）的LAMP试剂盒及其专用引物

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LACKS,S.A.ET AL.: "Streptococcus agalactiae plasmid pLS1, complete sequence, ACCESSION: NC_001380", 《GENBANK》 *
TETTELIN,H.ET AL.: "Streptococcus agalactiae 2603V/R chromosome, complete genome, ACCESSION: NC_004116", 《GENBANK》 *
杜琳等: "内蒙古无乳链球菌耐药性及四环素耐药基因检测", 《华中农业大学学报》 *

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