CN103088146B - 一种检测含有kpc-15基因肺炎克雷伯菌的pcr试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测含有KPC-15基因肺炎克雷伯菌的PCR试剂盒，所述试剂盒含有扩增KPC-15基因的特异性引物KPC-15TF和KPC-15TR，所述引物的序列分别如序列表中SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。本发明还公开了所述的所述试剂盒的使用方法。本发明的PCR试剂盒有利于监测耐药菌株、指导临床合理用药、减少耐药菌产生和传播。

Description

一种检测含有KPC-15基因肺炎克雷伯菌的PCR试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及肺炎克雷伯临床耐药菌株，具体涉及一株肺炎克雷伯临床耐药菌株携带有新耐药的基因KPC-15。本发明还涉及检测携带有KPC-15基因的PCR检测方法。

背景技术

肺炎克雷伯菌是医院感染的常见病原菌，其耐药的主要机制是细菌产生质粒介导的超广谱-内酰胺酶(ESBLs)和头孢菌素酶(AmpC酶)。碳青酶烯类抗菌药物是目前临床使用的抗菌谱广、抗菌活性强的一类抗菌药物，尤其对产ESBLs和AmpC酶肠杆菌科细菌感染的治疗有较好的疗效；但随着碳青酶烯类抗菌药物在临床上使用增加，碳青霉烯类抗生素的耐药性也不断增加且多重耐药性菌株的不断增加常导致临床抗菌药物治疗的失败和病程迁延。近年来，碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌呈世界性流行。

肠杆菌科细菌对碳青霉稀类抗生素耐药的机制主要为AmpC酶过度表达合并外膜孔蛋白丢失，青霉素结合蛋白对碳青霉烯类抗生素亲和力的下降，碳青霉烯类抗生素水解β-内酰胺酶的产生1。其中，耐药的主要机制就是细菌产生碳青霉烯酶。

KPC(Klebsiellapneumoniae carbapenemase，KPC)型碳青霉烯酶属于功能分类法的2f组，分子分类法的A类，是一种由质粒介导的丝氨酸β-内酰胺酶，以丝氨酸作为活性位点，是目前引起肠杆菌科细菌对碳青霉烯类耐药的主要原因。自2001年首次报道第一株产KPC酶肺炎克雷伯菌后，迅速在世界各地出现传播[5]。由于KPC酶对抗生素广泛的水解活性和编码基因的可移动性，它的出现和流行给临床治疗带来严重威胁，已成为全球性的公共卫生问题，也是各国医务人员关注的焦点。

2007年，浙江省报道了全国第一例产KPC酶肺炎克雷伯菌16，随后产KPC酶细菌在浙江省及华东地区等省市快速蔓延，可能与东部地区经济发达、医疗水平较高及抗生素的使用有关，给碳青霉烯酶类抗生素的使用及肠杆菌科细菌感染治疗造成严重威胁。近来，产KPC酶菌株在全国也有逐渐增多的趋势并在多个地方造成流行。KPC型碳青霉烯酶是一种由质粒介导的丝氨酸β-内酰胺酶，这一基因定位在质粒上的特性可能是其易于传播和播散的原因。

现在世界范围有KPC-2至KPC-15(登入号KC433553)14种KPC基因变异亚种，KPC-1因为发现检测有误，实际上与KPC-2是同一亚型，已取消命名。

本研究者从台州市立医院心胸外科病人的血液培养标本中分离得到一株肺炎克雷伯临床耐药菌，编号为KP1241该菌株表现出对亚胺培南、厄他培南的耐药，经法国生物梅里埃公司的VITEK2Compact全自动细菌鉴定药敏分析仪鉴定为肺炎克雷伯细菌。通过对该菌株所携带质粒的分析，发现了一个新的KPC基因亚种(KPC-15)，进一步的通过质粒转导实验，发现该基因导致细菌对多种药物耐药。

新耐药基因的发现，对于合理使用抗生素、减少严重感染时产生碳青霉烯类耐药细菌，以及研发新药物抑制细菌耐药性意义重大。基于上述目的，研制快速检测样品中KPC-15基因的PCR检测试剂盒以实现对含KPC-15基因致病菌的快速、准确地检测，有利于进一步监测耐药菌株、指导临床合理用药、减少耐药菌产生和传播，同时研究抗生素的耐药机制及基因环境开辟了新的道路。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种KPC-15基因的PCR检测试剂盒，用于含有KPC-15的肺炎克雷伯临床多重耐药菌的检测。

本发明从台州市立医院心胸外科病人的血液培养标本中分离得到一株肺炎克雷伯临床耐药菌，编号为KP1241该菌株表现出对亚胺培南、厄他培南的耐药，经法国生物梅里埃公司的VITEK2Compact全自动细菌鉴定药敏分析仪鉴定为肺炎克雷伯细菌。通过对该菌株所携带质粒的分析，发现了一个新的KPC基因亚种，命名为KPC-15。

利用设计的扩增引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4扩增KPC-15基因，并用设计的测序引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6对PCR产物进行测序，将测序结果在NCBI上进行BLSAT比对，发现KP1241所携带的KPC基因为新的KPC变异基因，对蛋白序列进行分析发现，该变异主要变异在第119突变成L，第146为突变成K。KPC-15基因ORF和氨基酸序列分别见序列：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

通过质粒转导实验，发现正是由于这一新的基因导致了该肺炎克雷伯菌的耐药特性的改变。为进一步证实该受体菌获得的抗性来源于KPC-15基因，本发明将该基因克隆入pET32a载体中，并将其转化入野生型E.coli JM109中，通过含有Amp的平板选阳性克隆(含有pET32a-KPC-15质粒的细菌)。将阳性克隆做药敏试验，结果显示KPC-15基因可以使细菌具有对以下药物耐药：氨曲南、环丙沙星、头孢替坦、妥布霉素、丁胺卡拉、头孢唑林、头孢吡肟、头孢他啶、头孢曲松、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦、呋喃妥因、复方新诺明、头孢哌酮/舒巴坦(舒普深)、米诺霉素。

本发明公开了一种KPC-15的PCR检测试剂盒，包括：

(1)DNA裂解液：100mM的NacC1，pH8.0的10mM的Tris-HC1，pH8.0的25mmol/L的EDTA，按重量体积比含量为1％的SDS和4μg/μL的蛋白酶K的混合溶液。

(2)PCR反应液：终浓度各50-400μmol/L的4种dNTPs，终浓度为0.1-0.5μmol/L的引物KPC-15TF和KPC-15TR，其核苷酸序列分别如序列表SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8所示；1.5-5.0μmol/L的Mg²⁺。

(3)阳性对照样品：含KPC-15基因的阳性质粒。

(4)高保真PCR酶按每个PCR反应含1.0U加入，反应液中不含PCR扩增的酶；

本发明所述的PCR试剂盒检测KPC-15基因的方法，步骤如下：

1、样品的预处理：取检测的样品，加入600μL灭菌的生理盐水充分洗涤样品得到含目标菌的悬液

2、PCR扩增

(1)按照扩增数n(n＝样品数+2)取PCR反应液，高保真PCR酶混匀于一离心管中，按每管分装，盖上管盖备用。

(2)先将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的DNA加入对应的反应管中，最后取出阳性对照加入另一反应管中，各反应管标记后离心，取出置PCR仪上。

(3)PCR扩增程序：95℃预变性5min后，95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，如此进行30个循环；最后72℃延伸10min，同时应设立阳性和阴性对照；

3、PCR扩增产物分析

取5-10μL扩增后的样品，采用1.2-1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测目的基因。片段大小为284bp。

根据KPC-15基因序列，设计特异性引物，研制了PCR检测试剂盒以及提供一种使用该试剂盒快速检测样品中KPC-15基因的方法，以实现对含KPC-15基因致病菌的快速、准确地检测。

附图说明

图1KPC-15基因的系统进化树。

具体实施方式

通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明本发明，并不意味着限定本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例一肺炎克雷伯临床耐药菌KP1241的药敏检测

肺炎克雷伯临床耐药菌KP1241是本人从台州市立医院心胸外科病人的血液培养标本中分离得到。该菌株表现出对亚胺培南、厄他培南的耐药，经法国生物梅里埃公司的VITEK2Compact全自动细菌鉴定药敏分析仪鉴定为肺炎克雷伯细菌，将其编号KP1241。

1、材料与方法

法国生物梅里埃公司的VITEK2Compact全自动细菌鉴定药敏分析仪；细菌鉴定卡：VITEK2GN Test kit；

细菌药敏卡：法国bio Merieux的AST-GN13。AST-GN13药敏种类有：阿米卡星、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢替坦、头孢他定、头孢曲松、环丙沙星、厄他培南、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、呋喃妥因、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、SMZ。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。

补充药敏纸片(药敏平板琼脂扩散实验)：纸片来源于英国Oxoid公司，有头孢哌酮/舒巴坦(75μg/30μg)、米诺环素(30μg)。

仪器鉴定过程：将血液培养阳性的菌株转种到血平板上分离培养(在35℃含5％CO₂孵育箱中培养16-18h)，然后将分离的纯细菌按操作程序在VITEK2上机作细菌鉴定与药敏试验。

补充药敏试验：将0.5麦氏单位的菌液涂抹在MH平板上，按操作程序贴上头孢哌酮/舒巴坦和米诺环素纸片，在35℃含5％CO₂孵育箱中培养16-18h后，按CLSI2012标准鉴定药敏结果。

2、结果

生化特性：中等大小的革兰氏阴性杆菌，KIA产酸/产酸，葡萄糖与乳糖产酸产气，氧化酶阴性，VP阳性，吲哚阴性，枸橼酸盐阳性，动力阴性，不产H₂S，符合肺炎克雷伯菌的特性，经VITEK2微生物分析仪鉴定为肺炎克雷伯菌，鉴定概率为99％。

药敏实验结果如表1所示

表1肺炎克雷伯临床耐药菌KP1241的药敏检测结果

注：MIC指最低抑菌所需药物浓度，其单位为(ug/ml)，R为耐药，*纸片扩散法。

MIC值越大代表该菌株对相应抗菌药物越不敏感，即该菌株对抗菌药越耐药，从上述实验结果显示：肺炎克雷伯菌KP1241对氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、环丙沙星、头孢替坦、妥布霉素、丁胺卡拉、氨苄西林、头孢唑林、头孢吡肟、头孢他啶、头孢曲松、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦、呋喃妥因、复方新诺明、头孢哌酮/舒巴坦(舒普深)、米诺霉素都具有耐药性，其中对哌拉西林/他唑巴坦和呋喃妥因耐药性最强。

实施例二KPC基因的调取和测序

1、材料与方法

质粒提取：采用TakaRa公司的miniBEST plasmid purification Kit抽提质粒。质粒提取具体步骤参照说明书进行，并最终将提取质粒终浓度定量为1ug/uL。

KPC基因的扩增：根据NCBI数据设计KPC基因的扩增引物，序列如下：

KPC-15PCR primer：(PCR引物)

KPC-15PF：5′-CGAGCAACTATGGATGAACG-3′(SEQ ID NO.3)

KPC-15PR：5′-GTATCTGTGAGGGCGAAGG-3′(SEQ ID NO.4)

PCR扩增中各组分的用量为：上游引物和下游引物各0.5μL；无Mg²⁺的缓冲液2.5μL；浓度为5U/μL的高保真DNA聚合酶0.25μL；dNTPs2μL；MgCl₂1μL；去离子水17.75μL；质粒1.5μL。PCR扩增条件为：94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，合适温度下退火((退火温度)＝56.3℃)30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统观察结果并拍照，预期产物长度为1431bp。

扩增产物的测序：将扩增出的KPC基因片段用ABI测序仪进行测序，测序引物如下所示：

KPC-15SF：5′-CGGAACCATTCGCTAAACTCG-3′(SEQ ID NO.5)；

KPC-15SR：5′-CGCCAACTCCTTCAGCAACA-3′。(SEQ ID NO.6)。

2、结果

将测序结果在NCBI上进行BLSAT比对，发现KP1241所携带的KPC基因为新的KPC变异基因，命名为KPC-15，对蛋白序列进行分析发现，该变异主要变异在第119突变成L，第146为突变成K。KPC-15基因ORF和氨基酸序列分别见序列：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

实施例三质粒转导试验

供体菌为的KP1241菌株，受体菌为E.coli J53AzR(对叠氮化钠耐药)。将供体菌、受体菌分别接种于LB平板上，35℃过夜培养。挑取单个菌落分别接种于4mL的LB肉汤中，37℃220r/min摇菌培养至对数生长期。各取0.5ml供、受体菌于4ml的LB肉汤中，37℃静止过夜培养。接合子以胰大豆琼脂(TSA)平皿筛选，平板中含叠氮化钠(300mg/L)和环丙沙星(0.03mg/L)。置35℃孵育18-24小时。以PCR法对筛选出的接合子进行KPC-15基因检测，阳性者重新进行菌种鉴定，鉴定为大肠埃希菌者表明携KPC-15基因耐药质粒接合转移成功。

KPC-15与E.coli J53Az^R结合子的各药敏(实施例一中的药敏种类)均出现耐药，结果如下表所示。说明KPC-15通过质粒介导，并且转导非常成功。

表2E.coli J53Az^R转化菌的药敏检测结果

注：MIC指最低抑菌所需药物浓度，其单位为(ug/ml)，R为耐药，*纸片扩散法。

实施例四组成型KPC-15基因表达菌的构建

1、材料

E.coli JM109；TaKaRa公司的pMD18T载体；pBR322载体；TaKaRa公司的限制性核酸内切酶Pst I和EcoR I；天根生化科技(北京)有限公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒；TaKaRa公司的T4DNA连接酶。

2、方法

2.1组成型KPC-15基因表达菌E.coli JM109(pET32a-KPC-15)构建

将实施例二中的PCR产物(核苷酸序列为SEQ ID NO.1)与pMD18T载体连接，连接产物加入100μl JM109的感受态中转化，在含有IPTG、x-gal、Amp的平板上培养，测序验证基因序列及其基因插入方向正确。然后将KPC-15基因克隆到pET32a载体中，得到含KPC-15基因的pET32a-KPC-15质粒。将重组质粒转化到感受态E.coli JM109细胞中，在含有Amp的平板上培养，筛选获得重组菌E.coli JM109(pET32a-KPC-15)。

2.2对构建成功的克隆菌进行耐药性检测

采用法国bioMerieux的VITEK2细菌鉴定及药敏分析系统和药敏平板琼脂扩散方法(补充药敏纸片)对重组菌E.coli JM109(pET32a-KPC-15)进行耐药性检测，

3、耐药检测结果见下表：

表3E.coli JM109(pET32a-KPC-15)的药敏检测结果

注：MIC指最低抑菌所需药物浓度，其单位为(ug/ml)，R为耐药，*纸片扩散法。

结果显示重组菌对氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、环丙沙星、头孢替坦、妥布霉素、丁胺卡拉、头孢唑林、头孢吡肟、头孢他啶、头孢曲松、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦、呋喃妥因、复方新诺明、头孢哌酮/舒巴坦(舒普深)、米诺霉素耐药，即KPC-15基因的功能是，可以使细菌具有对以下药物耐药：氨曲南、环丙沙星、头孢替坦、妥布霉素、丁胺卡拉、头孢唑林、头孢吡肟、头孢他啶、头孢曲松、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦、呋喃妥因、复方新诺明、头孢哌酮/舒巴坦(舒普深)、米诺霉素。

实施例五KPC-15基因的进化树分析

现在世界范围有KPC-2至KPC-14共13种KPC基因变异亚种，KPC-1因为发现检测有误，实际上与KPC-2是同一亚型，已取消命名。这13种KPC基因变异亚种在NCBI上的编号如下表4所示。从NCBI上获取这些基因的氨基酸序列，并用PROTDIST软件进行分析，结果如图1所示。

表4KPC基因变异亚种

实施例六检测KPC-15基因PCR试剂盒的组装与准确性检测

有利于进一步监测耐药菌株、指导临床合理用药、减少耐药菌产生和传播，同时研究抗生素的耐药机制及基因环境开辟了新的道路

根据KPC-15基因序列，设计特异性引物，研制了PCR检测试剂盒以及提供一种使用该试剂盒快速检测样品中KPC-15基因的方法，以实现对含KPC-15基因致病菌的快速、准确地检测。

引物序列为：

KPC-15TF：5′-CTGACAACAGGCATGACGGTTT-3′(SEQ ID NO.7)；

KPC-15TR：5′-AACTGCTGCCGCTGCGGCGCAGCC-3′(SEQ ID NO.8)；

一种检测KPC-15的PCR检测试剂盒，包括：

(1)DNA裂解液：100mmol/L的NacCl，pH8.0的10mmol/L的Tris-HCl，pH8.0的25mmol/L的EDTA，按重量体积比含量为1％的SDS和4μg/μL的蛋白酶K的混合溶液。

(2)PCR反应液：终浓度各50-400μmol/L的4中dNTPs，终浓度为0.1-0.5μmol/L的引物KPC-15TF和KPC-15TR，1.5-5.0μmol/L的Mg²⁺。

(3)阳性对照：含KPC-15基因的阳性质粒。

(4)高保真PCR酶按每个PCR反应含1.0U加入，反应液中不含PCR扩增的酶；

本发明的PCR试剂盒检测KPC-15基因的方法，步骤如下：

1、样品的预处理：取检测的样品，加入600μL灭菌的生理盐水充分洗涤样品得到含目标菌的悬液

2、PCR扩增

(1)按照扩增数n(n＝样品数+2)取PCR反应液，高保真PCR酶混匀于一离心管中，按每管分装，盖上管盖备用。

(2)先将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的DNA加入对应的反应管中，最后取出阳性对照加入另一反应管中，各反应管标记后离心，取出置PCR仪上。

(3)PCR扩增程序：95℃预变性5min后，95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，如此进行30个循环；最后72℃延伸10min，同时应设立阳性和阴性对照；

3、PCR扩增产物分析

取5-10μL扩增后的样品，采用1.2-1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测目的基因。片段大小为284bp。

对上述PCR试剂盒准确性检测，取50株不含KPC-15的阴性菌E.coli J53和50株含有KPC-15的肺炎克雷伯菌的阳性菌株，使用上述试剂盒，按照上述检测方法进行检测。实验结果显示只有50例阳性菌株有大小284bp的PCR扩增片段，即本发明所述的PCR试剂盒的准确率为100％。所以本发明所述的PCR试剂盒能够准确的检测样品菌株是否含有KPC-15基因。

Claims (1)

1.一种KPC-15的PCR检测试剂盒，包括DNA裂解液、PCR反应液、阳性对照样品、高保真PCR酶；

其中所述的DNA裂解液包括：100mM的NaCl，pH8.0的10mM的Tris-HCl，pH8.0的25mmol/L的EDTA，按重量体积比含量为1％的SDS和4μg/μL的蛋白酶K的混合溶液；

所述的PCR反应液包括：终浓度各50-400μmol/L的4种dNTPs，终浓度为0.1-0.5μmol/L的引物KPC-15TF和KPC-15TR，其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；1.5-5.0μmol/L的Mg²⁺；

所述的阳性对照样品为KPC-15基因的阳性质粒。