CN108728559A - 检测大肠埃希氏菌o157的rpa引物、探针、试剂盒和方法 - Google Patents

检测大肠埃希氏菌o157的rpa引物、探针、试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供检测大肠埃希氏菌O157的RPA引物、探针、试剂盒和方法。本发明检测大肠埃希氏菌O157的RPA引物包括针对rfbE基因的上游引物Seq ID No.1和下游引物Seq ID No.2。相对于现有技术，本发明的试剂盒及检测方法，可快速检测样品中是否存在大肠埃希氏菌O157核酸。操作简单，无需特殊昂贵的仪器，在疾病监测、临床诊断和食品安全监测等领域具有重要的应用价值。

Description

检测大肠埃希氏菌O157的RPA引物、探针、试剂盒和方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及检测大肠埃希氏菌O157的RPA引物和探针、试剂盒及RPA等温快速检测方法。
背景技术
大肠埃希氏菌O157是肠出血性大肠埃希氏菌主要的血清型，它可以导致病人出现腹泻、出血性肠炎及相关的病发症，严重的会危及病人生命。该病菌曾多次在国外和我国爆发、流行，给全球的经济带来了巨大的损失，目前它已成为了世卫组织关注的一个热点问题。因此，开发大肠埃希氏菌O157的快速检测方法对该菌的预防和检测非常重要。
目前大肠埃希氏菌O157的检测方法主要是分离培养法和PCR方法。分离培养法无需昂贵的设备，成本较低，但是该方法对人员要求较高并且检测周期较长，无法实现对样品的快速检测。基于分子生物学原理的PCR方法也被大量应用到了大肠埃希氏菌O157的检测之中，该检测方法由于需要配套较昂贵的设备因而也不利于在基层单位中的推广也不利于现场快速检测。因此为确保食品安全的快速发展，急需有关大肠埃希氏菌O157的快速检测方法。
重组酶聚合酶等温扩增技术( recombinase polymerase amplification, RPA)是2006年由英国研究人员研发的一种新型的等温扩增技术，其原理是在恒温下，重组酶与寡核苷酸引物形成复合体，酶促使引物定位到DNA双链模板的同源靶序列上，解链模板DNA，引物与模板单链结合并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，同时单链DNA结合蛋白与另外一条模板单链结合。该方法的主要特点在等温条件下即可高效、快速、高特异、高灵敏的扩增靶基因。目前RPA技术已经应用到病毒、细菌、支原体、寄生虫等的快速检测中，然而目前并没有基于大肠埃希氏菌O157 rfbE基因的引物和探针及检测方法被应用于大肠埃希氏菌O157的检测中。
目前多种大肠埃希氏菌O157的毒力基因和染色体上的基因被当作靶基因应用于大肠埃希氏菌O157的检测中，但是这些靶基因特异性并不理想。大肠埃希氏菌O157 rfbE基因是与O157脂多糖抗原编码相关的基因，有文献报导针对该基因建立的PCR法可以特异检测出大肠埃希氏菌O157，并且该方法对其他O血清型大肠埃希氏菌和肠道微生物的检测结果全都为阴性。因此基于大肠埃希氏菌O157 rfbE基因的RPA引物和探针及RPA检测方法在对大肠埃希氏菌O157的检测中将有着优良的特异性。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供一种方便快速的检测大肠埃希氏菌O157的RPA引物、探针、试剂盒和方法。
一种检测大肠埃希氏菌O157的RPA引物，针对rfbE 基因包括
上游引物Seq ID No.1: 5’-AAAGGTAAATATGTGGGTTGATAACGACTA-3’和下游引物Seq IDNo.2：5’-AAAATCATCAGCTTGTTCATTCACCCGATA-3’。
一种检测大肠埃希氏菌O157的RPA引物，采用所述的引物中的上游引物、下游引物中的至少一种，或选自所述的引物中的上游引物、下游引物序列或上游引物、下游引物序列的互补链序列中单条序列同源性为50%及以上的碱基序列。
一种检测大肠埃希氏菌O157的RPA探针，针对rfbE基因，其包括探针序列Seq IDNo.3：5’-TGGAATGGTTGTCACGAATGACAAAAGTGTACTAGAGGCTTCAAAAC -3’
所述探针序列Seq ID No.3的距5’端32bp 的位置处采用dSpacer 修饰，dSpacer分子两侧的胸腺嘧啶分别被荧光基团和淬灭基团取代，所述探针序列Seq ID No.3的3’末端通过阻塞基团C3Spacer或磷酸化进行修饰。
一种检测大肠埃希氏菌O157的RPA探针，包括所述的探针序列或其互补链序列中单条序列同源性为50%及以上的碱基序列。
一种检测大肠埃希氏菌O157的RPA试剂盒，包括含有所述的引物和所述的探针以冻干粉形式的RPA反应组分、RPA反应缓冲液。
一种检测大肠埃希氏菌O157的RPA的方法，包括如下步骤：
（1）提取待测样品基因组DNA；
（2）采用权利要求6所述的试剂盒、步骤(1)提取的待测样品基因组DNA以及醋酸镁，配制成RPA反应体系；
（3）将步骤（2）配置的反应体系在恒温下进行扩增反应，整个反应过程收集荧光信号；
（4）根据扩增反应结果确定待测样品基因组DNA中是否含有大肠埃希氏菌O157。
优选的，所述步骤（2）中的RPA反应体系以50uL计为：
优选的，所述RPA反应体系的反应恒温条件为37℃-42℃，反应时间为15-20分钟。
优选的，所述RPA反应体系进一步包括阳性质控品和阴性质控品。
相对于现有技术，本发明的技术方案克服现有有关大肠埃希氏菌O157的检测技术存在检测周期长，特异性差等问题，充分利用分子生物学相关的信息及数据库，设计特异性的RPA引物及探针，建立大肠埃希氏菌O157的RPA检测方法，并在此基础上提供一种高灵敏度，高特异的RPA检测试剂盒。
本发明针对大肠埃希氏菌O157的rfbE基因序列的保守区域特异的靶序列设计RPA引物和探针，本发明的试剂盒，可以用来快速检测样品中是否存在大肠埃希氏菌O157的核酸，可以在20分钟就得到扩增结果，从而克服了现有技术对大肠埃希氏菌O157快速检测的限制。可为大肠埃希氏菌O157的疾病监测、临床诊断和食品安全监测等提供实验依据。
附图说明
图1为利用本发明所述的RPA引物探针所建立的RPA反应体系的检测结果图。
图2为利用本发明所述的RPA引物探针所建立的RPA反应体系对不同O血清型的大肠埃希氏菌特异性实验结果图。
图3为利用本发明所述的RPA引物探针所建立的RPA反应体系对常见致病菌特异性验证实验结果图。
图4为本发明所述的RPA引物探针所建立的RPA反应体系的灵敏度实验分析结果图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明：
实施例1 ：靶基因的选取与RPA引物探针
利用生物信息学知识以及相关分析软件，对大肠埃希氏菌O157常见的毒力基因进行分析，诸如wzy、eaeA、rfbE等，通过对大肠埃希氏菌O157的这些基因与其他微生物进行比对分析，将rfbE作为待选靶基因，并选择特异性较高的序列片段。根据RPA对引物和探针的设计要求，设计特异性引物及探针，之后再次将引物与探针的序列与大肠埃希氏菌O157同源性高的物种进行比对，从中选择特异性高的引物及探针。之后对同过对待选引物及探针进行试验比较分析，从中选择特异性高，扩增效率高的一个组合。本实施例中的引物和探针由由上海生物工程有限公司合成。
本发明的引物具体如下：
所述引物包括针对rfbE基因的上游引物Seq ID No.1: 5’-AAAGGTAAATATGTGGGTTGATAACGACTA-3’和下游引物Seq ID No.2：5’-AAAATCATCAGCTTGTTCATTCACCCGATA-3’。
替代实施例中，所述引物可以为所述上游引物、下游引物中的至少一种，或上游引物、下游引物序列或上游引物、下游引物序列的互补链序列中单条序列同源性为50%及以上的碱基序列。
本发明的探针具体如下：
针对rfbE基因，其包括探针序列Seq ID No.3：5’-TGGAATGGTTGTCACGAATGACAAAAGTGTACTAGAGGCTTCAAAAC-3’。
本实施例中，所述探针需要被修饰，在探针中间距5’端32bp 的位置处采用dSpacer 修饰，dSpacer分子两侧的胸腺嘧啶分别被荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1取代，并且在探针的3’末端也需要同过阻塞基团C3Spacer修饰。本实施例中，所述荧光基因采用FAM-dT荧光标记基团，所述淬灭基团采用BHQ1-dT荧光标记基团。修饰后的探针序列表达为:5’-TGGAATGGTTGTCACGAATGACAAAAGTG(FAM-dT)A(dSpacer)(BHQ1-dT)AGAGGCTTCAAAAC-C3spacer-3’。
替代实施例中，所述探针序列还可以采用所述的探针序列或其互补链序列中单条序列同源性为50%及以上的碱基序列及其他荧光标记基团。
实施例2：检测大肠埃希氏菌O157的RPA试剂盒
本实施例提供一种检测大肠埃希氏菌O157的RPA试剂盒，包括针对rfbE 基因的引物、探针以及RPA反应缓冲液。所述引物可以包括的上游引物Seq ID No.1: 5’-AAAGGTAAATATGTGGGTTGATAACGACTA-3’和下游引物Seq ID No.2：5’-AAAATCATCAGCTTGTTCATTCACCCGATA-3’中的一种或上游引物Seq ID No.1、下游引物Seq IDNo.2序列的互补链序列中单条序列同源性为50%及以上的碱基序列。所述探针序列为SeqID No.3：5’- TGGAATGGTTGTCACGAATGACAAAAGTGTACTAGAGGCTTCAAAAC -3’或其互补链序列中单条序列同源性为50%及以上的碱基序列。较佳的，所述探针序列Seq ID No.3的5’端32bp 的位置处采用dSpacer 修饰，dSpacer分子两侧的胸腺嘧啶分别被荧光基团和淬灭基团取代，所述探针序列Seq ID No.3的3’末端通过阻塞基团C3Spacer进行修饰。所述荧光基因采用FAM-dT荧光标记基团或其他荧光标记基团，所述淬灭基团采用BHQ1-dT荧光标记基团或其他荧光标记基团。本实施例中，试剂盒的引物和探针为冻干粉形式的RPA反应组分。较佳实施方式中，所述试剂盒种的RPA反应组分还可以包括冻干粉形式的酶、阳性质控品和阴性质控品。
实施例3 ：大肠埃希氏菌O157的RPA方法
（1）提取待测样品基因组DNA
本实施例将大肠埃希氏菌O157NTCC12900接种到营养肉汤中，放置在摇床上，按照每种细菌最适生长温度培养过夜，吸取1 mL培养菌液滴加到1.5 mL离心管内，12000转/分钟离心2分钟，弃去上清液，加入500 µL无菌生理盐水，充分悬浮混匀，12000转/分钟离心1分钟，弃上清，重复添加无菌生理盐水，再离心，弃上清。添加50 µL生理盐水，100 ℃水浴10-15分钟，待冷却室温12000转/分钟 离心1分钟，上清液作为待测样品基因组DNA于-20 ℃保存备用。
其他实施例中可以对样本进行生长培养后提取DNA或直接提取DNA。样本要求为：临床样品类型包括患者腹泻标本和分离培养物；临床样本采集后应带冰运输，-20 ℃保存，避免反复冻融，从临床样本提取DNA，建议采用性能稳定可靠的商品化试剂盒，具体方法参照相应商品化试剂盒说明书，提取的DNA应立即检测，否则，应将DNA分装后存放于-80 ℃至-20 ℃保存。
（2）使用第2实施例所述的试剂盒、步骤(1)提取的待测样品基因组DNA以及醋酸镁，配制成RPA反应体系，以50uL计为：
本实施例的待测样品基因组DNA的模板为大肠埃希氏菌O157 NTCC12900，具体配置为向含有冻干酶粉和引物探针的RPA反应管中加入再水化缓冲液45.5 uL、DNA模板2 uL、最后再加入醋酸镁溶液2.5 uL充分混匀，本实施例同时设置空白对照反应体系。
（3）将步骤（2）配置的反应体系在恒温下进行扩增反应，整个反应过程收集荧光信号，本实施例RPA反应体系的反应恒温条件为37 ℃-42℃，反应时间为15-20分钟。
（4）根据扩增反应结果确定待测样品基因组DNA中是否含有大肠埃希氏菌O157。较佳实施方式中，每次实验应设立阴、阳性对照，阴性对照无荧光值的增加，阳性对照有荧光值的增加，否则实验结果不成立。本实施例结果判读可疑包括阳性、阴性和可疑三种情况，具体定义如下。
阳性：出现 “S” 型扩增曲线，且荧光增量在300以上；
阴性：没有出现“S” 型扩增曲线或者荧光增量在200以内；
可疑：出现“S” 型扩增，且荧光增加量在200-300之间；对可疑结果，应重复实验，如果实验还是出现“S” 型扩增，且荧光增加量在200-300之间，阴性对照没有污染，可判断为阳性。
本实施例, 待测样品基因组DNA检测结果如图1所示, 其中曲线1为待测样品基因组DNA；曲线2为空白对照。图1结果表明待测样品基因组DNA检测为阳性，含有大肠埃希氏菌O157。
实施例4 ：大肠埃希氏菌O157检测特异性评价
一实施例中检测特异性评价采用下表1中的菌株，本实施例中采用的标准菌株均由广州环凯微生物有限公司代为购买。
表1 用于RPA特异性分析的菌株
以表1中菌株DNA作为RPA反应模板，利用实施例2中的RPA试剂盒进行RPA扩增。
本实施例RPA扩增体系为：向含有冻干酶粉和引物探针的RPA反应管中加入再水化缓冲液45.5 uL、模板2 uL、最后再加入醋酸镁溶液2.5 uL。
RPA的反应条件：将上述RPA反应体系充分混匀，在41℃条件下，扩增20分钟。
扩增结果如图2和图3所示，图2中曲线1为大肠埃希氏菌O157 NTCC12900，曲线2-16分别为大肠埃希氏菌O6，大肠埃希氏菌O9，大肠埃希氏菌O15，大肠埃希氏菌O18，大肠埃希氏菌O20，大肠埃希氏菌O26，大肠埃希氏菌O27，大肠埃希氏菌O28，大肠埃希氏菌O78，大肠埃希氏菌O104，大肠埃希氏菌O127，大肠埃希氏菌O128，大肠埃希氏菌O143，大肠埃希氏菌O164以及空白对照的扩增结果。图3中曲线1为大肠埃希氏菌O157 NTCC12900，曲线2-13分别为沙门氏菌，福氏志贺氏菌，粪链球菌，副溶血性弧菌，金黄色葡萄球菌，单核细胞增生李斯特菌，阴沟肠杆菌，小肠结肠炎耶尔森菌，肺炎克雷伯氏菌，铜绿假单胞菌，弗氏柠檬酸杆菌以及空白对照的扩增结果。从结果中可以知道，只有阳性对照大肠埃希氏菌O157NTCC12900的扩增结果呈阳性，其他O血清型的大肠埃希氏菌以及其他常见致病菌的检测结果与空白对照的扩增结果无差异，呈现阴性。图2和图3的结果表明，本发明RPA引物、RPA探针、试剂盒以及RPA方法的特异性良好。
实施例5 ：大肠埃希氏菌O157的RPA方法检测下限
本实施例中，以插入大肠埃希氏菌O157 rfbE基因的质粒为模板，利用实施例2中的RPA试剂盒进行扩增，其中不同反应中，模板的rfbE基因拷贝数分别为106/reaction，105/reaction，104/reaction，103/reaction，102/reaction。
灵敏度的实验结果如图4所示，曲线1：rfbE基因拷贝数106/reaction，曲线2：rfbE基因拷贝数105/reaction，曲线3：rfbE基因拷贝数104/reaction，曲线4：rfbE基因拷贝数103/reaction，曲线5：rfbE基因拷贝数102/reaction，曲线6：空白对照。由图4结果可知，本发明RPA法的检测下限可以达到rfbE基因拷贝数103/reaction。
相对于现有技术，本发明的技术方案克服现有有关大肠埃希氏菌O157的检测技术存在检测周期长，特异性差等问题，充分利用分子生物学相关的信息及数据库，设计特异性的RPA引物及探针，建立大肠埃希氏菌O157的RPA检测方法，并在此基础上提供一种高灵敏度，高特异的RPA检测试剂盒。
本发明针对大肠埃希氏菌O157的rfbE基因序列的保守区域特异的靶序列设计RPA引物和探针，本发明的试剂盒，可以用来快速检测样品中是否存在大肠埃希氏菌O157的核酸，可以在20分钟就得到扩增结果，从而克服了现有技术对大肠埃希氏菌O157快速检测的限制。可为大肠埃希氏菌O157的疾病监测、临床诊断和食品安全监测等提供实验依据。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 深圳市计量质量检测研究院、深圳华因康基因科技有限公司
<120> 检测大肠埃希氏菌O157的RPA引物、探针、试剂盒和方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaaggtaaat atgtgggttg ataacgacta 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaaatcatca gcttgttcat tcacccgata 30
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggaatggtt gtcacgaatg acaaaagtgt actagaggct tcaaacc 47

Claims (10)

1. 一种检测大肠埃希氏菌O157的RPA引物，其特征在于，针对rfbE 基因包括
上游引物Seq ID No.1: 5’-AAAGGTAAATATGTGGGTTGATAACGACTA-3’和下游引物Seq IDNo.2：5’-AAAATCATCAGCTTGTTCATTCACCCGATA-3’。
2. 一种检测大肠埃希氏菌O157的RPA引物，其特征在于，采用权利要求1所述的引物中的上游引物、下游引物中的至少一种，或选自权利要求1所述的引物中的上游引物、下游引物序列或上游引物、下游引物序列的互补链序列中单条序列同源性为50%及以上的碱基序列。
3.一种检测大肠埃希氏菌O157的RPA探针，其特征在于，针对rfbE基因，其包括探针序列Seq ID No.3：5’- TGGAATGGTTGTCACGAATGACAAAAGTGTACTAGAGGCTTCAAAAC -3’
所述探针序列Seq ID No.3的5’端32bp 的位置处采用dSpacer 修饰，dSpacer分子两侧的胸腺嘧啶分别被荧光基团和淬灭基团取代，所述探针序列Seq ID No.3的3’末端通过阻塞基团C3Spacer或磷酸化进行修饰。
4.如权利要求3所述的检测大肠埃希氏菌O157的RPA探针，其特征在于，所述荧光基因采用FAM-dT荧光标记基团，所述淬灭基团采用BHQ1-dT荧光标记基团。
5.一种检测大肠埃希氏菌O157的RPA探针，其特征在于，采用权利要求3所述的探针序列或其互补链序列中单条序列同源性为50%及以上的碱基序列。
6.一种检测大肠埃希氏菌O157的RPA试剂盒，其特征在于，包括含有如权利要求1所述的引物和如权利要求3或5所述的探针以冻干粉形式的RPA反应组分、RPA反应缓冲液。
7.一种检测大肠埃希氏菌O157的RPA方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）提取待测样品基因组DNA；
（2）采用权利要求6所述的试剂盒、步骤(1)提取的待测样品基因组DNA以及醋酸镁，配制成RPA反应体系；
（3）将步骤（2）配置的反应体系在恒温下进行扩增反应，整个反应过程收集荧光信号；
（4）根据扩增反应结果确定待测样品基因组DNA中是否含有大肠埃希氏菌O157。
8.如权利要求7所述检测大肠埃希氏菌O157的RPA方法，其特征在于，所述步骤（2）中的RPA反应体系以50uL计为：
DNA模板 2uL 上游引物、下游引物 420 nmoL/L 探针 420 nmoL/L 酶反应冻干粉 10mg 1×反应缓冲液 45.5 uL 280mmol/L Mg2+缓冲液 2.5uL
。
9.如权利要求8所述检测大肠埃希氏菌O157的RPA方法，其特征在于，所述RPA反应体系的反应恒温条件为37 ℃-42℃，反应时间为15-20分钟。
10.如权利要求8所述检测大肠埃希氏菌O157的RPA方法，其特征在于，所述RPA反应体系进一步包括阳性质控品和阴性质控品。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110241184A (zh) * 2019-06-28 2019-09-17 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种快速检测鸭疫里默氏杆菌的rpa试剂盒及其用途
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