CN112161976A - 检测大肠埃希菌和/或志贺菌的底物组合、检测试剂及检测试剂盒 - Google Patents

检测大肠埃希菌和/或志贺菌的底物组合、检测试剂及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物检测领域，特别涉及检测大肠埃希菌和/或志贺菌的底物组合、检测试剂及检测试剂盒。本发明提供的底物组合基于生化和显色原理的快速区分大肠埃希菌和志贺菌的检测试剂盒及其制备方法。使用本发明所述试剂盒，仅需一步操作，即能在1～2h内快速区分大肠埃希菌和鲍氏志贺菌、宋内志贺菌、福氏志贺菌、痢疾志贺菌。

Description

检测大肠埃希菌和/或志贺菌的底物组合、检测试剂及检测试 剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别涉及检测大肠埃希菌和/或志贺菌的底物组合、检测试剂及检测试剂盒。
背景技术
微生物鉴定是食品、药品、海关及临床检验工作中的重要部分。主要方法包括：
(1)基于生化反应谱的生化鉴定:生化鉴定因涉及较多的生化反应，目前已经发展出生化鉴定系统，基于细菌培养及不同细菌表现不同的生化谱实现种属鉴定，鉴定结果准确，可以精确到种甚至亚种，但鉴定细菌种类及速度不及测序技术及质谱技术。
(2)基于16sRNA测序的测序技术：测序技术是根据细菌的基因16sRNA序列不同实现不同种属的鉴定，因其高通量、准确性高被各检验机构所使用。
(3)基于蛋白质图谱的质谱鉴定等。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MassSpectrometry，MALDI-TOF MS)检测微生物蛋白质特征指纹谱，与数据库中的微生物特征蛋白谱比较，确定微生物的种属。特点是快速，操作简便，准确性高。
但对于后面两种技术，有些细菌无法准确区分，比如大肠埃希菌和志贺菌，因为序列比较相似，蛋白图谱基本一致，16sRNA测序及质谱技术无法进行区分。所以如果想要很准确的区分，需要一些特殊处理或者补充实验。
大肠埃希菌和志贺菌属于近缘微生物，大肠埃希菌多数为正常肠道菌群，而志贺菌为致病菌，临床检验时区分志贺菌和大肠埃希菌意义重大。现有专利《一种基于乳糖差异培养的近缘微生物质谱鉴定方法》(专利号；CN 110144379 A)描述了针对这一技术缺陷的发明专利，此发明是将生化鉴定原理与MALDI-TOF MS技术相结合，将志贺菌和大肠埃希菌培养于含有乳糖或者不含乳糖的培养条件下，诱导大肠埃希菌在不同生长条件下产生差异蛋白，再通过MALDI-TOF MS技术检测差异蛋白，根据差异蛋白检测结果判断是否为大肠埃希菌或志贺菌，实现近亲缘性志贺菌和大肠埃希菌的快速鉴别。
上述鉴定方法(1)所述生化鉴定，可以准确区分大肠埃希菌和志贺菌，但所需时间较长；
上述鉴定方法(2)和(3)无法准确区分大肠埃希菌和志贺菌。因大肠埃希菌和志贺菌属16sRNA序列比较相似，16S rRNA基因全长仅1-2个碱基的区别，无法用测试技术区分。蛋白图谱基本一致，故无法用质谱法对这两种菌进行准确区分。MALDI-TOF MS或者16SrRNA测序鉴定大肠和志贺菌后需要特殊处理或补充的生化试验进行最终鉴定。
专利CN110144379A采用特殊处理的方法，需要提前将待测样本进行组分差异化培养2h-24h以达到菌株特异性蛋白表达，然后再将差异培养后的菌株进行质谱前处理，上机进行质谱鉴定，整个操作过程涉及再次培养、质谱前处理、质谱二次鉴定，步骤繁琐且耗时长。
专利CN110144379A还有一个严重的不足之处：该技术方案中只能鉴定区分为大肠埃希菌和志贺菌属，如为志贺菌属，只能鉴定到属水平，无法鉴定到到志贺菌属下面的具体种。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了检测大肠埃希菌和/或志贺菌的底物组合、检测试剂及检测试剂盒。该底物组合基于生化和显色原理的快速区分大肠埃希菌和志贺菌的检测试剂盒及其制备方法。使用本发明所述试剂盒，仅需一步操作，即能在1～2h内快速区分大肠埃希菌和鲍氏志贺菌、宋内志贺菌、福氏志贺菌、痢疾志贺菌。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了检测大肠埃希菌和/或志贺菌的底物组合，包括第一底物组合、第二底物组合、第三底物组合和第四底物组合；
所述第一底物组合包括：0.8％～1.2％甘露醇、1.4％～1.7％酸碱指示剂和缓冲体系，pH值7.2～7.4；
所述第二底物组合包括：0.8％～1.2％糖苷或其与酚类结合的化合物和缓冲体系，pH值7.0～8.0；
所述第三底物组合包括：0.8％～1.2％甜味剂、1.4％-1.7％酸碱指示剂和缓冲体系，pH值7.2～7.4；
所述第四底物组合包括：0.5％～1％甘油、1.4％-1.7％酸碱指示剂和缓冲体系，pH值7.2～7.4。
在本发明的一些具体实施方案中，所述第一底物组合、所述第三底物组合或所述第四底物组合中的所述酸碱指示剂包括苯酚红、苯酚红衍生物或溴甲酚紫中的一种或两者以上的组合物；
所述苯酚红衍生物包括苯酚红钠。
在本发明的一些具体实施方案中，所述第二底物组合中的所述糖苷包括ONPG(2-硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷)、β-D-半乳吡喃糖苷或α-D-半乳吡喃糖苷中的一种或两者以上的组合物；
所述酚类包括但不仅限于苯酚、硝基苯酚、萘酚、吲哚酚中的一种或两者以上的组合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述第三底物组合中所述甜味剂包括：山梨醇、乳糖、木糖中的一种或两者以上的组合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述缓冲体系包括但不限于：磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液中的一种或其组合。
基于上述研究，本发明还提供了所述的底物组合在制备检测大肠埃希菌和/或志贺菌中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述志贺菌包括鲍氏志贺菌、宋内志贺菌、福氏志贺菌、痢疾志贺菌中的至少一种。
基于上述研究，本发明还提供了试剂，包括所述的底物组合以及可接受的助剂。
本发明还提供了试剂盒，包括所述的底物组合以及可接受的助剂或载体；所述载体包括板卡。
本发明还提供了大肠埃希菌或志贺菌的检测方法，包括如下步骤：
步骤1：获得所述底物组合；
步骤2：取待测菌，获得2.5～3麦氏的菌悬液；所述待测菌为大肠埃希菌或志贺菌；
步骤3：取步骤1制得的所述底物组合与步骤2制得的菌悬液按照体积比(8～12)：(80～120)混合，35～37℃孵育1～2h；
步骤4：根据步骤3孵育后的显色结果，分别获得所述第一底物组合、所述第二底物组合、所述第三底物组合和所述第四底物组合的阴性或阳性的判读结果；综合所述判读结果，获得检测结果；
所述阴性或阳性的判读标准为：
所述第一底物组合、所述第三底物组合或所述第四底物组合中，
当所述酸碱指示剂为苯酚红或苯酚红衍生物时，显色结果为红色变成黄色，即判读阳性，反之为阴性；
当所述酸碱指示剂为溴甲酚紫时，显色结果为紫色变成黄色，即判读阳性，反之为阴性；
所述第二底物组合中，显色结果为无色变成黄色，即判读阳性，反之为阴性；
综合所述判读结果，获得检测结果具体为：
Figure BDA0002704470480000041
其中，“+”表示阳性；“-”表示阴性；“v”表示“+/-”。
本发明提供了一种基于生化和显色原理的快速区分大肠埃希菌和志贺菌的检测试剂盒及其制备方法。使用本发明所述试剂盒，仅需一步操作，即能在1-2h内快速区分大肠埃希菌和鲍氏志贺菌、宋内志贺菌、福氏志贺菌、痢疾志贺菌。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示板卡；其中，A1、A2、A3、B1表示孔位置；C表示板卡。
具体实施方式
本发明公开了检测大肠埃希菌和/或志贺菌的底物组合、检测试剂及检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明的技术方案：
1、制备含有四种底物的板卡，具体如下：
A1孔：0.8％-1.2％甘露醇、1.4％-1.7％苯酚红或其他酸碱指示剂、磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液等其他缓冲体系ph7.2-7.4
B1孔：0.8％-1.2％ONPG(2-硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷)、磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液等其他缓冲体系ph7.0-8.0
A2孔：0.8％-1.2％山梨醇、1.4％-1.7％苯酚红或其他酸碱指示剂、磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液等其他缓冲体系ph7.2-7.4
A3孔：0.5％-1％甘油，1.4％-1.7％苯酚红或其他酸碱指示剂、磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液等其他缓冲体系ph7.2-7.4
每种包被液8-12ul包被在四孔板卡上，干燥后可以随时使用。(板卡图如图1所示)
2、样本为质谱或者16s rRNA测序方法鉴定为大肠埃希菌或志贺菌，需要进一步确认是大肠埃希菌还是志贺菌，使用比浊仪将制备2.5-3麦氏的菌悬液，板卡内每孔内各加入80-120ul，35-37℃孵育1-2h。
3、结果判读
A1、A2、A3孔反应原理是苯酚红初始色红色，如果细菌利用该底物会代谢产生酸性物质使PH降低，苯酚红由红色变成黄色，即判读阳性，不变色为阴性。
B1孔反应原理是2-硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷反应体系初始色为无色，细菌产生β-半乳糖苷酶将ONPG可被水解为半乳糖和黄色的2-硝基苯酚(ONP)，通过颜色无色变成黄色判读阳性，反之无色即为阴性。
表1：板卡结果判读表
甘露醇 ONPG 山梨醇 甘油 鉴定结果
+ + + + 大肠埃希氏菌
+ - - + 鲍氏志贺菌
+ - - - 福氏志贺菌
+ + - v 宋内志贺菌
- - - + 痢疾志贺菌
其中，“+”表示阳性；“-”表示阴性；“v”表示“+/-”。
当A1、A2、A3、B1均为阳性，鉴定为大肠埃希菌；
当A1孔阳性，其他三孔阴性，鉴定为福氏志贺菌；
当A3孔阳性，其他三孔阴性，鉴定为痢疾志贺菌；
当A1、A3阳性，B1、A2阳性，鉴定为鲍氏志贺菌；
当A1、B1阳性，A2阴性，鉴定为宋内志贺菌
4、结果验证：用生化鉴定的方法如梅里埃革兰氏阴性菌鉴定卡试剂盒(Vitek2GN)对上述鉴定过的细菌进行结果验证，具体如下：使用比浊仪将本发明鉴定过的菌株进行0.5～0.63麦氏菌悬液制备，将菌悬液及Vitek 2GN卡放置载卡台上加样，加样完成后取出板卡，放置配套仪器Vitek2进行孵育、连续判读以及自动报告鉴定结果，鉴定结果的菌株名称与本发明鉴定菌株名称一致。
本发明提供了一种基于生化和显色原理的快速区分大肠埃希菌和志贺菌的检测试剂盒及其制备方法。使用本发明所述试剂盒，仅需一步操作，即能在1～2h内快速区分大肠埃希菌和鲍氏志贺菌、宋内志贺菌、福氏志贺菌、痢疾志贺菌。
本发明提供的检测大肠埃希菌和/或志贺菌的底物组合、检测试剂及检测试剂盒中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
一株临床菌株，质谱鉴定结果为大肠埃希氏菌，操作步骤如下：
1、板卡制备，具体如下：
孔1：0.8％甘露醇、1.4％苯酚红、磷酸盐缓冲液ph7.2
孔2：0.8％ONPG(2-硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷)、磷酸盐缓冲液ph7.0
孔3：0.8％山梨醇、1.4％苯酚红、磷酸盐缓冲液ph7.2
孔4：0.5％甘油，1.4％苯酚红、磷酸盐缓冲液ph7.2
每种包被液12ul包被在四孔板卡上，自然干燥后使用
2、制备菌悬液：使用比浊仪将待测菌株制备2.5麦氏菌液，每孔100ul加入上述板卡，加样结束后将板卡放置37℃温箱孵育1.5h。
3、结果判读：取出板卡，记录反应孔颜色及对应的阴阳结果
孔1：黄色，阳性；
孔2：无色，阴性；
孔3：红色，阴性；
孔4：红色，阴性。
此实验结果参照技术实施方案中结果判读表(表1)，待测菌株鉴定为福氏志贺菌。
4、结果验证：使用比浊仪将上述细菌制备菌悬液0.56麦氏，将菌悬液及Vitek 2GN卡放置载卡台上加样，加样完成后取出板卡，放置配套仪器Vitek2进行孵育、连续判读以及自动报告鉴定结果，菌株鉴定结果为福氏志贺菌，与本发明鉴定结果福氏志贺菌菌名一致。
实施例2
一株临床菌株，质谱鉴定结果为大肠埃希氏菌，操作步骤如下：
1、板卡制备，具体如下：
孔1：1.2％甘露醇、1.7％苯酚红、Tris缓冲液ph7.4
孔2：1.2％ONPG(2-硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷)、Tris缓冲液ph8.0
孔3：1.2％山梨醇、1.7％苯酚红、Tris缓冲液ph7.4
孔4：1％甘油，1.7％苯酚红、Tris缓冲液ph7.4
每种包被液8ul包被在四孔板卡上，自然干燥后使用
2、制备菌悬液：使用比浊仪将待测菌株制备3.0麦氏菌液，每孔100ul加入上述板卡，加样结束后将板卡放置37℃温箱孵育1h。
3、结果判读：取出板卡，记录反应孔颜色及对应的阴阳结果
孔1：黄色，阳性；
孔2：黄色，阳性；
孔3：黄色，阳性；
孔4：黄色，阳性。
此实验结果参照技术实施方案中结果判读表(表1)，待测菌株鉴定为大肠埃希氏菌。
4、结果验证：使用比浊仪将上述细菌制备成菌悬液0.6麦氏，将菌悬液及Vitek 2GN卡放置载卡台上加样，加样完成后取出板卡，放置配套仪器Vitek2进行孵育、连续判读以及自动报告鉴定结果，菌株鉴定结果为大肠埃希氏菌，与本发明鉴定结果大肠埃希氏菌菌名一致。
实施例3
一株临床菌株，质谱鉴定结果为大肠埃希氏菌，操作步骤如下：
1、板卡制备，具体如下：
孔1：1％甘露醇、1.6％苯酚红、磷酸盐缓冲液ph7.3
孔2：1％ONPG(2-硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷)、磷酸盐缓冲液ph7.5
孔3：1％山梨醇、1.6％苯酚红、磷酸盐缓冲液ph7.3
孔4：0.8％甘油，1.6％苯酚红、磷酸盐缓冲液ph7.3
每种包被液10ul包被在四孔板卡上，自然干燥后使用
2、制备菌悬液：使用比浊仪将待测菌株制备2.8麦氏菌液，每孔100ul加入上述板卡，加样结束后将板卡放置37℃温箱孵育2h。
3、结果判读：取出板卡，记录反应孔颜色及对应的阴阳结果
孔1：红色，阴性；
孔2：无色，阴性；
孔3：红色，阴性；
孔4：黄色，阳性。
此实验结果参照技术实施方案中结果判读表(表1)，待测菌株鉴定为痢疾志贺菌。
4、结果验证：使用比浊仪将上述菌株制备成菌悬液0.58麦氏，将菌悬液及Vitek 2GN卡放置载卡台上加样，加样完成后取出板卡，放置配套仪器Vitek2进行孵育、连续判读以及自动报告鉴定结果，菌株鉴定结果为痢疾志贺菌，与本发明鉴定结果痢疾志贺菌菌名一致。
对比例
提前将待测样本进行组分差异化培养2h后以达到菌株特异性蛋白表达，然后再将差异培养后的菌株进行质谱前处理，上机进行质谱鉴定。具体如下：试验前，取适量黏附有冻存菌株的橡胶圈置于增菌液中，于35℃恒温静置培养24h，制得菌液；将菌液均匀加至不同条件(乳糖的浓度不同)培养基表面，35℃恒温静置培养一定时间，在生物安全柜中挑取单个菌落，悬浮于装有300μL纯水的1.5mL离心管中，获得细菌试验样品。将装有细菌试验样品的1.5mL离心管置于离心机中，12000g/min离心3min，弃上清，加入50μL 70％甲酸水溶液，涡旋混合3min，再加入50μL乙腈，12000g/min离心3min，去上清液1μL点于样品板上；待样品点干燥后再滴加1μL基质，放置干燥后进样，样品板载入质谱仪后激活激光系统，稳定30min，采用标准蛋白校正仪器，设置激光强度为3200。采用采样软件对质谱仪采集的数据进行对比分析，在分析软件中同时打开待比对图谱，选择Advanced baselinecorrection，设置参数为2.0，校正图谱基线；选择Noise filter去除图谱噪音，对比图谱，缺少或增加特征质谱峰的为大肠埃希菌，否则为志贺菌。
上述技术方案中步骤包括不同条件下孵育、离心、点样、裂解、干燥、加基质、干燥、上机以及最后对结果进行处理分析，涉及步骤及试剂较多，耗时久，对操作人员专业技能要求高。但本发明基于生化反应及比色原理，不需要对菌株进行特殊处理，步骤包括高浓度菌液制备、加样、温箱孵育，对照结果表进行判读结果，操作简便，使用实验室设备少，任何一个具备恒温培养箱的微生物实验室均可以实现本发明，且鉴定时长在2h内，简便高效。
上述技术方案中只能鉴定为大肠埃希菌和志贺菌，无法到志贺菌属下面的具体种。本发明可以将大肠埃希菌和四种志贺菌分别鉴定出来，通过四种生化反应结果的不同组合实现大肠和四种志贺菌鉴定，可以具体鉴定到大肠埃希菌、鲍氏志贺菌、宋内志贺菌、福氏志贺菌、痢疾志贺菌。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.检测大肠埃希菌和/或志贺菌的底物组合，其特征在于，包括第一底物组合、第二底物组合、第三底物组合和第四底物组合；
所述第一底物组合包括：0.8％～1.2％甘露醇、1.4％～1.7％酸碱指示剂和缓冲体系，pH值7.2～7.4；
所述第二底物组合包括：0.8％～1.2％糖苷或其与酚类结合的化合物和缓冲体系，pH值7.0～8.0；
所述第三底物组合包括：0.8％～1.2％甜味剂、1.4％-1.7％酸碱指示剂和缓冲体系，pH值7.2～7.4；
所述第四底物组合包括：0.5％～1％甘油、1.4％-1.7％酸碱指示剂和缓冲体系，pH值7.2～7.4。
2.如权利要求1所述的底物组合，其特征在于，所述第一底物组合、所述第三底物组合或所述第四底物组合中的所述酸碱指示剂包括苯酚红、苯酚红衍生物或溴甲酚紫中的一种或两者以上的组合物；
所述苯酚红衍生物包括苯酚红钠。
3.如权利要求1或2所述的底物组合，其特征在于，所述第二底物组合中的所述糖苷包括ONPG(2-硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷)、β-D-半乳吡喃糖苷或α-D-半乳吡喃糖苷中的一种或两者以上的组合物；
所述酚类包括但不仅限于苯酚、硝基苯酚、萘酚、吲哚酚中的一种或两者以上的组合物。
4.如权利要求1至3任一项所述的底物组合，其特征在于，所述第三底物组合中所述甜味剂包括：山梨醇、乳糖、木糖中的一种或两者以上的组合物。
5.如权利要求1至4任一项所述的底物组合，其特征在于，所述缓冲体系包括但不限于：磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液中的一种或其组合。
6.如权利要求1至5任一项所述的底物组合在制备检测大肠埃希菌和/或志贺菌中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述志贺菌包括鲍氏志贺菌、宋内志贺菌、福氏志贺菌、痢疾志贺菌中的至少一种。
8.试剂，其特征在于，包括如权利要求1至5任一项所述的底物组合以及可接受的助剂。
9.试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至5任一项所述的底物组合以及可接受的助剂或载体；所述载体包括板卡。
10.大肠埃希菌或志贺菌的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：获得如权利要求1至5任一项所述底物组合；
步骤2：取待测菌，获得2.5～3麦氏的菌悬液；所述待测菌为大肠埃希菌或志贺菌；
步骤3：取步骤1制得的所述底物组合与步骤2制得的菌悬液按照体积比(8～12)：(80～120)混合，35～37℃孵育1～2h；
步骤4：根据步骤3孵育后的显色结果，分别获得所述第一底物组合、所述第二底物组合、所述第三底物组合和所述第四底物组合的阴性或阳性的判读结果；综合所述判读结果，获得检测结果；
所述阴性或阳性的判读标准为：
所述第一底物组合、所述第三底物组合或所述第四底物组合中，
当所述酸碱指示剂为苯酚红或苯酚红衍生物时，显色结果为红色变成黄色，即判读阳性，不变色为阴性；
当所述酸碱指示剂为溴甲酚紫时，显色结果为紫色变成黄色，即判读阳性，不变色为阴性；
所述第二底物组合中，显色结果为无色变成黄色，即判读阳性，不变色为阴性；
综合所述判读结果，获得检测结果具体为：
Figure FDA0002704470470000021
其中，“+”表示阳性；“-”表示阴性；“v”表示“+/-”。
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