CN117214354A - 液相色谱-串联质谱法在细菌鉴定中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细菌鉴定技术领域，具体涉及液相色谱‑串联质谱法在细菌鉴定中的应用。该应用中的细菌鉴定包括大肠埃希菌与志贺菌的区分鉴定以及志贺菌和奈瑟氏菌的菌种鉴定，具体操作方法包括：将待测菌株的单克隆菌落在水中分散，以含有胰酶的碳酸氢铵溶液消化后离心，将上清液用浸润过甲酸的过滤器进行过滤，向滤液中加入甲酸后，用液相色谱‑串联质谱法检测待测溶液的氨基酸序列，根据所得氨基酸序列信息即可鉴定待测菌株的种类。上述操作的样品处理过程简单，处理时间短；更容易构建菌种覆盖范围广泛的用于比对的数据库，对于目前常用的MALDI‑TOF MS技术无法区分的大肠埃希菌与志贺菌属细菌以及奈瑟氏菌属细菌均能够进行精准鉴定。
Description
技术领域
本发明属于细菌鉴定技术领域，具体涉及液相色谱-串联质谱法在细菌鉴定中的应用。
背景技术
研究显示，当前世界人口的死因中，感染性疾病占25％。这表明，感染是人类健康的重要“杀手”，给人类的生存带来了严峻的挑战。感染性疾病的早发现、早诊断、早治疗对于保障人民群众的健康至关重要。而及早精准鉴定病原菌对于疾病诊断、治疗、预防和监测意义重大。
长久以来，传统的病原微生物实验室诊断技术以分离、培养、染色、生物化学鉴定等表型分类法为主，且迄今为止仍是许多病原体检测的“金标准”，但操作复杂、检测周期长(2～5天甚至一个月)，干扰因素多，敏感性与特异性受限。Vitek系统、MicroScan系统、Phoenix系统、Mini API系统等微生物鉴定系统的鉴定时间相对较短，但仍需要对样品进行过夜处理才能够进行后续操作；并且所需数据库的建立依赖于各系统对应的生化反应，构建过程中不易覆盖所有菌种，而在病原菌数据库资料不完整的情况下将直接影响鉴定的准确性，甚至无法鉴定。
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)能快速简便地鉴定病原菌，然而该技术无法精准区分大肠埃希菌与志贺菌属细菌的某些种，原因在于表现型和致病性差异显著的大肠埃希菌与志贺菌属细菌在基因组水平有着高度的同源性和相似性，二者在MALDI-TOF MS技术中呈现出相同的肽质量指纹谱而无法得到精准区分。并且，使用MALDI-TOF MS鉴定奈瑟氏菌无法精确到种，但人源性奈瑟氏菌属中除了淋病奈瑟氏菌和脑膜炎奈瑟氏菌是致病菌外，其他种类的奈瑟氏菌均被认为是环境中存在的菌，在临床工作中需要精确鉴定到种。
发明内容
针对以上问题，本发明提供液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)在细菌鉴定中的应用，既简化了样品处理过程、缩短了样品处理时间，且所构建的数据库能够覆盖所有菌种，因此能够准确而高效地区分鉴定大肠埃希菌和志贺菌属细菌，并能精准鉴定出志贺菌属细菌和奈瑟氏菌属细菌至种的水平。
为达到上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了液相色谱-串联质谱法在细菌鉴定中的应用，所述细菌鉴定包括大肠埃希菌与志贺菌属细菌的区分鉴定以及志贺菌属细菌和奈瑟氏菌属细菌的菌种鉴定，包括以下步骤：
步骤A、将待测菌株在培养基上培养，从培养物中挑取单克隆菌落，置于双蒸水中并充分分散，加入胰酶溶液，在35～39℃消化至少1h后离心，得上清液；所述胰酶溶液中含有80～120μg/mL胰酶和80～120mmol/L碳酸氢铵，所述胰酶溶液与所述双蒸水的体积比为0.8～1.2:1；
步骤B、将步骤A所得上清液置于已被0.08～0.12％v/v甲酸水溶液润湿处理过的过滤器上，以10000～15000×g离心5～10min，收集滤液；
步骤C、向步骤B所得滤液中加入0.15～2.5倍量0.08～0.12％v/v甲酸水溶液，混匀后作为待测溶液，利用液相色谱-串联质谱法检测所述待测溶液的氨基酸序列，根据检测到的氨基酸序列判断待测菌株的种类。
本发明提供的上述步骤不需要进行传统经典方法中的过夜培养以及长周期的生化鉴定过程，也无需大量细菌富集、蛋白质提取等实验步骤，即可获得可用于区分鉴定大肠埃希菌与志贺菌属细菌以及鉴定志贺菌属细菌和奈瑟氏菌属细菌的菌种的待测溶液，相对于传统经典方法中的过夜培养以及长周期的生化鉴定过程来说，样品处理方法大大简化，检测时间明显缩短；本发明利用液相色谱-串联质谱法检测待测溶液中的氨基酸序列信息来区分鉴定大肠埃希菌与志贺菌属细菌以及鉴定志贺菌属细菌和奈瑟氏菌属细菌的菌种，相对于MALDI-TOF MS微生物鉴定系统来说，本发明更容易构建菌种范围广泛的用于比对的数据库，从而能够准确区分鉴定大肠埃希菌与志贺菌属细菌以及鉴定志贺菌属细菌和奈瑟氏菌属细菌的菌种。
优选地，步骤A中所述培养基为羊血胰蛋白酶大豆琼脂培养基。
优选地，步骤A中所述胰酶溶液中所述碳酸氢铵的浓度为100mmol/L。
优选地，步骤A中所述胰酶溶液中所述胰酶的浓度为100μg/mL。
优选地，步骤A中所述消化的温度为37℃。
优选地，步骤A中所述胰酶溶液与所述双蒸水的体积比采用1:1。
优选地，步骤A中离心的转速为3000～4000rpm，离心时间为3～5min。更进一步优选地，离心的转速为4000rpm，离心时间为3min。
优选地，步骤B中所述甲酸水溶液的浓度为0.1％v/v。
优选地，步骤B中以10000×g离心10min。
优选地，区分鉴定大肠埃希菌与志贺菌属细菌或鉴定志贺菌属细菌菌种时，步骤C中所述甲酸水溶液的体积为所述滤液体积的2～2.5倍。
优选地，鉴定奈瑟氏菌属细菌定菌种时，步骤C中所述甲酸水溶液的体积为所述滤液体积的0.15～0.20倍。
优选地，步骤C中所述甲酸水溶液的浓度为0.1％v/v。
优选地，所述液相色谱-串联质谱法的色谱条件包括：
色谱柱：C18色谱柱；
流动相：流动相A为含有5％乙腈的0.1％v/v甲酸水溶液，流动相B为乙腈；
进行梯度洗脱，洗脱程序为：0→45min，流动相B的体积由5％线性增加到36％；
流速为300nL/min；
柱温为25～40℃。
更进一步优选地，所述C18色谱柱为0.075×15mm C18纳米柱。
优选地，所述液相色谱-串联质谱法的质谱条件包括：
以数据依赖模式采集质谱数据：每个扫描周期为一次剖面离子扫描和5次产物离子扫描。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
病原菌带来的感染性疾病给人类健康带来不同程度的危害，因此，建立高灵敏度、高特异性、高准确度、快速精准的病原菌鉴定检测新方法是发现、诊断、治疗感染性疾病、维护和保障人民群众的生命健康的关键。传统人工病原学检测方法操作复杂、周期长、干扰因素多；微生物鉴定自动化技术也需较长的生化反应时间，且构建的数据库有可能未能覆盖所有菌种，导致数据库不完善，而不完善的数据库会导致无法获得准确的检测结果甚至无法鉴定；MALDI-TOF MS虽然具有简便、快捷的优势，但对于基因组水平高度同源且相似的大肠埃希菌和志贺菌则无法区分，且无法准确鉴定奈瑟氏菌的菌种。因此，有必要寻找精准区分大肠埃希菌和志贺菌属细菌，能精确鉴定脑膜炎奈瑟氏菌等病原菌的新技术。以往利用氨基酸序列鉴定细菌具体菌种的方法在获取氨基酸序列信息的过程需要收集大量细菌并进行蛋白质提取等步骤，这些步骤操作繁琐，需要较长的检测时间。
为了解决以上问题，本发明实施例提供了液相色谱-串联质谱法在大肠埃希菌与志贺菌属细菌的区分鉴定以及志贺菌属细菌和奈瑟氏菌属细菌的菌种鉴定中的应用，包括以下步骤：
步骤A、将待测菌株在培养基上培养，从培养物中挑取单克隆菌落，置于双蒸水中并充分分散，加入胰酶溶液，在35～39℃消化至少1h后离心，得上清液；所述胰酶溶液中含有80～120μg/mL胰酶和80～120mmol/L碳酸氢铵，所述胰酶溶液与所述双蒸水的体积比为0.8～1.2:1；
步骤B、将步骤A所得上清液置于已被0.08～0.12％v/v甲酸水溶液润湿处理过的过滤器上，以10000～15000×g离心5～10min，收集滤液；
步骤C、向步骤B所得滤液中加入0.15～2.5倍量0.08～0.12％v/v甲酸水溶液，混匀后作为待测溶液，利用液相色谱-串联质谱法检测所述待测溶液的氨基酸序列，根据所述氨基酸序列判断待测菌株的种类。
在上述方法中，步骤A的培养基可采用羊血胰蛋白酶大豆琼脂培养基，将待测菌株在该培养基上培养至肉眼可见单个菌落，即可进行后续操作。
为了获得更好的检测结果，步骤A中胰酶溶液中碳酸氢铵的浓度优选采用100mmol/L，胰酶的浓度优选采用100μg/mL，消化的温度优选采用37℃，胰酶溶液与双蒸水的体积比优选采用1:1；步骤B中甲酸水溶液的浓度为0.1％v/v，以10000×g离心10min；区分鉴定大肠埃希菌与志贺菌属细菌或鉴定志贺菌属细菌菌种时，步骤C中甲酸水溶液的体积为滤液体积的2～2.5倍，鉴定奈瑟氏菌属细菌定菌种时，步骤C中所述甲酸水溶液的体积为所述滤液体积的0.15～0.20倍；甲酸水溶液的浓度为0.1％v/v。
为了获得更为准确的检测结果，步骤A中离心的转速为3000～4000rpm，离心时间为3～5min。
在步骤C的检测过程中，液相色谱-串联质谱法优选采用以下色谱条件：色谱柱为C18色谱柱；流动相A为含有5％乙腈的0.1％v/v甲酸水溶液，流动相B为乙腈；进行梯度洗脱，洗脱程序为：0→45min，流动相B的体积由5％线性增加到36％；流速为300nL/min；柱温为25～40℃。质谱条件包括：以数据依赖模式采集质谱数据：每个扫描周期为一次剖面离子扫描和5次产物离子扫描。
以下通过具体实施例来对本发明的方案进行说明。
实施例1
本实施例提供了液相色谱-串联质谱法在大肠埃希菌与志贺菌属细菌的区分鉴定以及志贺菌属细菌菌种鉴定中的应用，具体包括以下步骤：
1.实验过程
1.1接种实验菌株于羊血胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)培养基上，37℃过夜培养至肉眼可见的单个菌落。
1.2使用200μL吸头尖端挑取单个克隆，然后置入含50μL双蒸水的1.5mL低黏附离心管中旋转搅动，颠倒混匀并低速离心以确保细菌完全分散。
1.3用100mmol/L碳酸氢铵溶解胰酶至终浓度为100μg/mL，快速混匀并取50μL加入到上述含有细菌的离心管中，37℃消化1h，以4000×g离心3min，取上清液。
1.4吸取1.3所得上清液，置于已被10μL 0.1％v/v甲酸水溶液湿润处理过的截留分子量为30kD的自旋过滤器上，以10 000×g离心10min，收集滤液作为原始样品。取该原始样品33μL，加入67μL 0.1％v/v甲酸水溶液，混匀后作为待测溶液，取10μL进行后续LC/MS/MS检测分析；
1.5LC/MS/MS检测分析：将样品加载到0.3mm×5mm C18预柱(Thermo Fisher公司)上6min，之后预柱自动切换到0.075×15mm C18纳米LC柱(Proxeon公司)进行梯度洗脱，流动相A为含有5％乙腈的0.1％v/v甲酸水溶液，流动相B为乙腈，洗脱程序为：0→45min，流动相B的体积由5％线性增加到36％；分离速度为300nL/min，柱温为25℃，洗脱45min；然后用95％乙腈冲洗5min，用流动相A平衡10min。以高通量模式进行多样品连续分析时，为消除样本在系统内残留造成的样本之间的携带污染，每个样本运行前均运行2次空白样品的梯度：第1次用“锯齿状”梯度，即通过连续多次乙腈高低浓度切换循环(即，用95％乙腈冲洗5min，再用缓冲液A(5％乙腈，0.1％甲酸)平衡10min)，达到充分清洗色谱柱的目的；第2次是用真正样本同样的梯度，以冲洗和平衡色谱系统。使用LTQ-Orbitrap XL系统以数据依赖模式采集质谱数据，进行肽离子扫描(每个扫描周期为一次剖面离子扫描和5次产物离子扫描，收集每个扫描周期中5个强离子的串联质谱)及片段化分析。获取MS文件后，将质谱数据使用搜索软件Mascot 2.3搜索引擎(Matrix Science公司)搜索根据所有已知菌种的氨基酸序列自行建立的通用细菌鉴定数据库。搜索参数设定为：质量允许误差30ppm，胰蛋白酶酶切，允许2个漏切位点；固定修饰：无；可变修饰：甲硫氨酸氧化。搜索完成后即可获得待测菌株种水平的鉴定结果。
2.实验结果
采用该方法得到的结果如表1所示。表1结果说明该方法将所有的标准菌株和临床分离株均准确地鉴定到种的水平。
表1实验结果(大肠埃希菌与志贺菌)
注：NA表示Not Applicable。
实施例2
本实施例提供了液相色谱-串联质谱法在奈瑟氏菌属细菌的菌种鉴定中的应用，具体包括以下步骤：
1.实验过程
1.1接种实验菌株于羊血胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)培养基上，37℃过夜培养至肉眼可见的单个菌落。
1.2使用200μL吸头尖端挑取单个克隆，然后置入含50μL双蒸水的1.5mL低黏附离心管中旋转搅动，颠倒混匀并低速离心以确保细菌完全分散。
1.3用100mmol/L碳酸氢铵溶解胰酶至终浓度为100μg/mL，快速混匀并取10μL加入到上述含有细菌的离心管中，37℃消化1h，以4000×g离心3min，取上清液。
1.4吸取1.3所得上清液，置于已被10μL 0.1％v/v甲酸水溶液湿润处理过的截留分子量为30kD的自旋过滤器上，以10 000×g离心10min，收集滤液，加入10μL 0.1％v/v甲酸水溶液，混匀后作为待测溶液，取10μL进行后续LC/MS/MS检测分析；
1.5 LC/MS/MS检测分析：同实施例1中的1.5。
2.实验结果
采用该方法得到的结果如表2所示。表2结果说明该方法能够将奈瑟氏菌的标准菌株和临床分离株均准确地鉴定到种的水平。
表2实验结果(奈瑟氏菌)
注：NA表示Not Applicable。
实施例3
本实施例提供了液相色谱-串联质谱法鉴定大肠埃希菌、志贺菌和奈瑟氏菌时样品稀释倍数和相应检测到的肽段数量之间的高度线性相关性，用以评估该方法的稳定性和灵敏性。
1.实验过程
1.1接种实验菌株于羊血胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)培养基上，37℃过夜培养至肉眼可见的单个菌落。
1.2使用200μL吸头尖端挑取单个克隆，然后置入含45μL双蒸水的1.5mL低黏附离心管中旋转搅动，颠倒混匀并低速离心以确保细菌完全分散。
1.3用100mmol/L碳酸氢铵溶解胰酶至终浓度为100μg/mL，快速混匀并取45μL加入到上述含有细菌的离心管中，37℃消化1h，以4000×g离心3min，取上清液。
1.4吸取1.3所得上清液，置于已被10μL 0.1％v/v甲酸水溶液湿润处理过的截留分子量为30kD的自旋过滤器上，以10 000×g离心10min，收集滤液作为待测溶液(稀释倍数记作1)，取10μL进行后续LC/MS/MS检测分析；
1.5吸取1.4中的待测溶液，以0.1％v/v甲酸水溶液稀释3倍，混匀后作为待测溶液(稀释倍数记作1/3)，取10μL进行后续LC/MS/MS检测分析；
1.6吸取1.5中的待测溶液，以0.1％v/v甲酸水溶液稀释3倍，混匀后作为待测溶液(稀释倍数记作1/9)，取10μL进行后续LC/MS/MS检测分析；
1.7吸取1.6中的待测溶液，以0.1％v/v甲酸水溶液稀释3倍，混匀后作为待测溶液(稀释倍数记作1/27)，取10μL进行后续LC/MS/MS检测分析；
1.8吸取1.7中的待测溶液，以0.1％v/v甲酸水溶液稀释3倍，混匀后作为待测溶液(稀释倍数记作1/81)，取10μL进行后续LC/MS/MS检测分析；
1.9吸取1.8中的待测溶液，以0.1％v/v甲酸水溶液稀释3倍，混匀后作为待测溶液(稀释倍数记作1/243)，取10μL进行后续LC/MS/MS检测分析；
1.10LC/MS/MS检测分析：同实施例1。
2.实验结果
结果如表3所示。表3结果说明，在对3株标准菌株上样量进行系列稀释后依然能够得到正确的鉴定结果，说明该方法既特异又灵敏。
表3三种菌株上样量倍比稀释后的检测结果
注：表3中ATCC35562为Z群脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides,group Z)，090414为大肠埃希菌(Escherichia coli)，1105为福氏志贺菌(Shigella flexneri)。
实施例4
本实施例提供了液相色谱-串联质谱法在大肠埃希菌与志贺菌属细菌的区分鉴定以及志贺菌属细菌菌种鉴定中的应用，具体包括以下步骤：
1.1接种实验菌株于羊血胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)培养基上，37℃过夜培养至肉眼可见的单个菌落。
1.2使用200μL吸头尖端挑取单个克隆，然后置入含50μL双蒸水的1.5mL低黏附离心管中旋转搅动，颠倒混匀并低速离心以确保细菌完全分散。
1.3用80mmol/L碳酸氢铵溶解胰酶至终浓度为80μg/mL，快速混匀并取60μL加入到上述含有细菌的离心管中，39℃消化1h，以3000×g离心5min，取上清液。
1.4吸取1.3所得上清液，置于已被10μL 0.08％v/v甲酸水溶液湿润处理过的截留分子量为30kD的自旋过滤器上，以10 000×g离心10min，收集滤液作为原始样品。取该原始样品33μL，加入67μL 0.12％v/v甲酸水溶液，混匀后作为待测溶液，取10μL进行后续LC/MS/MS检测分析；
1.5同实施例1中的1.5。
实施例5
本实施例提供了液相色谱-串联质谱法在大肠埃希菌与志贺菌属细菌的区分鉴定以及志贺菌属细菌菌种鉴定中的应用，具体包括以下步骤：
1.1接种实验菌株于羊血胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)培养基上，37℃过夜培养至肉眼可见的单个菌落。
1.2使用200μL吸头尖端挑取单个克隆，然后置入含50μL双蒸水的1.5mL低黏附离心管中旋转搅动，颠倒混匀并低速离心以确保细菌完全分散。
1.3用120mmol/L碳酸氢铵溶解胰酶至终浓度为120μg/mL，快速混匀并取40μL加入到上述含有细菌的离心管中，35℃消化2h，以4000×g离心3min，取上清液。
1.4吸取1.3所得上清液，置于已被10μL 0.12％v/v甲酸水溶液湿润处理过的截留分子量为30kD的自旋过滤器上，以15 000×g离心5min，收集滤液作为原始样品。取该原始样品33μL，加入82.5μL 0.08％v/v甲酸水溶液，混匀后作为待测溶液，取10μL进行后续LC/MS/MS检测分析；
1.5同实施例1中的1.5。
实施例6
本实施例提供了液相色谱-串联质谱法在奈瑟氏菌属细菌的菌种鉴定中的应用，具体包括以下步骤：
1.1接种实验菌株于羊血胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)培养基上，37℃过夜培养至肉眼可见的单个菌落。
1.2使用200μL吸头尖端挑取单个克隆，然后置入含50μL双蒸水的1.5mL低黏附离心管中旋转搅动，颠倒混匀并低速离心以确保细菌完全分散。
1.3用80mmol/L碳酸氢铵溶解胰酶至终浓度为80μg/mL，快速混匀并取12μL加入到上述含有细菌的离心管中，37℃消化1h，以4000×g离心3min，取上清液。
1.4吸取1.3所得上清液，置于已被10μL 0.1％v/v甲酸水溶液湿润处理过的截留分子量为30kD的自旋过滤器上，以10 000×g离心10min，收集滤液，加入12μL 0.1％v/v甲酸水溶液，混匀后作为待测溶液，取10μL进行后续LC/MS/MS检测分析；
1.5LC/MS/MS检测分析：同实施例1中的1.5。
实施例7
本实施例提供了液相色谱-串联质谱法在奈瑟氏菌属细菌的菌种鉴定中的应用，具体包括以下步骤：
1.1接种实验菌株于羊血胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)培养基上，37℃过夜培养至肉眼可见的单个菌落。
1.2使用200μL吸头尖端挑取单个克隆，然后置入含50μL双蒸水的1.5mL低黏附离心管中旋转搅动，颠倒混匀并低速离心以确保细菌完全分散。
1.3用120mmol/L碳酸氢铵溶解胰酶至终浓度为120μg/mL，快速混匀并取8μL加入到上述含有细菌的离心管中，37℃消化1h，以4000×g离心3min，取上清液。
1.4吸取1.3所得上清液，置于已被10μL 0.1％v/v甲酸水溶液湿润处理过的截留分子量为30kD的自旋过滤器上，以10 000×g离心10min，收集滤液，加入8μL 0.1％v/v甲酸水溶液，混匀后作为待测溶液，取10μL进行后续LC/MS/MS检测分析；
1.5LC/MS/MS检测分析：同实施例1中的1.5。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.液相色谱-串联质谱法在细菌鉴定中的应用，其特征在于，所述细菌鉴定包括大肠埃希菌与志贺菌属细菌的区分鉴定以及志贺菌属细菌和奈瑟氏菌属细菌的菌种鉴定，具体包括以下步骤：
步骤A、将待测菌株在培养基上培养，从培养物中挑取单克隆菌落，置于双蒸水中并充分分散，加入胰酶溶液，在35～39℃消化至少1h后离心，得上清液；所述胰酶溶液中含有80～120μg/mL胰酶和80～120mmol/L碳酸氢铵，所述胰酶溶液与所述双蒸水的体积比为0.8～1.2:1；
步骤B、将步骤A所得上清液置于已被0.08～0.12％v/v甲酸水溶液润湿处理过的过滤器上，以10000～15000×g离心5～10min，收集滤液；
步骤C、向步骤B所得滤液中加入0.15～2.5倍量0.08～0.12％v/v甲酸水溶液，混匀后作为待测溶液，利用液相色谱-串联质谱法检测所述待测溶液的氨基酸序列，根据检测到的氨基酸序列判断待测菌株的种类。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤A中所述培养基为羊血胰蛋白酶大豆琼脂培养基。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤A中所述胰酶溶液中所述碳酸氢铵的浓度为100mmol/L；和/或
步骤A中所述胰酶溶液中所述胰酶的浓度为100μg/mL；和/或
步骤A中所述消化的温度为37℃；和/或
步骤A中所述胰酶溶液与所述双蒸水的体积比为1:1。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤A中离心的转速为3000～4000rpm，离心时间为3～5min。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤A中离心的转速为4000rpm，离心时间为3min。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤B中所述甲酸水溶液的浓度为0.1％v/v；和/或
步骤B中以10000×g离心10min。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，区分鉴定大肠埃希菌与志贺菌属细菌或鉴定志贺菌属细菌菌种时，步骤C中所述甲酸水溶液的体积为所述滤液体积的2～2.5倍；和/或
鉴定奈瑟氏菌属细菌定菌种时，步骤C中所述甲酸水溶液的体积为所述滤液体积的0.15～0.2倍；和/或
步骤C中甲酸水溶液的浓度为0.1％v/v。
8.根据权利要求1～7任一项所述的应用，其特征在于，所述液相色谱-串联质谱法的色谱条件包括：
色谱柱：C18色谱柱；
流动相：流动相A为含有5％乙腈的0.1％v/v甲酸水溶液，流动相B为乙腈；
进行梯度洗脱，洗脱程序为：0→45min，流动相B的体积由5％线性增加到36％；
流速为300nL/min；
柱温为25～40℃。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述液相色谱-串联质谱法的质谱条件包括：以数据依赖模式采集质谱数据：每个扫描周期为一次剖面离子扫描和5次产物离子扫描。
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