CN111678968A - 质谱法检测霉菌的前处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了质谱法检测霉菌的前处理方法，包括以下步骤：润湿霉菌采集器的头部，充分粘取霉菌样品；将霉菌与前处理试剂充分混合形成悬浊液。本发明方法不涉及离心步骤，可以简单、快速地提取霉菌总蛋白，得到信号强、区分度高的特征峰谱图，使最终鉴定结果具有更为稳定可靠。

Description

质谱法检测霉菌的前处理方法

技术领域

本发明涉及用于微生物质谱法检测霉菌的前处理方法。特别是，本发明涉及使用质谱分析法快速表征和/或鉴定测试样品中的霉菌的方法。

背景技术

临床上，丝状真菌(即霉菌)感染常发生在肿瘤、艾滋病、恶性血液病、器官移植、透析、糖尿病、大面积烧伤、创伤等患者。霉菌感染对人体危害严重，治疗困难，由其引起的血流感染和侵袭性肺部感染及其他器官感染往往是致命性的，而不同种属霉菌对抗真菌药物的敏感性不同，因此，实验室确定霉菌种属非常重要。

过去霉菌实验室诊断主要依靠形态学，即培养观察菌落形态、菌丝、孢子及产孢结构的特点进行鉴定，这种方法费时长，一般需要数天甚至数周时间，且受检验人员专业技术水平限制，不能满足临床需要。近年来临床实验室采用PCR，基因测序、MALDI-TOF质谱仪等先进的技术方法来鉴定霉菌，但是前两种方法实验成本高、技术复杂且费时，一般实验室难以开展；

MALDI-TOF质谱方法基于质谱仪自带的数据库对培养的菌株蛋白质分子谱系分析来对微生物鉴定诊断，其鉴定正确度高，具有成本和技术优势及很高的应用价值，随着质谱技术的不断完善和发展，MALDI-TOF MS技术在临床细菌和酵母快速鉴定研究中的作用日显突出，已在一些大型实验室普遍应用，但对于霉菌的鉴定准确性依旧很难保障。

为了进一步提高MALDI-TOF MS质谱仪鉴定霉菌的总体准确率，霉菌样本前处理方法的优化及更完善数据库匹配是关键，也是难点，因为霉菌菌落形态较大，质地疏松，外观干燥，尤其是菌落和培养基间的连接紧密，不易挑取。目前市面上针对真菌样本的前处理并没有统一规定的方法，并且整体处理流程操作繁琐，费时较长，鉴定水平也参差不齐。查阅相关专利,主要涉及用于细菌及酵母类真菌鉴定的菌体预处理方法较多，针对霉菌的前处理方法甚少。常见的方法有：①乙醇甲酸法，首先用从固体或半固体培养基中获取未知霉菌样品，并将未知丝状真菌样品重悬于水中，将乙醇加入容器中并混合，通过离心沉淀测试样品中的菌体并除去上清液后，将真菌沉淀重悬于甲酸中并混合，再加入乙腈并混合，离心容器，最后回收上清液。该方法为目前常规的提取法，鉴定准确率尚可，但该处理流程操作繁琐，费时较长，在操作过程中丢弃大量菌体胞外蛋白信息，一定程度上影响某些难鉴定性霉菌鉴定的准确性，也不适合临床大量真菌标本鉴定和需要快速出鉴定结果的应用场景。②改良直涂法：复苏点种后的菌株，在生物安全柜中用无菌10μl Tip头蘸取菌落产孢处与菌丝交界处的菌丝少许，直涂于已加1μl甲酸的质谱靶板靶孔中研磨成胶胨状，自然晾干后加1μl乙腈，待其晾干后再加上1μl CHCA基质溶液，室温下自然晾干。同时点1μl标准品在质谱靶的另一孔位，覆盖1μl CHCA基质溶液，室温下自然晾干，然后进行质谱鉴定。该方法在前处理时间上进行了优化，但操作精细程度要求较高，孢子和菌丝体直涂难度大，破壁效果较差，影响最终的鉴定结果。此外，还有改良的液体培养法和磁珠研磨法等，但因操作繁琐，临床不易推广。且目前涉及的霉菌前处理均涉及离心过程，其使鉴定时间增加且会导致部分蛋白信息丢失、影响鉴定结果。

发明内容

为了解决以上现有技术繁琐耗时、不易推广、霉菌鉴定不准的难题，本发明提供了质谱霉菌前处理方法，用无需离心的简便操作方法，快速实现霉菌种属鉴定。

在一方面，本发明涉及用于质谱霉菌前处理方法，该方法包括如下步骤：

(a)润湿霉菌采集器的头部，充分粘取霉菌样品；

(b)将霉菌与前处理试剂充分混合形成悬浊液；

所述前处理试剂包括甲酸和乙腈。

作为优选，所述前处理试剂还包括三乙胺。

震荡、摇晃、超声或涡旋等方式，本领域技术人员可自由选择，选择的标准为不产生明显沉降物以保证霉菌蛋白能被充分提取和检测，因此任何形式的离心在本申请中是不被推荐使用的。

步骤(a)中的霉菌样品可从液体、固体或半固体培养基中获得，培养基可用任何能使霉菌生长的培养基，优选为沙氏(SDA)培养基，可购自市面上销售的任何沙氏培养基。

所述前处理试剂中的组分可以预先配制为混合液包装，也可以分别单独包装，在使用时配制，并且与霉菌的混合无需区分先后顺序；

优选地，霉菌采集器的头部材料选自：弹性多孔材料、泡沫塑料、聚酯材料、粘胶纤维中的一种或几种，具体实例包括不限于棉花、海绵、大孔树脂等，其作用是利用其孔隙或多层结构在润湿的情况下充分吸附霉菌孢子。

作为优选，甲酸的体积百分数为30％-60％，乙腈的体积百分数为30％-60％，余量为水。

更优选地：甲酸的体积百分数为30％-60％，乙腈的体积百分数为30％-60％，三乙胺的体积百分数为1％-10％，余量为水。

在另一方面，本发明的方法还包括如下步骤：

(1)采用前述(a)和(b)步骤处理后获得的悬浊液；

(2)取悬浊液滴加于靶板孔位，干燥；

(3)滴加基质溶液，干燥后上机检测。

优选地，上述基质可使用任何已知的基质，例如，基质可以是α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA) 或龙胆酸(DHB)，本发明优选CHCA。

根据本发明，可使用质谱分析法，例如，MALDI-TOF质谱分析法将霉菌鉴定至属、种。

上述检测和鉴定的霉菌为临床检验涉及的所有霉菌种属；例如，作为优选的鉴定菌种但不限于：棒曲霉菌、阿萨希丝菌、棒状弯孢菌、草本枝孢菌、构巢曲霉、黑曲霉菌、寄生曲霉、尖孢镰孢菌、康宁木霉、蓝色犁头霉、链格孢菌、日本毛孢子、多变拟青霉、冻土毛霉、头状毛孢子、雅致小克银汉霉、烟曲霉、杂色曲霉、赫曲霉、总状毛霉、淡紫紫孢霉、孢子丝菌、茄病镰刀菌、球形枝孢菌、平冢曲霉、头状芽生裂殖菌、日本曲霉，须廯毛廯菌。

上述菌种中较难鉴定的菌例如棒曲霉菌、草木支孢菌、冻土毛霉菌、构巢曲霉、黑曲霉菌、康宁木霉、日本毛孢子、赫曲霉、孢子丝菌、淡紫紫孢霉和茄病镰刀菌优选在三乙胺的存在下进行前处理。

本发明的有益效果是：用接种环、牙签等常规取菌器材，与霉菌接触的表面积非常小，只能对霉菌进行挑取，并且在挑取过程中无法有效分离紧密相连的菌丝体和培养基，因此通常都是挑取一小块生长了霉菌的培养基进行处理，仅包括非常少量的霉菌样品。一方面培养基的成分会对后续质谱检测产生干扰，另一方面，取样非常不便，霉菌有效的取样量低，常常无法达到准确检测的目的。而应用本发明的方法，能够在霉菌表面大面积、高效的粘取霉菌样品，霉菌样品与前处理试剂稍作混合即能处于悬浮状态，能够与前处理试剂充分接触并释放足够的供检测的胞内胞外全蛋白，保留霉菌全部信息，使特征峰突显，鉴定结果更加准确可靠。

本发明的方法不采用离心操作，整个鉴定过程简单、快速，能够在1min以内完成前处理步骤；霉菌鉴定到种水平，评分均在可信区间。

附图说明

图1：棒曲霉用两种方法鉴定的质谱图(上图为本发明方法，下图为乙醇甲酸法)

图2：阿萨希丝菌两种方法鉴定的质谱图(上图为本发明方法，下图为乙醇甲酸法)

图3：棒状弯孢菌两种方法鉴定的质谱图(上图为本发明方法，下图为乙醇甲酸法)

图4：草本枝孢菌两种方法鉴定的质谱图(上图为本发明方法，下图为乙醇甲酸法)

图5：构巢曲霉两种方法鉴定的质谱图(上图为本发明方法，下图为乙醇甲酸法)

图6：黑曲霉菌两种方法鉴定的质谱图(上图为本发明方法，下图为乙醇甲酸法)

图7：寄生曲霉两种方法鉴定的质谱图(上图为本发明方法，下图为乙醇甲酸法)

图8：尖孢镰孢菌两种方法鉴定的质谱图(上图为本发明方法，下图为乙醇甲酸法)

图9：康宁木霉两种方法鉴定的质谱图(上图为本发明方法，下图为乙醇甲酸法)

图10：蓝色犁头霉两种方法鉴定的质谱图(上图为本发明方法，下图为乙醇甲酸法)

图11：链格孢菌两种方法鉴定的质谱图(上图为本发明方法，下图为本发明方法含离心步骤)

图12：平冢曲霉接种环取菌法鉴定的质谱图

图13：日本曲霉接种环取菌法鉴定的质谱图

图14：头状芽生裂殖菌接种环取菌法鉴定的质谱图

图15：头状毛孢子接种环取菌法鉴定的质谱图

图16：茄病镰刀菌接种环取菌法鉴定的质谱图

图17：日本毛孢子本发明方法添加三乙胺

图18：赫曲霉本发明方法添加三乙胺

图19：康宁木霉本发明方法添加三乙胺

图20：茄病镰孢菌本发明方法添加三乙胺

图21：草本枝孢菌本发明方法添加三乙胺

具体实施方式

本操作中涉及的所有霉菌菌种购自CMCC菌种保藏中心。

样本经培养基纯培养为单菌落后经测序验证样本准确性。

本实施例中所鉴定的霉菌菌种，选自验证过准确性的以下菌种：棒曲霉菌、阿萨希丝菌、棒状弯孢菌、草本枝孢菌、构巢曲霉、黑曲霉菌、寄生曲霉、尖孢镰孢菌、康宁木霉、蓝色犁头霉、链格孢菌、日本毛孢子、多变拟青霉、冻土毛霉、头状毛孢子、雅致小克银汉霉、烟曲霉、杂色曲霉、赫曲霉、总状毛霉、淡紫紫孢霉、孢子丝菌、茄病镰刀菌、球形枝孢菌、平冢曲霉、头状芽生裂殖菌、日本曲霉，须廯毛廯菌。

培养基为SDA固体培养基。

检测用质谱仪为：中元汇吉生物EXS3000质谱仪。

下面结合附图和具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述，也不局限于所鉴定的霉菌。

实施例1：

本发明用于霉菌质谱鉴定前处理的试剂，优选为：70％甲酸，100％乙腈。

霉菌取菌器，优选市面销售的棉签

本发明实施例的具体操作步骤：

1.向霉菌提取管中加入200μL 70％甲酸和200μL 100％乙腈；

2.将取样棉签浸入混合提取试剂中。

3.用取样棉签刮取SDA平板上新鲜培养的菌丝体和孢子，涮入提取液中。反复几次直至溶液浑浊。

4.涡旋振荡混匀，无需离心，滴加1μL悬浊液于样本靶，每个样本点4个靶点。干燥后，每个靶点滴加1μL CHCA基质溶液覆盖样本，干燥后上机检测。

乙醇甲酸法：

采用市面上郑州安图生物工程股份有限公司的前处理方法，购买安图的质谱样本预处理试剂(备案编号：豫郑食药监械生产备20140009号)并按照试剂盒中的产品说明书的指导进行操作，具体操作步骤如下：

1、在1.5mL离心管中加入300μL去离子水

2、取样本(在中等大小菌落中挑取1-2个单菌落)于离心管中，充分振荡混匀。

3、加入900μL无水乙醇，充分混匀。

4、室温离心2-4min(转速8000-14800rpm)，弃去上清，再次离心，使用完全除去上清。

5、37-40℃，干燥沉淀2-5min，至沉淀表面无明显水迹。

6、加入10μL裂解液I(含甲酸的溶液)，充分混匀。

7、加入10μL等体积的裂解液II(含乙腈的溶液)，充分混匀。

8、室温离心2-4min(转速8000-14800rpm).

9、吸取1μL上清液，滴加到样品靶上，晾干至样品点无明显水迹。

10、取1μL基质溶液(α-氰基-4-羟基肉桂酸)覆盖在上述样品点上，晾干至样品点无明显水迹。

11、将样品靶放入质谱仪进行鉴定。

鉴定结果

实验结果表明，本发明方法比市面上所用的乙醇甲酸法评分更高，且本发明检测霉菌的评分均在可信区间，可以将霉菌鉴定到种水平。相比之下，乙醇甲酸法对于霉菌的检测，多数评分低于1.7，处于不可信区间，甚至有一些较难检测的霉菌：棒曲霉、草木枝孢霉、冻土毛霉、构巢曲霉、黑曲霉菌、康宁木霉、日本毛孢子，赫曲霉无法得到正确的检测结果。

其原因在于，该处理流程操作繁琐，费时较长，在操作过程中丢弃大量菌体胞外蛋白信息，同时，不同操作习惯，操作细节，如乙醇干燥程度、离心后放置时间，对谱图有一定影响，因此，不同操作人员对同一株菌的前处理得到的谱图会有差异，甚至同一操作人员重复处理同一株菌谱图都会有差异，从而造成了乙醇甲酸法重复性差，结果时好时坏。实际操作过程中与文献报道结果差异很大。

因此，本发明方法通过对霉菌裂解液组分进行创新，在裂解过程中同步进行灭活、破壁、提取，从而减少操作步骤，从根本上减少操作误差，在提高易用性的同时提高重复性，不需要多次离心，也不需要37-40℃、干燥沉淀2-5min的过程，不需要借助其他仪器、操作简便，大大节约了鉴定时间，能够实现1min以内快速检测。

实施例2探究离心对鉴定的影响

方法同实施例1：本发明方法，不涉及任何离心步骤

对比方法：本发明(离心)，将实施例1本发明方法中步骤4的混匀过程替换为离心,转速取 12000rpm，离心3min

中文名称	拉丁名称	方法及试剂	鉴定结果	分数
					链格孢菌	Alternaria Nees	本发明方法	Alternaria Nees	2.28
链格孢菌	Alternaria Nees	本发明方法(离心)	Alternaria Nees	2.09
					淡紫紫孢霉	Paecilomyces lilacinus	本发明方法	Paecilomyces lilacinus	1.99
淡紫紫孢霉	Paecilomyces lilacinus	本发明方法(离心)	Paecilomyces lilacinus	1.63
					孢子丝菌	Sporothrix schenckii	本发明方法	Sporothrix schenckii	2.13
孢子丝菌	Sporothrix schenckii	本发明方法(离心)	Sporothrix schenckii	2.00
					茄病镰刀菌	Fusarium solani	本发明方法	Fusarium solani	1.99
茄病镰刀菌	Fusarium solani	本发明方法(离心)	Fusarium solani	1.85
					球形枝孢菌	Cladosporium globosum	本发明方法	Cladosporium globosum	2.37
球形枝孢菌	Cladosporium globosum	本发明方法(离心)	Cladosporium globosum	2.12

实验结果表明，本发明方法不离心的效果比离心更好，其原因在于，离心去除上清的过程会丢失溶解度不好的蛋白质的信息。

所以本发明方法，不涉及离心过程，不仅可以使操作更加简单快速，还可以提高鉴定结果的可信度，适用于霉菌的检测鉴定。

实施例3：接种环取菌鉴定

接种环取菌法，与实施例1本发明相比将步骤2中的取样棉签更换为接种环，进行取菌。

结果表明：

1、取菌环取菌会有很多杂峰、谱图混乱，干扰实验结果

2、评分都在2以下，且对较难鉴定的棒曲霉、草木枝孢霉、构巢曲霉、黑区霉菌、康宁木霉，头状芽生裂殖菌，茄病镰刀菌不能鉴定准确。

3、错检的可能较大，例如头状毛孢子并不算较难鉴定的菌种，利用乙醇甲酸法方法及本发明方法能可信鉴定，但是接种环取菌无法鉴定准确。

所以，接种环取菌法，运用在霉菌的鉴定上存在较大的缺陷，并不适用于霉菌的建库和鉴定分析。说明即使操作相同，但换了取菌装置也会对结果产生较大影响。

而接种环或者牙签等坚硬物不适用于取霉菌主要是因为：一方面取菌量较少，另一方面在取菌的过程中：所取样本大量为菌丝体和培养基的混合物，少量为霉菌孢子。

取菌数量少，鉴定较为困难；而培养基本身成分较为复杂，含有糖，蛋白质等成分，会对质谱结果产生干扰，导致鉴定错误；

所以本发明方法，可以大量蘸取霉菌样本，获得准确的鉴定结果。

实施例4：较难检测霉菌的鉴定

本发明用于霉菌质谱鉴定前处理的试剂，优选为：70％甲酸，100％乙腈

霉菌取菌器，优选市面销售的棉签

本发明实施例的具体操作步骤：

1.向霉菌提取管中加入200μL 70％甲酸、200μL 100％乙腈和5μL 20％的三乙胺；

2.将取样棉签浸入混合提取试剂中。

3.用取样棉签刮取SDA平板上新鲜培养的霉菌样品，涮入提取液中。反复几次直至溶液浑浊。

4.涡旋振荡混匀，无需离心，滴加1μL悬浊液于样本靶，每个样本点4个靶点。干燥后，每个靶点滴加1μL基质溶液覆盖样本，干燥后上机检测。

实验结果表明，本发明不添加三乙胺，评分在2左右，能将乙醇甲酸法难以准确鉴定的霉菌种水平，可以准确的鉴定到属。但在裂解过程添加三乙胺，评分多数能达到2.30以上，可以准确鉴定到种水平。

说明，添加三乙胺再利用本发明取霉菌的方法，可以实现较难鉴定的霉菌，鉴定到种。

Claims (10)

1.质谱法检测霉菌的前处理方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(a)润湿霉菌采集器的头部，充分粘取霉菌样品；

(b)将霉菌与前处理试剂充分混合形成悬浊液；

所述前处理试剂包括甲酸和乙腈。

2.如权利要求1所述前处理方法，其特征在于，所述前处理试剂还包括三乙胺。

3.如权利要求1或2所述前处理方法，其特征在于，采用包括但不限于震荡、摇晃、超声或涡旋的方式将霉菌与前处理试剂充分混合。

4.如权利要求1或2所述前处理方法，其特征在于，霉菌采集器的头部材料选自：弹性多孔材料、泡沫塑料、聚酯材料、粘胶纤维、丙烯酸纤维中的一种或几种。

5.如权利要求4所述前处理方法，其特征在于，所述霉菌采集器头部材料选自：棉花、海绵或大孔树脂。

6.如权利要求1所述前处理方法，其特征在于，所述前处理试剂中甲酸的体积百分数为30％-60％，乙腈的体积百分数为30％-60％，余量为水。

7.如权利要求2所述前处理方法，其特征在于，所述前处理试剂中甲酸的体积百分数为30％-60％，乙腈的体积百分数为30％-60％，三乙胺的体积百分数为1％-10％，余量为水。

8.一种质谱鉴定霉菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)采用如权利要求1-7所述前处理方法获得悬浊液；

(2)取悬浊液滴加于靶板孔位，干燥；

(3)滴加基质溶液，干燥后上机检测。

9.如权利要求8所述方法，其特征在于，所述基质溶液包括：α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)。

10.如权利要求1-9所述方法，其特征在于，所述霉菌包括但不限于：棒曲霉菌、阿萨希丝菌、棒状弯孢菌、草本枝孢菌、构巢曲霉、黑曲霉菌、寄生曲霉、尖孢镰孢菌、康宁木霉、蓝色犁头霉、链格孢菌、日本毛孢子、多变拟青霉、冻土毛霉、头状毛孢子、雅致小克银汉霉、烟曲霉、杂色曲霉、赫曲霉、总状毛霉、淡紫紫孢霉、孢子丝菌、茄病镰刀菌、球形枝孢菌、平冢曲霉、头状芽生裂殖菌、日本曲霉，须廯毛廯菌。

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