CN102321738B - 检测致病曲霉菌的荧光定量pcr通用引物、检测探针和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种曲霉菌的荧光定量PCR检测通用引物，检测探针和检测试剂盒，所述检测试剂盒的包括有碱基组成如SEQ ID.NO：1和SEQ ID.NO：2所示的通用引物；针对烟曲霉菌的检测探针为CY5-TAAAGTTGGGTGTCGGCTGG-BHQ 针对黄曲霉菌的检测探针为FAM-TTGATTTGCGTTCGGCAAGC-BHQ、针对土曲霉菌的检测探针HEX-ACAAGTTGCAAATAAATGCGTCG-BHQ、和/或针对黑曲霉菌的检测探针ROX-ATGGTTGGAAAACGTCGGCA-BHQ。本发明的针对四种主要致病性曲霉菌的多重荧光PCR检测方法及其引物、探针和试剂盒，其特异性和敏感性高，快速简便，且可检测、鉴定病原菌到种。

Description

检测致病曲霉菌的荧光定量PCR通用引物、检测探针和试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地是涉及一种检测致病曲霉菌的荧光定量PCR通用引物、检测探针和试剂盒。

背景技术

近年来，随着广谱抗生素、免疫抑制剂的广泛应用以及血液恶性肿瘤、器官移植等免疫低下人群的不断增多，深部真菌感染的发病率正在急剧上升。其中，曲霉菌在免疫力低下患者中已成为仅次于白色念珠菌的重要致病真菌。在免疫缺陷患者中，曲霉菌感染的发病率高达50％。曲霉菌感染，特别是侵袭性曲霉病预后很差，尽管新的抗真菌药不断出现并用于临床治疗，但是病死率仍高达50％～90％。由于该病临床表现无特异性，致使诊断较为困难，约30％的病例在尸检时才能确诊。早期诊断曲霉菌感染是提高患者生存率和改善患者预后的关键，发展早期快速诊断曲霉菌感染的新方法已刻不容缓。

目前，临床上常用的诊断方法包括：真菌显微镜检查和培养、组织病理学检查、影像学检查以及血清学检查。但是，这些方法都存在一定的缺陷和局限性：传统的培养及镜检方法阳性率低、耗时长；组织病理学检查为侵入性操作，不易取材，且需要免疫组化方法来进一步鉴定菌种；影像学检查所见的Halo征是侵袭性肺曲霉菌病早期的特征性表现，但缺乏特异性；血清学检查特异性抗原或代谢产物的方法如检测半乳甘露聚糖抗原(GM抗原)和(1→3)2β2D2葡聚糖(G实验)虽然快速简便，但其敏感性、特异性以及在早期诊断、病情监测方面的价值仍然不能令人满意，且无法鉴定曲霉菌的菌种。

目前最有发展前景的是分子生物学方法----多聚酶链反应(PCR)技术。

传统的PCR技术：最常用于曲霉菌诊断的传统PCR技术是巢式PCR(nested-PCR)，是通过“外”、“内”两对引物完成的两轮PCR反应，即一对扩增较大DNA片段的外引物和一对以扩增产物为模板再扩增小片段的内引物。巢式PCR虽较灵敏，但需进行两次PCR，增加了污染机会，提高了其假阳性率。

实时定量PCR技术：传统PCR技术的另一缺陷是PCR产物不易定量，自1995年美国PE公司提出实时PCR检测原理后，实时定量PCR(real-timePCR)以其快速、灵敏、特异、定量、无交叉污染等突出优点在医学领域得到广泛应用，在曲霉菌感染的诊断中已展现出诱人的前景。主要包括以下几种：

1.非特异性荧光染料染色法(SYBR Green I染料)：荧光染料能特异性地结合双链DNA，而不结合单链DNA。此种方法的优点是简便易行，缺点主要是特异性不强，染料可以和任何双链DNA结合，不能区分引物二聚体、非特异性扩增产物与特异性扩增产物。为了减少非特异扩增产物和引物二聚体的干扰，可以在PCR完成后立即进行融解曲线分析。

2.特异性探针杂交方法：因为荧光染料法特异性不高，而且不适合进行多重PCR分析，为了克服这些缺陷，人们发展了特异性荧光探针杂交技术，包括Taqman探针、分子信标、Scorpion引物，杂交探针方法等方法。

过去，国内外大部分关于曲霉菌DNA检测的研究都主要集中于被认为是主要感染菌的烟曲霉菌，或仅为曲霉菌属，而不鉴定到种。但最近有报道指其它种类的曲霉菌种感染也在不断增多，例如包括黄曲霉，黑曲霉和土曲霉，95％以上的侵袭性曲霉病由以上四种曲霉菌感染造成。此外，有研究指，土曲霉对传统的抗真菌药两性霉素B显示出逐渐升高的耐药趋势，因此，种的进一步区分显得尤为重要。

本发明拟借助TaqMan荧光定量PCR技术，通过构造特异性的多重荧光探针和通用引物，建立一种能同时检测鉴定烟曲霉，黄曲霉，黑曲霉，和土曲霉四种曲霉菌的多重荧光定量PCR诊断技术，更好的扩展和完善了除烟曲霉菌外的检测能力，并且具有同样高的敏感性和特异性，以利于侵袭性曲霉菌病的早期诊断和针对性治疗。

发明内容

为了克服现存各种曲霉菌检测技术的缺陷性和局限性，本发明的目的之一是一种可用于曲霉菌的荧光定量PCR检测的通用引物。

实现该目的的技术方案如下：

一种用于曲霉菌的荧光定量PCR检测的通用引物，其碱基组成如SEQID.NO：1和SEQ ID.NO：2所示。

本发明的另一目的是提供一种用于曲霉菌的荧光定量PCR的检测探针，该探针是分别针对四种主要致病性曲霉菌包括烟曲霉，黄曲霉，黑曲霉，土曲霉特异性基因序列的。

实现该目的的技术方案如下：

一种曲霉菌的荧光定量PCR检测探针，该检测探针为：针对烟曲霉菌的检测探针的碱基组成如SEQ ID.NO：3所示、针对黄曲霉菌的检测探针的碱基组成如SEQ ID.NO：4所示、针对土曲霉菌的检测探针的碱基组成如SEQ ID.NO：5所示、和/或针对黑曲霉菌的检测探针的碱基组成如SEQ ID.NO：6所示。

本发明的再一目的是提供一种曲霉菌的多重荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒可以同时或分开针对四种主要致病性曲霉菌包括烟曲霉，黄曲霉，黑曲霉，土曲霉进行检测。

实现该目的的技术方案如下：

一种曲霉菌的荧光定量PCR检测试剂盒，包括有：

A.碱基组成如SEQ ID.NO：1和SEQ ID.NO：2所示的通用引物；

B、针对烟曲霉菌的检测探针为CY5-TAAAGTTGGGTGTCGGCTGG-BHQ、

针对黄曲霉菌的检测探针为FAM-TTGATTTGCGTTCGGCAAGC-BHQ、

针对土曲霉菌的检测探针HEX-ACAAGTTGCAAATAAATGCGTCG-BHQ、和/或

针对黑曲霉菌的检测探针ROX-ATGGTTGGAAAACGTCGGCA-BHQ。

本发明通过自主设计用于检测曲霉菌的特异性探针与通用引物，可以同时鉴定出包括烟曲、黄曲、土曲、黑曲在内的4种临床常见曲霉菌种，实现多重检测。通过实验证实有较高的敏感性和特异性，且所建立的方法重复性，稳定性满足检测要求。整个检测过程仅需2-3个小时。相对于传统曲霉培养方法和直接涂片镜检的低敏感性和耗时长(曲霉培养平均需要一周以上)，组织病理学的有创性操作，影像学的低特异性，多重荧光定量PCR具有不可比拟的快速，取材简便，特异性强，敏感性高等优点。而与近年来被临床上广泛使用的血清学方法相比，多重荧光定量PCR除具有更高的灵敏度外，还可检测、鉴定病原菌到种，动态监测标本中病原菌的核酸负荷量，其结果更具客观可靠性、易于判断。

总体而言，与现有检测方法相比，本发明的针对四种主要致病性曲霉菌的多重荧光PCR检测方法及其引物、探针和试剂盒，其特异性和敏感性高，快速简便，且可检测、鉴定病原菌到种。

附图说明

图1是本发明所述的引物及探针基因定位效果图；

图2是所述通用引物扩增四种曲霉菌DNA的产物电泳图谱；

图3是烟曲霉菌标准曲线：Y＝-3.117x+41.878，R^2＝0.997；

图4是黑曲标准曲线：Y＝-3.674x+45.939，R^2＝0.999；

图5是黄曲标准曲线：Y＝-3.583x+43.125，R^2＝0.989；

图6是土曲标准曲线：Y＝-3.454x+42.222，R^2＝0.992；

图7是实施例2中多重荧光定量PCR对烟曲的特异性检测结果图；

图8是实施例2中多重荧光定量PCR对黄曲的特异性检测结果图；

图9是实施例2中多重荧光定量PCR对土曲的特异性检测结果图；

图10是实施例2中多重荧光定量PCR对黑曲的特异性检测结果图；

图11是实施例3中烟曲霉多重荧光定量PCR法的检测敏感性；

图12是实施例3中黄曲霉多重荧光定量PCR法的检测敏感性；

图13是实施例3中土曲霉多重荧光定量PCR法的检测敏感性；

图14是实施例3中黑曲霉多重荧光定量PCR法的检测敏感性；

图15是实施例4中1×10⁴copies/ml浓度的重复性检测；

图16是实施例4中1×10⁶copies/ml浓度的重复性检测；

图17是实施例4中1×10⁸copies/ml浓度的重复性检测；

图18是实施例5中部分临床标本的检测结果；

图19是实施例5中部分临床标本的检测结果。

具体实施方式

本发明所用的主要试剂如下：

酵母膏                         英国OXOID公司

人类基因组DNA提取试剂盒        德国QIAGEN公司

rTaq DNA聚合酶                 日本TaKaRa公司

dNTPs                          日本TaKaRa公司

10x rTaq DNA聚合酶缓冲液       日本TaKaRa公司

Lyticase                       德国Sigma公司

琼脂糖                         西班牙BioWest公司

溴化乙锭                       北京鼎国公司

50*TAE                         广州威佳公司

荧光定量PCR试剂盒              日本TaKaRa公司

DL2000、100bp Marker           日本TaKaRa公司

葡萄糖、蛋白栋、氯化钠         广州威佳公司

琼脂                           广州威佳公司

真菌通用引物                   上海超世生物技术有限公司

荧光定量PCR探针                上海超世生物技术有限公司

细菌基因组提取试剂盒           德国QIAGEN公司

人全血细胞DNA提取试剂盒        德国QIAGEN公司

真菌基因组提取试剂盒           德国QIAGEN公司

质粒小提试剂盒                 北京天根生化科技有限公司

曲霉菌标准菌株：

将-70℃保存的菌种室温下解冻后，接种至新鲜配制的沙堡氏固体培养基，30℃培养3天，挑取菌落溶于曲霉菌孢子制备液中，震荡混匀，制成0.5mol/L溶液。注射式过滤器过滤，血球计数板显微镜下计数。作为标准菌株储存液于-20℃冰箱中备用。

实施例1

本实施例所述检测致病曲霉菌的荧光定量PCR试剂盒，包括有：

A.真菌通用引物序列：

正向引物(P1)：5’～GTGAATCATCGAGTCTTTGAAC～3’(SEQ ID.NO：1)

反向引物(P2)：5’～TCCTCCGCTTATTGATATGC～3’；(SEQ ID.NO：2)

B、4种特异性荧光定量PCR引物探针序列及荧光标记，如下表：

引物及探针基因定位效果参见图1。

3.2利用合成的通用引物经普通PCR扩增四种待测标准曲霉菌株，

按常规方法提取的四种曲霉的DNA为模板，PCR反应体积为25ul，反应体系包括Taq酶0.125ul，10×Buffer 2.5ul，dNTP 2ul，通用引物(0.1mmol/l)各1ul，DNA模板1ul，补DEPC水至25ul。每次试验均设阴性对照，阳性对照和空白对照。反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，退火57℃1min，72℃延伸30s，扩增30个循环，最后72℃延伸5min。

PCR产物扩增后经1％琼脂糖凝胶电泳得到四条大约300bp左右的条带。

参见图2。

PCR产物纯化后，按常规方法将纯化回收的片段与载体Pmd19-T VECTOR连接，克隆构建重组质粒构，测序，所得结果与四种待测曲霉ITSII rDNA基因对比，测序结果显示插入片段与预期片段序列一致，相似性99％。

3.4定量标准曲线的建立

重组质粒测定稀释后，在最佳反应条件下进行荧光定量PCR扩增，完成后计算机自动绘制标准曲线。反应条件为：25ul反应体系包括Taq酶0.125ul，10×Buffer 2.5ul，dNTP 2ul，通用引物(0.1mmol/l)各1ul，4条探针(0.1mmol/l)各0.3ul，DNA模板1ul，补DEPC水至25ul。每次试验均设阴性对照，阳性对照和空白对照。反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，退火57℃1min，72℃延伸30s，扩增40个循环。荧光信号在每次循环的延伸阶段收集，荧光信号阈值以刚好超过正常阴性对照(以灭菌三蒸水为模板)扩增曲线的最高点为准，扩增产物的荧光信号达到阈值时所需的扩增循环次数，称之为Ct值，检测样品Ct值≤35.0者判为阳性，Ct值＞35.0或者无读数者判为阴性。

将鉴定好的阳性质粒测定OD260吸光度值后计算机自动计算出浓度(ug/ml)，再根据公式：质量/分子量(摩尔质量)×6.02×10^23，换算成拷贝数/ml，10倍稀释成10^1～10^8copies/ml浓度梯度，在最佳反应条件下每个浓度平行加入3个反应管同时进行扩增，共做4次，反应结束后计算机自动绘制标准曲线。具体参见图3-6。

实施例2：多重荧光定量PCR法的特异性

取用于本项研究的标准菌株、人全血细胞DNA和临床上常见的致病分离菌株提取DNA后，按照实施例1所述检测方法，分别用多重荧光定量PCR进行扩增，以检测其特异性。

用多重荧光定量PCR法扩增各种曲霉菌，念珠菌，标准菌株DNA，临床分离菌株DNA，和人全血细胞DNA。烟曲霉，黄曲霉，土曲霉，黑曲霉的Ct值均≤35.0，鉴定结果为阳性，而其它曲霉菌，念珠菌、细菌(如大肠埃希菌(ATCC35218)、肺炎克雷伯菌(ATCC 700603)、阴沟肠杆菌(ATCC 700323)、铜绿假单胞杆菌(ATCC 27853)、金黄色葡萄球菌(ATCC25922)、和流感嗜血杆菌(ATCC49247))、临床分离菌株、人类基因组DNA等Ct值无读数，呈阴性结果。参见图6-10。

所述标准菌株包括：烟曲霉菌(ATCC 10894)、黑曲霉菌(ATCC 16404)、黄曲霉菌(ATCC 16870)、土曲霉菌(ATCC 10020)、杂色曲霉(CICC40376)、构巢曲霉(CICC2438)、白色念珠菌(ATCC 90028)、克柔念珠菌(ATCC 5258/6258)、光滑念珠菌(ATCC 2001)、热带念珠菌(ATCC 750)、乳酒念珠菌(ATCC 10022)、近平滑念珠菌(ATCC 22019)、葡萄牙念珠菌(ATCC 38533)、大肠埃希菌(ATCC35218)、肺炎克雷伯菌(ATCC 700603)、阴沟肠杆菌(ATCC 700323)、铜绿假单胞杆菌(ATCC 27853)、金黄色葡萄球菌(ATCC25922)、和流感嗜血杆菌(ATCC49247)，均由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供。

用于实验的临床分离菌株包括：烟曲霉菌，白色念珠菌、克柔念珠菌，光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞杆菌、金黄色葡萄球菌、和流感嗜血杆菌，由呼吸疾病研究所微生物室提供，均经过常规培养及VITEK 2Compact生化鉴定仪鉴定确认。

实施例3：多重荧光定量PCR法的敏感度

将烟曲霉，黄曲霉，土曲霉，黑曲霉孢子悬液按10倍稀释为：1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹、1×10⁰孢子/ml。按常规提取DNA后进行多重荧光定量PCR扩增，最低可检出1×10²孢子/ml的上述四种待测曲霉菌。图11-14为多重荧光定量PCR法检测曲霉菌的敏感度结果。(图中，从左往右依次是1×10⁷孢子/ml、1×10⁶孢子/ml、1×10⁵孢子/ml、1×10⁴孢子/ml、1×10³孢子/ml、1×10²孢子/ml)

实施例4：多重荧光定量PCR法的重复性实验

将鉴定好的阳性质粒换算成拷贝数并10倍稀释后，选取烟曲霉1×10⁸copies/ml，1×10⁶copies/ml，1×10⁴copies/ml三个浓度进行重复检测，每个浓度共重复5次。结果如下(表3，图15-17)。不同实验获得的Ct值标准差位于0.12～0.20，变异系(CV)为0.37％～0.80％，证实所建立的方法重复性，稳定性满足检测要求。

表3多重荧光定量PCR检测方法的重复性

实施例5：多重荧光定量PCR方法检测临床标本的初步应用

检测来自28例临床诊断为侵袭性曲霉感染病人的56份曲霉培养阳性的痰液标本，和50例健康人的痰液标本，把Ct 35.00做为判别阳、阴性的Cut-off值。多重荧光定量PCR方法检测结果如下(表4-5，图18-19)。阳性率为49.1％(52/106)，其中检出烟曲42例，黄曲6例，黑曲3例，土曲1例，每份标本均平行检测2次。8例临床诊断为曲霉感染而荧光定量PCR检测为阴性中的3例，通过培养菌落形态学观察，有1例疑为青霉菌，通过棉蓝染色显微镜下观察，根据其孢子顶囊的瓶梗结构及孢子梗结构判断，有2例显示其可能为四种待测曲霉菌以外的其他曲霉菌。

表4多重荧光定量PCR检测结果

表5多重荧光定量PCR检测方法的敏感性，特异性，预测值

本发明通过大量的研究，设计出用于检测曲霉菌的特异性探针与引物，可以同时鉴定出包括烟曲、黄曲、土曲、黑曲在内的4种临床常见曲霉菌种，实现多重检测，成功建立侵袭性曲霉菌病的多重荧光定量PCR诊断技术。构建了含有目的扩增片断的阳性质粒做为阳性对照。本发明所述的重荧光定量PCR检测试剂盒，具有较高的特异性、敏感性，并且重复性好。

Claims (1)

1.一种曲霉菌的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：包括有：

A 、碱基组成如SEQ ID.NO：1和SEQ ID.NO：2所示的通用引物；

B、针对烟曲霉菌的检测探针为CY5- TAAAGTTGGGTGTCGGCTGG-BHQ、

针对黄曲霉菌的检测探针为FAM-TTGATTTGCGTTCGGCAAGC-BHQ、

针对土曲霉菌的检测探针HEX-ACAAGTTGCAAATAAATGCGTCG-BHQ、和/或

针对黑曲霉菌的检测探针ROX-ATGGTTGGAAAACGTCGGCA-BHQ。

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