CN104046681A - 一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法 - Google Patents

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余知和
曾昭清
周建芬
程云方
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

本发明涉及一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法，属真菌分子生物检测技术领域，其特征在于包括如下步骤：（1）提取待测烟曲霉菌株的总DNA；（2）选取RPB2基因作为分子标记，即目的片段，设计特异性引物3条；（3）待测烟曲霉菌株目的片段PCR扩增；（4）琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳检测结果判断待测菌株是否为烟曲霉菌。本发明的检测方法能快速鉴定出烟曲霉菌，具有快速、准确、高效的优点。

Description

一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法，属真菌分子生物检测技术领域。
背景技术：
真菌存在于几乎所有的陆地和水生生态系统中，与人类生产活动和生活关系密切。许多真菌具有重要的经济意义，但也有些种类的真菌会引起植物、动物和人类的病害或产生毒素，会危害人类的健康。
烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus）是自然界中广泛存在的腐生真菌，也是重要的机会致病菌。随着免疫受损人群的增多，系统性曲霉病的90%是由烟曲霉菌引起的。同时，烟曲霉菌产生的毒素严重污染粮食与饲料制品，危害人和动物的健康，造成重大的经济损失，烟曲霉菌已成为临床医学和医学微生物家们关注的热点。
烟曲霉菌的检测技术经历了传统培养鉴别、层析法及色谱法等化学方法检测、免疫学检测、分子生物学检测等。
近年来，随着高效基因扩增平台、引物设计方案以及定量扩增技术的发展和应用，包括真菌在内的微生物快速检测与鉴定对于病害诊断、监测和防治具有重要意义。
发明内容：
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法，具有快速、准确、高效的特点。
本发明是通过如下技术方案来实现上述目的的。
本发明提供的一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法，包括如下步骤：
（1）提取待测烟曲霉菌株的总DNA；
（2）选取RPB2基因作为分子标记，即目的片段，设计特异性引物3条，分别为：
1)引物名称F2255，引物序列CCAACAAGCGTGTTCGTTCAG；
2)引物名称R3044，引物序列TGTCCGTGACGAGAGGCAAAT；
3)引物名称R3438，引物序列CTGCCGGGTCAGAATCTGT；
（3）待测烟曲霉菌株目的片段PCR扩增；
（4）琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳检测结果判断待测菌株是否为烟曲霉菌。
本发明与现有的技术相比具有如下有益效果：
本发明基于已公布的曲霉属真菌烟曲霉、棒曲霉、费氏曲霉、黄曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉和土曲霉等的基因组序列，通过基因组同源性分析，选择RPB2基因作为研究对象，根据RPB2基因存在的12个保守区域的序列比对结果和变异位点，筛选出可用于烟曲霉快速鉴定的特异性引物。通过设计3条引物，对待测烟曲霉菌株的目的基因片段进行PCR扩增,通过琼脂糖凝胶电泳检测方法判断待测菌株是否为烟曲霉菌。
具体实施方式：
下面结合具体实施例，对本发明作进一步说明。
1、待测曲霉菌株的培养
待测曲霉菌样品来源于中国科学院微生物研究所、北京大学真菌和真菌病研究中心、吉林大学真菌研究中心，接种至PDA培养基上，置培养箱28℃培养。
2、待测曲霉菌株的DNA提取
挑取直径5mm的曲霉菌株菌丝块接种至100ml PD液体培养基中，室温下摇床培养(250rpm)2--4周，收集菌体并用无菌生理盐水冲洗数次，灭菌滤纸吸干。取0.1g菌体在液氮中迅速研磨成粉末，用2%(w/v)CTAB缓冲液抽提DNA，0.8%琼脂糖凝胶检测DNA样品。
3、目的片段PCR扩增
PCR反应在ABI2720PCR仪(美国加州ABI公司)上进行，25μl反应体系包括：超纯水17.5μl，10×buffer2.5μl，引物(10μM)各1μl，TaqDNA聚合酶(1.25U/μl)0.5μl，dNTP(2.5mM)1μl，模板DNA1μl。
PCR反应条件为：94°C预变性4min；94°C变性30s，66°C(或64°C)退火30s，72°C延伸45s，30个循环；72°C延伸7min。
引物列表：
4、琼脂糖凝胶电泳检测
扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，引物F2255-R3044和F2255-R3438的扩增产物分别约800bp和1200bp。
5、序列测定验证
目的片段PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司，ABI3730XL测序仪双向测序。
引物F2255/R3044扩增烟曲霉得到的序列为790bp：
CCAACAAGCGTGTTCGTTCAGTCCTCAGTCAAAAGGCACACACTTGGACGCATTGCGAGATTCACC
CCAGTATGATTCTTGGTGTTTGTGCCAGTATCATTCCCTTCCCGGACCACAACCAGTCGCCTCGTA
ATACCTACCAGTCTGCAATGGGCAAACAAGCCATGGGTGTGTTTTTGACCAACTTTGACCAACGAA
TGGAGACAATGGCAAATATTCTCTATTACCCGCAGAAACCGCTAGCCACAACACGGTCCATGGAAT
TCCTTCGATTCCGTGAACTACCAGCTGGGCAGAATGCCATCGTCGCCATTGCTTGCTACTCCGGAT
ACAACCAAGAAGATTCGGTCATCATGAACCAGAGCAGCATCGATCGTGGTCTCTTCCGAAGTCTCT
TCTATCGCACATACACGGATAGCGAGAAAATGGTTGGCCTGACTGTTGTCGAGCGGTTTGAGAAGC
CCATGCGCTCGGATACGATCGGTATGAGAAAGGGCACCTACGATAAGCTCGATGAGGACGGTATCA
TTGCCCCTGGTGTGCGTGTCTCCGGAGAGGATATTATCATCGGCAAGACCGCCCCGTTGGCACCCG
AGGCGGAGGAACTTGGCCAGCGAACCAAGGCACATACCAAGCTGGATGTGTCGACGCCATTAAGAA
GCACTGAAAATGGTATTGTGGATCAAGTCCTGGTCTCTACCAGCAATGATGACCTCAAGTTCGTCA
AGGTGCGCATGAGAACGACAAAGATTCCTCAGATCGGAGACAAATTTGCCTCTCGTCACGGACA
引物F2255/R3438扩增烟曲霉得到的序列为1184bp：
CCAACAAGCGTGTTCGTTCAGTCCTCAGTCAAAAGGCACACACTTGGACGCATTGCGAGATTCACC
CCAGTATGATTCTTGGTGTTTGTGCCAGTATCATTCCCTTCCCGGACCACAACCAGTCGCCTCGTA
ATACCTACCAGTCTGCAATGGGCAAACAAGCCATGGGTGTGTTTTTGACCAACTTTGACCAACGAA
TGGAGACAATGGCAAATATTCTCTATTACCCGCAGAAACCGCTAGCCACAACACGGTCCATGGAAT
TCCTTCGATTCCGTGAACTACCAGCTGGGCAGAATGCCATCGTCGCCATTGCTTGCTACTCCGGAT
ACAACCAAGAAGATTCGGTCATCATGAACCAGAGCAGCATCGATCGTGGTCTCTTCCGAAGTCTCT
TCTATCGCACATACACGGATAGCGAGAAAATGGTTGGCCTGACTGTTGTCGAGCGGTTTGAGAAGC
CCATGCGCTCGGATACGATCGGTATGAGAAAGGGCACCTACGATAAGCTCGATGAGGACGGTATCA
TTGCCCCTGGTGTGCGTGTCTCCGGAGAGGATATTATCATCGGCAAGACCGCCCCGTTGGCACCCG
AGGCGGAGGAACTTGGCCAGCGAACCAAGGCACATACCAAGCTGGATGTGTCGACGCCATTAAGAA
GCACTGAAAATGGTATTGTGGATCAAGTCCTGGTCTCTACCAGCAATGATGACCTCAAGTTCGTCA
AGGTGCGCATGAGAACGACAAAGATTCCTCAGATCGGAGACAAATTTGCCTCTCGTCACGGACAGA
AGGGTACCATTGGTATCACCTACCGGCAGGAAGACATGCCGTTTACACGCGAGGGTGTTTCCCCCG
ATCTTATCATCAACCCGCATGCTATTCCATCTCGTATGACAATTGCTCACTTGATCGAGTGTCAGC
TCAGTAAAGTGTCGGCATTACGTGGGTTCGAAGGTGATGCAACACCTTTTACTGATGTTACTGTCG
ACTCAATCTCTCGTCTGCTTCGGGAGCACGGGTACCAGTCTCGTGGCTTCGAAGTGATGTACAATG
GGCATACTGGACGCAAGCTGGTTGCGCAAGTGTTCTTGGGACCAACGTACTATCAGCGTCTGCGCC
ACATGGTCGACGACAAGATCCACGCCCGTGCCCGTGGACCGACACAGATTCTGACCCGGCAG
RNA聚合酶II第二大亚基(RNA polymerase II second largest subunit,RPB2)为单拷贝基因、进化速率慢，已与ITS、RPB1、EF-1α、β-tubulin等应用于真菌分类和系统发育研究。曲霉属真菌基因组同源性分析表明，RPB2基因存在保守区域和变异位点，设计的两对特异性引物F2255/R3044和F2255/R3438只能扩增出烟曲霉菌的RPB2基因片段，通过琼脂糖凝胶电泳检测可见单一的明亮条带且长度分别约为800bp和1200bp；否则，说明待测菌株为非烟曲霉菌。

Claims (2)

1.一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）提取待测烟曲霉菌株的总DNA；
（2）选取RPB2基因作为分子标记，即目的片段，设计特异性引物3条；
（3）待测烟曲霉菌株目的片段PCR扩增；
（4）琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳检测结果判断待测菌株是否为烟曲霉菌。
2.根据权利要求1所述的一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法，其特征在于设计特异性引物3条，分别为：
1)引物名称F2255，引物序列CCAACAAGCGTGTTCGTTCAG；
2)引物名称R3044，引物序列TGTCCGTGACGAGAGGCAAAT；
3)引物名称R3438，引物序列CTGCCGGGTCAGAATCTGT。
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