CN104046681A - 一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法 - Google Patents
一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104046681A CN104046681A CN201310078921.5A CN201310078921A CN104046681A CN 104046681 A CN104046681 A CN 104046681A CN 201310078921 A CN201310078921 A CN 201310078921A CN 104046681 A CN104046681 A CN 104046681A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- aspergillus fumigatus
- detection method
- aspergillus
- rapid identification
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法,属真菌分子生物检测技术领域,其特征在于包括如下步骤:(1)提取待测烟曲霉菌株的总DNA;(2)选取RPB2基因作为分子标记,即目的片段,设计特异性引物3条;(3)待测烟曲霉菌株目的片段PCR扩增;(4)琼脂糖凝胶电泳检测,根据电泳检测结果判断待测菌株是否为烟曲霉菌。本发明的检测方法能快速鉴定出烟曲霉菌,具有快速、准确、高效的优点。
Description
技术领域:
本发明涉及一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法,属真菌分子生物检测技术领域。
背景技术:
真菌存在于几乎所有的陆地和水生生态系统中,与人类生产活动和生活关系密切。许多真菌具有重要的经济意义,但也有些种类的真菌会引起植物、动物和人类的病害或产生毒素,会危害人类的健康。
烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)是自然界中广泛存在的腐生真菌,也是重要的机会致病菌。随着免疫受损人群的增多,系统性曲霉病的90%是由烟曲霉菌引起的。同时,烟曲霉菌产生的毒素严重污染粮食与饲料制品,危害人和动物的健康,造成重大的经济损失,烟曲霉菌已成为临床医学和医学微生物家们关注的热点。
烟曲霉菌的检测技术经历了传统培养鉴别、层析法及色谱法等化学方法检测、免疫学检测、分子生物学检测等。
近年来,随着高效基因扩增平台、引物设计方案以及定量扩增技术的发展和应用,包括真菌在内的微生物快速检测与鉴定对于病害诊断、监测和防治具有重要意义。
发明内容:
为了克服现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法,具有快速、准确、高效的特点。
本发明是通过如下技术方案来实现上述目的的。
本发明提供的一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法,包括如下步骤:
(1)提取待测烟曲霉菌株的总DNA;
(2)选取RPB2基因作为分子标记,即目的片段,设计特异性引物3条,分别为:
1)引物名称F2255,引物序列CCAACAAGCGTGTTCGTTCAG;
2)引物名称R3044,引物序列TGTCCGTGACGAGAGGCAAAT;
3)引物名称R3438,引物序列CTGCCGGGTCAGAATCTGT;
(3)待测烟曲霉菌株目的片段PCR扩增;
(4)琼脂糖凝胶电泳检测,根据电泳检测结果判断待测菌株是否为烟曲霉菌。
本发明与现有的技术相比具有如下有益效果:
本发明基于已公布的曲霉属真菌烟曲霉、棒曲霉、费氏曲霉、黄曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉和土曲霉等的基因组序列,通过基因组同源性分析,选择RPB2基因作为研究对象,根据RPB2基因存在的12个保守区域的序列比对结果和变异位点,筛选出可用于烟曲霉快速鉴定的特异性引物。通过设计3条引物,对待测烟曲霉菌株的目的基因片段进行PCR扩增,通过琼脂糖凝胶电泳检测方法判断待测菌株是否为烟曲霉菌。
具体实施方式:
下面结合具体实施例,对本发明作进一步说明。
1、待测曲霉菌株的培养
待测曲霉菌样品来源于中国科学院微生物研究所、北京大学真菌和真菌病研究中心、吉林大学真菌研究中心,接种至PDA培养基上,置培养箱28℃培养。
2、待测曲霉菌株的DNA提取
挑取直径5mm的曲霉菌株菌丝块接种至100ml PD液体培养基中,室温下摇床培养(250rpm)2--4周,收集菌体并用无菌生理盐水冲洗数次,灭菌滤纸吸干。取0.1g菌体在液氮中迅速研磨成粉末,用2%(w/v)CTAB缓冲液抽提DNA,0.8%琼脂糖凝胶检测DNA样品。
3、目的片段PCR扩增
PCR反应在ABI2720PCR仪(美国加州ABI公司)上进行,25μl反应体系包括:超纯水17.5μl,10×buffer2.5μl,引物(10μM)各1μl,TaqDNA聚合酶(1.25U/μl)0.5μl,dNTP(2.5mM)1μl,模板DNA1μl。
PCR反应条件为:94°C预变性4min;94°C变性30s,66°C(或64°C)退火30s,72°C延伸45s,30个循环;72°C延伸7min。
引物列表:
4、琼脂糖凝胶电泳检测
扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测,引物F2255-R3044和F2255-R3438的扩增产物分别约800bp和1200bp。
5、序列测定验证
目的片段PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司,ABI3730XL测序仪双向测序。
引物F2255/R3044扩增烟曲霉得到的序列为790bp:
CCAACAAGCGTGTTCGTTCAGTCCTCAGTCAAAAGGCACACACTTGGACGCATTGCGAGATTCACC
CCAGTATGATTCTTGGTGTTTGTGCCAGTATCATTCCCTTCCCGGACCACAACCAGTCGCCTCGTA
ATACCTACCAGTCTGCAATGGGCAAACAAGCCATGGGTGTGTTTTTGACCAACTTTGACCAACGAA
TGGAGACAATGGCAAATATTCTCTATTACCCGCAGAAACCGCTAGCCACAACACGGTCCATGGAAT
TCCTTCGATTCCGTGAACTACCAGCTGGGCAGAATGCCATCGTCGCCATTGCTTGCTACTCCGGAT
ACAACCAAGAAGATTCGGTCATCATGAACCAGAGCAGCATCGATCGTGGTCTCTTCCGAAGTCTCT
TCTATCGCACATACACGGATAGCGAGAAAATGGTTGGCCTGACTGTTGTCGAGCGGTTTGAGAAGC
CCATGCGCTCGGATACGATCGGTATGAGAAAGGGCACCTACGATAAGCTCGATGAGGACGGTATCA
TTGCCCCTGGTGTGCGTGTCTCCGGAGAGGATATTATCATCGGCAAGACCGCCCCGTTGGCACCCG
AGGCGGAGGAACTTGGCCAGCGAACCAAGGCACATACCAAGCTGGATGTGTCGACGCCATTAAGAA
GCACTGAAAATGGTATTGTGGATCAAGTCCTGGTCTCTACCAGCAATGATGACCTCAAGTTCGTCA
AGGTGCGCATGAGAACGACAAAGATTCCTCAGATCGGAGACAAATTTGCCTCTCGTCACGGACA
引物F2255/R3438扩增烟曲霉得到的序列为1184bp:
CCAACAAGCGTGTTCGTTCAGTCCTCAGTCAAAAGGCACACACTTGGACGCATTGCGAGATTCACC
CCAGTATGATTCTTGGTGTTTGTGCCAGTATCATTCCCTTCCCGGACCACAACCAGTCGCCTCGTA
ATACCTACCAGTCTGCAATGGGCAAACAAGCCATGGGTGTGTTTTTGACCAACTTTGACCAACGAA
TGGAGACAATGGCAAATATTCTCTATTACCCGCAGAAACCGCTAGCCACAACACGGTCCATGGAAT
TCCTTCGATTCCGTGAACTACCAGCTGGGCAGAATGCCATCGTCGCCATTGCTTGCTACTCCGGAT
ACAACCAAGAAGATTCGGTCATCATGAACCAGAGCAGCATCGATCGTGGTCTCTTCCGAAGTCTCT
TCTATCGCACATACACGGATAGCGAGAAAATGGTTGGCCTGACTGTTGTCGAGCGGTTTGAGAAGC
CCATGCGCTCGGATACGATCGGTATGAGAAAGGGCACCTACGATAAGCTCGATGAGGACGGTATCA
TTGCCCCTGGTGTGCGTGTCTCCGGAGAGGATATTATCATCGGCAAGACCGCCCCGTTGGCACCCG
AGGCGGAGGAACTTGGCCAGCGAACCAAGGCACATACCAAGCTGGATGTGTCGACGCCATTAAGAA
GCACTGAAAATGGTATTGTGGATCAAGTCCTGGTCTCTACCAGCAATGATGACCTCAAGTTCGTCA
AGGTGCGCATGAGAACGACAAAGATTCCTCAGATCGGAGACAAATTTGCCTCTCGTCACGGACAGA
AGGGTACCATTGGTATCACCTACCGGCAGGAAGACATGCCGTTTACACGCGAGGGTGTTTCCCCCG
ATCTTATCATCAACCCGCATGCTATTCCATCTCGTATGACAATTGCTCACTTGATCGAGTGTCAGC
TCAGTAAAGTGTCGGCATTACGTGGGTTCGAAGGTGATGCAACACCTTTTACTGATGTTACTGTCG
ACTCAATCTCTCGTCTGCTTCGGGAGCACGGGTACCAGTCTCGTGGCTTCGAAGTGATGTACAATG
GGCATACTGGACGCAAGCTGGTTGCGCAAGTGTTCTTGGGACCAACGTACTATCAGCGTCTGCGCC
ACATGGTCGACGACAAGATCCACGCCCGTGCCCGTGGACCGACACAGATTCTGACCCGGCAG
RNA聚合酶II第二大亚基(RNA polymerase II second largest subunit,RPB2)为单拷贝基因、进化速率慢,已与ITS、RPB1、EF-1α、β-tubulin等应用于真菌分类和系统发育研究。曲霉属真菌基因组同源性分析表明,RPB2基因存在保守区域和变异位点,设计的两对特异性引物F2255/R3044和F2255/R3438只能扩增出烟曲霉菌的RPB2基因片段,通过琼脂糖凝胶电泳检测可见单一的明亮条带且长度分别约为800bp和1200bp;否则,说明待测菌株为非烟曲霉菌。
Claims (2)
1.一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)提取待测烟曲霉菌株的总DNA;
(2)选取RPB2基因作为分子标记,即目的片段,设计特异性引物3条;
(3)待测烟曲霉菌株目的片段PCR扩增;
(4)琼脂糖凝胶电泳检测,根据电泳检测结果判断待测菌株是否为烟曲霉菌。
2.根据权利要求1所述的一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法,其特征在于设计特异性引物3条,分别为:
1)引物名称F2255,引物序列CCAACAAGCGTGTTCGTTCAG;
2)引物名称R3044,引物序列TGTCCGTGACGAGAGGCAAAT;
3)引物名称R3438,引物序列CTGCCGGGTCAGAATCTGT。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310078921.5A CN104046681A (zh) | 2013-03-13 | 2013-03-13 | 一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310078921.5A CN104046681A (zh) | 2013-03-13 | 2013-03-13 | 一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104046681A true CN104046681A (zh) | 2014-09-17 |
Family
ID=51500077
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201310078921.5A Pending CN104046681A (zh) | 2013-03-13 | 2013-03-13 | 一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104046681A (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104195262A (zh) * | 2014-09-24 | 2014-12-10 | 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 | 拟茎点霉rna聚合酶(rpb1)基因扩增引物及其设计方法和应用 |
CN105567680A (zh) * | 2015-12-02 | 2016-05-11 | 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 | 拟茎点霉rpb2基因扩增引物及其设计方法和应用 |
CN105886643A (zh) * | 2016-05-26 | 2016-08-24 | 长江大学 | 一种烟曲霉菌的pcr检测的引物及方法 |
CN117248055A (zh) * | 2023-09-12 | 2023-12-19 | 深圳市海微生物科技有限公司 | 曲霉菌的荧光定量pcr检测试剂盒及其应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102311994A (zh) * | 2011-04-19 | 2012-01-11 | 山东农业大学 | 烟曲霉荧光定量pcr检测方法 |
CN102321738A (zh) * | 2011-07-29 | 2012-01-18 | 广州呼吸疾病研究所 | 检测致病曲霉菌的荧光定量pcr通用引物、检测探针和试剂盒 |
WO2012023020A1 (en) * | 2010-08-19 | 2012-02-23 | Council Of Scientific & Industrial Research | Diagnostic assays for the detection and identification of aspergilli |
-
2013
- 2013-03-13 CN CN201310078921.5A patent/CN104046681A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012023020A1 (en) * | 2010-08-19 | 2012-02-23 | Council Of Scientific & Industrial Research | Diagnostic assays for the detection and identification of aspergilli |
CN102311994A (zh) * | 2011-04-19 | 2012-01-11 | 山东农业大学 | 烟曲霉荧光定量pcr检测方法 |
CN102321738A (zh) * | 2011-07-29 | 2012-01-18 | 广州呼吸疾病研究所 | 检测致病曲霉菌的荧光定量pcr通用引物、检测探针和试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
程云方: "《基于真菌基因组同源性分析的曲霉属特异性分子标记筛选》", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》, 15 January 2013 (2013-01-15) * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104195262A (zh) * | 2014-09-24 | 2014-12-10 | 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 | 拟茎点霉rna聚合酶(rpb1)基因扩增引物及其设计方法和应用 |
CN105567680A (zh) * | 2015-12-02 | 2016-05-11 | 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 | 拟茎点霉rpb2基因扩增引物及其设计方法和应用 |
CN105886643A (zh) * | 2016-05-26 | 2016-08-24 | 长江大学 | 一种烟曲霉菌的pcr检测的引物及方法 |
CN117248055A (zh) * | 2023-09-12 | 2023-12-19 | 深圳市海微生物科技有限公司 | 曲霉菌的荧光定量pcr检测试剂盒及其应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108707687B (zh) | 一种可以区分谷瘟病菌与稻瘟病菌的pcr检测鉴定方法 | |
CN104046681A (zh) | 一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法 | |
CN103243166B (zh) | 一种葡萄霜霉病菌的快速分子检测方法与应用 | |
CN104630369B (zh) | 水稻恶苗病菌的pcr检测方法 | |
Rabha et al. | Morphological and molecular diversity of endophytic Colletotrichum gloeosporioides from tea plant, Camellia sinensis (L.) O. Kuntze of Assam, India | |
CN102094080B (zh) | 一种同时检测三类镰刀菌毒素的快速分子检测方法与应用 | |
CN110241249A (zh) | 一种快速检测覆土中双孢蘑菇疣孢霉病病原菌的引物及方法 | |
CN104313177B (zh) | 一种快速鉴定灰葡萄孢菌对多菌灵抗性基因型f200y菌株的分子检测方法 | |
CN104046616A (zh) | 一种从阿胶中快速提取dna的试剂盒及其提取方法 | |
CN1284864C (zh) | 用于检测梨火疫病菌的一步双重pcr方法 | |
CN105886643A (zh) | 一种烟曲霉菌的pcr检测的引物及方法 | |
CN1715915A (zh) | 一种镰刀菌毒素的分子检测方法 | |
CN104195262A (zh) | 拟茎点霉rna聚合酶(rpb1)基因扩增引物及其设计方法和应用 | |
CN105063187B (zh) | 一种快速检测灰葡萄孢菌对sdhi类杀菌剂抗性的方法及引物组合物 | |
CN106811506A (zh) | 一种检测苹果轮纹病菌及其相对数量的方法 | |
CN105177138A (zh) | 一种用于检测橡胶树白粉菌的引物、方法及应用 | |
CN102533743B (zh) | 一种用于扩增凝结芽孢杆菌的特异性引物及其应用 | |
CN107723348A (zh) | 鉴定单增李斯特菌1/2c血清型的NASBA检测方法 | |
Gupta et al. | Comparative molecular analysis of Fusarium solani isolates by RFLP and RAPD | |
CN104328205A (zh) | 谷子白发病菌lamp快速检测方法的建立 | |
CN104498593A (zh) | 鉴定或辅助鉴定仓储豆象的引物对及其试剂盒 | |
KR20140048548A (ko) | 중합효소 연쇄반응에 의한 종 특이적 푸자리움 프롤리페라튬 검출을 위한 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 키트 | |
CN101760554A (zh) | 检测灰霉病菌群体对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂抗性频率的引物序列及方法 | |
CN104293971A (zh) | 一种基于lamp技术对多菌灵高抗灰葡萄孢菌株的快速检测方法 | |
CN112522428A (zh) | 一种快速检测金针菇培养料中阿氏节杆菌的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140917 |