CN105886643A - 一种烟曲霉菌的pcr检测的引物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种烟曲霉菌的PCR检测的引物，包括正向引物F2625，引物序列为CGATCGTGGTCTCTTCCGA和反向引物R3438，引物序列为CTGCCGGGTCAGAATCTGT，本发明还公开了一种烟曲霉菌的PCR检测方法，包括CTAB法提取样品真菌菌株的基因组DNA；利用上述引物，以所述基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，以便获得真菌菌株的基因组DNA的扩增产物；以及琼脂糖凝胶电泳检测所述基因组DNA的扩增产物，EB染色观察。本发明提供的检测方法能快速、准确、高效检测出待测物中的烟曲霉菌。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域。具体地，本发明涉及一种真菌的PCR检测及方法，更具体地，涉及一种烟曲霉菌的PCR检测的引物及方法。
背景技术
烟曲霉(Aspergillus fumigatus)是自然界中广泛存在的腐生真菌，也是重要的机会致病菌。随着免疫受损人群的增多，系统性曲霉病的90％是由烟曲霉引起的。同时，烟曲霉产生的毒素严重污染粮食与饲料制品，危害人和动物的健康，造成重大的经济损失，烟曲霉已成为临床医学和医学微生物家们关注的热点。
烟曲霉的检测技术经历了传统培养鉴别、层析法及色谱法等化学方法检测、免疫学检测、分子生物学检测等。随着PCR和DNA测序技术的发展，多基因座序列分析得到广泛承认。目前应用于曲霉的遗传标记主要有rDNA ITS1-5.8S-ITRS2，calmodulin gene(CaM)和beta-tubulin gene(benA)。
然而，目前对于烟曲霉的检测技术的研究仍有待改进。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本发明 的一个目的在于提供了一种能够有效检测出烟曲霉菌的PCR检测的引物和方法，具有快速、准确、高效等特点。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
根据本发明的一个方面，本发明提出了一种烟曲霉菌的PCR检测的引物，所述引物为：正向引物F2625，引物序列为CGATCGTGGTCTCTTCCGA；反向引物R3438，引物序列为CTGCCGGGTCAGAATCTGT。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种烟曲霉菌的PCR检测方法，包括以下步骤：
CTAB法提取样品真菌菌株的基因组DNA；以及
利用权利要求1所述的引物，以所述基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，以便获得真菌菌株的基因组DNA的扩增产物；以及
琼脂糖凝胶电泳检测所述基因组DNA的扩增产物，EB染色观察。
进一步地，所述PCR扩增的退火温度为50摄氏度至55摄氏度。
进一步地，所述基因组DNA的扩增产物的长度为814bp。
本发明与现有的技术相比具有如下有益效果：
本发明提供的引物和检测方法包括烟曲霉在内的20个分类单元34个菌株，结果表明，只有烟曲霉扩增出814bp的单一扩增产物，表现为阳性，其他18个供试的曲霉种未能得到扩增产物，均表现为阴性。说明本发明的引物和方法具有良好的特异性。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从 下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为根据本发明的一个实施例的真菌通用引物ITS1/ITS4扩增7种曲霉的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。
图2为根据本发明的一个实施例的引物F2625/R3438扩增7种曲霉的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。
图3为根据本发明的一个实施例的引物F2625/R3438扩增34个曲霉的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
1、设计特异性扩增烟曲霉的引物对
通过比较曲霉属真菌RPB2基因序列，设计特异性引物10个见表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表1基于RPB2基因设计的引物编号、序列及参数
2、待测曲霉菌株的收集或分离及培养
待测曲霉菌样品来源于中国科学院微生物研究所真菌学国家实验室、北京大学真菌和真菌病研究中心及分离物(见表2)，接种至PDA培养基上，置培养箱28℃培养。
表2.供试34个曲霉菌株或分离物的编号及其来源
3、DNA模板制备
挑取直径5mm的待测曲霉菌株菌丝块接种至100ml PD液体培养基中，室温下摇床培养(250rpm)2―4周，收集菌体并用无菌生理盐水冲洗数次，灭菌滤纸吸干。取0.1g菌体在液氮中迅速研磨成粉末，用2％(w/v)CTAB缓冲液抽提菌丝DNA，0.8％琼脂糖凝胶检测DNA样品浓度，置-20℃备用。
4、特异性PCR检测方法的建立
PCR检测20μl反应体系包括：超纯水10μl，2×EcoTaq PCR Super Mix(+dye)8μl(TaqDNA聚合酶0.05U/μl，4mM MgCl2，0.4mM dNTP，Beijing TransGen Biotech.，北京)，引物F2625和R3438(10μM)各0.5μl，模板DNA 1μl。
PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，50℃(或55℃)退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸7min。PCR反应在PTC-150Thermocycler(MJ Research，Masachusetts，USA)进行。
5、结果判定
发明人选取供试34个曲霉菌株中提取的7种曲霉的DNA样品，进 行了PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测，目的是检验7种曲霉的DNA样品质量。如图1所示，图1为真菌通用引物ITS1/ITS4扩增7种曲霉的PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果。图中1至9点样孔依次是DNA Marker、烟曲霉、棒曲霉、米曲霉、黄曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、费希新萨托菌、以双蒸水为空白模板对照。
图2为特异引物F2625/R3438扩增7种曲霉的PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果。图中1至9点样孔依次是DNA Marker、烟曲霉、棒曲霉、米曲霉、黄曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、费希新萨托菌、以双蒸水为空白模板对照。验证了本发明的引物具有良好的鉴别作用，仅烟曲霉能扩增出预计的产物。
供试的34个曲霉菌株隶属20种，经引物F2625和R3438扩增、2％琼脂糖凝胶电泳检测，仅A.fumigatus和A.neoellipticus的11个菌株分别扩增出约800bp大小的单一产物外,其它18种23个供试菌株未能得到扩增产物。结果同时暗示,不支持A.fumigatus和A.neoellipticus在种水平上的差异。
图3中1至25点样孔依次是1.DNA Marker，2.14346Aspergillus awamori，3.13907A.clavatus，4.14339A.creber，5.3.14527A.flavus，6-14.A.fumigatus 2810、9793、13945、14019、14023、14029、14327、NRRL163T、NRRL6113，15.CYH1A.lentulus，16-17.A.neollipticus NRRL5109T、9732，18-19.A.niger 13527、14348，20-21.A.paraciticus 3.13640，14039，22.13912A.sydowii，23.14347A.tubingensis，24.13899A.ustus，25.13902Emericella nidulans
6、序列测定验证
纯化F2625和R3438扩增产物片段送生工生物工程(上海)股份有限公司，ABI 3730XL测序仪双向测序，序列结果与NCBI公布的烟曲霉RPB2基因序列完全一致。
引物F2625/R3438扩增烟曲霉得到的序列为814bp：
CGATCGTGGTCTCTTCCGAAGTCTCTTCTATCGCACATACACGGATAGCGAGAAAATGGTTGGCCTGACTGTTGTCGAGCGGTTTGAGAAGCCCATGCGCTCGGATACGATCGGTATGAGAAAGGGCACCTACGATAAGCTCGATGAGGACGGTATCATTGCCCCTGGTGTGCGTGTCTCCGGAGAGGATATTATCATCGGCAAGACCGCCCCGTTGGCACCCGAGGCGGAGGAACTTGGCCAGCGAACCAAGGCACATACCAAGCTGGATGTGTCGACGCCATTAAGAAGCACTGAAAATGGTATTGTGGATCAAGTCCTGGTCTCTACCAGCAATGATGACCTCAAGTTCGTCAAGGTGCGCATGAGAACGACAAAGATTCCTCAGATCGGAGACAAATTTGCCTCTCGTCACGGACAGAAGGGTACCATTGGTATCACCTACCGGCAGGAAGACATGCCGTTTACACGCGAGGGTGTTTCCCCCGATCTTATCATCAACCCGCATGCTATTCCATCTCGTATGACAATTGCTCACTTGATCGAGTGTCAGCTCAGTAAAGTGTCGGCATTACGTGGGTTCGAAGGTGATGCAACACCTTTTACTGATGTTACTGTCGACTCAATCTCTCGTCTGCTTCGGGAGCACGGGTACCAGTCTCGTGGCTTCGAAGTGATGTACAATGGGCATACTGGACGCAAGCTGGTTGCGCAAGTGTTCTTGGGACCAACGTACTA
TCAGCGTCTGCGCCACATGGTCGACGACAAGATCCACGCCCGTGCCCGTGGACCGACACAGATTCTGACCCGGCAG
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
<110> 长江大学
<120> 一种烟曲霉菌的PCR检测的引物及方法
<130> 20160526
<160> 3
<170> PatentIn
version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 引物
<400> 1
cgatcgtggt ctcttccga
19
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<211> 19
<212> DNA
<213> 引物
<400> 2
ctgccgggtc agaatctgt
19
<210> 3
<211> 814
<212> DNA
<213>Aspergillus fumigatus
<400> 3
cgatcgtggt ctcttccgaa gtctcttcta
tcgcacatac acggatagcg agaaaatggt 60
tggcctgact gttgtcgagc ggtttgagaa
gcccatgcgc tcggatacga tcggtatgag 120
aaagggcacc tacgataagc tcgatgagga
cggtatcatt gcccctggtg tgcgtgtctc 180
cggagaggat attatcatcg gcaagaccgc
cccgttggca cccgaggcgg aggaacttgg 240
ccagcgaacc aaggcacata ccaagctgga
tgtgtcgacg ccattaagaa gcactgaaaa 300
tggtattgtg gatcaagtcc tggtctctac
cagcaatgat gacctcaagt tcgtcaaggt 360
gcgcatgaga acgacaaaga ttcctcagat
cggagacaaa tttgcctctc gtcacggaca 420
gaagggtacc attggtatca cctaccggca
ggaagacatg ccgtttacac gcgagggtgt 480
ttcccccgat cttatcatca acccgcatgc
tattccatct cgtatgacaa ttgctcactt 540
gatcgagtgt cagctcagta aagtgtcggc
attacgtggg ttcgaaggtg atgcaacacc 600
ttttactgat gttactgtcg actcaatctc
tcgtctgctt cgggagcacg ggtaccagtc 660
tcgtggcttc gaagtgatgt acaatgggca
tactggacgc aagctggttg cgcaagtgtt 720
cttgggacca acgtactatc agcgtctgcg
ccacatggtc gacgacaaga tccacgcccg 780
tgcccgtgga ccgacacaga ttctgacccg
gcag 814
Claims (4)
1.一种烟曲霉菌的PCR检测的引物，其特征在于，所述引物为：
正向引物F2625，引物序列为CGATCGTGGTCTCTTCCGA；
反向引物R3438，引物序列为CTGCCGGGTCAGAATCTGT。
2.一种烟曲霉菌的PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
CTAB法提取样品真菌菌株的基因组DNA；以及
利用权利要求1所述的引物，以所述基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，以便获得真菌菌株的基因组DNA的扩增产物；以及
琼脂糖凝胶电泳检测所述基因组DNA的扩增产物，EB染色观察。
3.根据权利要求2所述的PCR检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的退火温度为50摄氏度至55摄氏度。
4.根据权利要求2所述的PCR检测方法，其特征在于，所述基因组DNA的扩增产物的长度为814bp。
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