CN107447017A - 三种产毒真菌的快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了三种产毒真菌的开苏检测方法，首先优化改进真菌DNA提取效果，再通过设计黄曲霉、烟曲霉、镰刀菌的特异性引物，并建立三种菌的三重PCR检测体系，优化得到较为理想的检测效果，能够在混合菌株中同时检测出黄曲霉、烟曲霉、镰刀菌的存在，黄曲霉最低检测限为0.60×10‑5 μg/μL、烟曲霉最低检测限为2.08×10‑5 μg/μL、镰刀菌最低检测限为1.10×10‑5 μg/μL，特异性较为良好，具有一定的实用性，整个操作耗时不足5小时，与传统培养相比，节约时间至少72小时。
Description
技术领域
本发明涉及三种常见产毒真菌的快速检测，尤其一种体系，可以同时检测三种产毒真菌。
背景技术
黄曲霉、烟曲霉和镰刀菌分布广泛，是一类常见的具有高度传染性和危害严重的产毒真菌。黄曲霉是温暖地区常见的占优势的霉菌，适宜黄曲霉生长的环境要求不高，在花生、大米、玉米、小麦、豆类、乳制品及水产品中均有检出，以花生、玉米等污染最严重，在我国江苏、上海、广西等省的花生污染率高达58%，玉米污染率高达60%[1]。烟曲霉在自然环境中普遍存在，是一种丝状腐生真菌，也是一种条件致病性真菌，主要存在于霉变的谷物中，如发霉的玉米和小麦，以及动植物尸体或腐烂组织中。烟曲霉的分生孢子直径只有2~3 μm，表面高度疏水，能长时间漂浮在空气中[2]。镰刀菌引起的赤霉病是危害多种粮食作物的一种重要病害，广泛分布于世界温暖潮湿地区。赤霉病不仅造成产量损失，而且产生的真菌毒素严重威胁人畜健康。镰刀菌产生的真菌毒素主要是伏马毒素（fumonisin），以污染玉米为主，毒性主要表现为神经毒性、肺毒性、致癌性、胚胎毒性和植物毒性[3]。伏马毒素具有癌启动因子，对动物的肝脏和肾脏有毒性作用，人类食管癌高发区受镰刀菌污染严重，伏马毒素主要污染玉米及其制品，偶尔在高粱、大米和豌豆中检出[4]。
然而目前常规的检测方法通常以真菌分离纯化和镜检的方式进行，周期长(一般需要5~7 d)，灵敏度低以及操作繁琐，因此迫切需要更为快速准确的检测方法。多重PCR(multiplex PCR)检测是植根于普通PCR技术的一种特殊方法，可在单一泳道反应体系中同时检测多个DNA模板或同一模板的不同区域，具有快捷、高效、低成本等诸多优点，已广泛用于病原微生物检测[5,6]。国内尚未有利用多重PCR方法检测被产黄曲霉毒素真菌、烟曲霉和镰刀菌污染的食物或饲料的报道。
本研究以黄曲霉毒素生化合成途径中己知关键酶的编码基因omt-1和烟曲霉的RPB2[7]基因为目的基因分别设计引物，还使用了镰刀菌属特异性引物IstF/IstR[8]，同时应用单管反应体系中特异性和灵敏性的检验分析方法，在常规PCR的基础上建立多重PCR检测体系，同时简化和优化了从样品上快速提取真菌DNA的方法，为快速准确检测饲料或食品中潜在产毒黄曲霉、镰刀菌和烟曲霉污染提供科学依据和技术支持。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术不足，提供一种能同时快速准确检测黄曲霉、烟曲霉和镰刀菌三种产毒真菌的方法。
a、从15份霉变玉米中挑出4份霉变情况较严重的，分别称取40g霉变的玉米，与80mL无菌水于500mL的锥形瓶中，每份做2个平行，然后将装有样品的锥形瓶放入超声波振荡器中震荡0.5h，简称超声法前处理。
b、参照（Raeder U, Broda P. Rapid preparation of DNA from filamentousfungi[J]. Letters in Applied Microbiology, 1985, 1(1): 17-20.）的方法，并做适当改进，经过a处理后的玉米样品的菌体，取0.3 mg菌体于研钵中，液氮研磨至粉末状时，加入5 mL DNA提取缓冲液（200 mmol/L Tris-HCL（pH7.5），10mmol/L Na2EDTA，500mmol/LNaCL，1% SDS），继续研磨；待混合物变为液体后分装入15 mL离心管，并添加等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液（体积比25：24：1），剧烈震荡3-6 min；4℃ 下2300 r/min离心10 min，收集上清液转移到新15 mL离心管中，加等体积的氯仿-异戊醇(体积比24：1)混匀后再次2300r/min离心10 min；上清液转移至1.5 mL离心管中，添加1/10体积3 mol/L NaAc、2.5倍体积预冷的无水乙醇，颠倒混匀后置于-20℃ 下冷冻1 h；然后在4℃ 下12000 r/min离心10min，收集沉淀用75％乙醇洗涤，干燥沉淀30 min，然后加水或TE溶解DNA。最后置于-20℃下保存备用。此过程简称为改进后液氮研磨提取法。
c、根据黄曲霉AF05的产毒基因omt基因、AfIR基因，烟曲霉02的RPB2基因和烟曲霉特异性基因YA[9]基因，镰刀菌属IST基因[8]、串珠镰刀菌的腐马素生物合成所必须的聚酮化合物合成酶FUM1基因及丝氨酸-十六酞基转移酶基因FUM8基因[10]，利用DNAMAN设计各种菌特异性PCR引物，如下：
黄曲霉A05 omt omt-F GTGGACGGACCTAGTCCGACATCAC
omt-R GTCGGCGCCACGCACTGGGTTGGGG
AfIR afIR-F TATCTCCCCCCGGGCATCTCCCGG
afIR-R CCGTCAGACAGCCACTGGACACGG
烟曲霉02 RPB2.2 RPB2.2-F CTGCCGGGTCAGAATCTGT
RPB2.2-R CCAACAAGCGTGTTCGTTCAG
YA YA-F CCAATGCCCTTCGGGGCTCCT
YA-R CCTGGTTCCCCCCACAG
镰刀菌 Ist IstF AACTCCCAAACCCCTGTGAACATA
IstR TTTAACGGCGTGGCCGC
FUM1 rp32*-F ACAAGTGTCCTTGGGGTCCAGG
rp32*-R GATGCTCTTGGAAGTGGCCTACG
FUM8 rp679*-F CGTAGTAGGAATGAGAAGGATG
rp679*-R GCAAGCTTTGTGGCTGATTGTC
d、得到的体系为50 μL体系：0.5-0.6 μL黄曲霉A05DNA模板＋0.4-0.6 μL烟曲霉DNA模板＋0.6-0.7 μL串珠镰刀菌DNA模板，20.67-2×0.8 μL omt-F/omt-R（10μM/L），2×0.47-2×0.6 μL RPB2.2-F/ RPB2.2-R（10μM/L），2×0.87-2×1.0 μ LIstF/ IstR（10μM/L），10×TransStart™ Taq Buffer 5 μL，dNTPs（2.5mM/L）4 μL，TransStart™ Taq DNAPloymerase 0.5 μL，ddH2O加至50 μL。
e、最优程序为：94℃ 预变性3.5-4.5 min，30个循环（94 ℃ 变性30 s；53.9-55℃退火30 s；72 ℃ 延伸1 min），72℃ 终延伸9-10 min。
本发明，首先优化改进真菌DNA提取效果，再通过设计黄曲霉、烟曲霉、镰刀菌的特异性引物，并建立三种菌的三重PCR检测体系，优化得到较为理想的检测效果，能够在混合菌株中同时检测出黄曲霉、烟曲霉、镰刀菌的存在，黄曲霉最低检测限为0.60×10-5 μg/μL、烟曲霉最低检测限为2.08×10-5 μg/μL、镰刀菌最低检测限为1.10×10-5 μg/μL，特异性较为良好，具有一定的实用性，整个操作耗时不足5小时，与传统培养相比，节约时间至少72小时。
具体实施方式
得到的优体系为50 μL体系：0.5 -0.6μL黄曲霉A05＋0.4 -0.6μL烟曲霉＋0.6 -0.7μL串珠镰刀菌，2×0.67-2×0.8 μL omt-F/omt-R（10μM/L），2×0.47 -2×0.6μLRPB2.2-F/ RPB2.2-R（10μM/L），2×0.87 -2×1.0μ LIstF/ IstR（10μM/L），10×TransStart™ Taq Buffer 5 μL，dNTPs（2.5mM/L）4 μL，TransStart™ Taq DNAPloymerase 0.5 μL，ddH2O加至50 μL。程序为：94℃预变性3.5-4.5min，30个循环（94 ℃变性30 s；53.9 -55 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min），72℃终延伸9-10 min。该检测体系黄曲霉最低检测限为0.60×10-5 μg/μL、烟曲霉最低检测限为2.08×10-5 μg/μL、镰刀菌最低检测限为1.10×10-5 μg/μL，特异性较为良好，检测结果稳定，整个检测时间不足5 h，具有一定的实用性。
实施例1
a、从15份霉变玉米中挑出4份霉变情况较严重的，分别称取40g霉变的玉米，与80mL无菌水于500mL的锥形瓶中，每份做2个平行，然后将装有样品的锥形瓶放入超声波振荡器中震荡0.5h，简称超声法前处理。
b、参照（Raeder U, Broda P. Rapid preparation of DNA from filamentousfungi[J]. Letters in Applied Microbiology, 1985, 1(1): 17-20.）的方法，并做适当改进，经过a处理后的玉米样品的菌体，取0.3 mg菌体于研钵中，液氮研磨至粉末状时，加入5 mL DNA提取缓冲液（200 mmol/L Tris-HCL（pH7.5），10mmol/L Na2EDTA，500mmol/LNaCL，1% SDS），继续研磨；待混合物变为液体后分装入15 mL离心管，并添加等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液（体积比25：24：1），剧烈震荡3-6 min；4℃ 下2300 r/min离心10 min，收集上清液转移到新15 mL离心管中，加等体积的氯仿-异戊醇(体积比24：1)混匀后再次2300r/min离心10 min；上清液转移至1.5 mL离心管中，添加1/10体积3 mol/L NaAc、2.5倍体积预冷的无水乙醇，颠倒混匀后置于-20℃ 下冷冻1 h；然后在4℃ 下12000 r/min离心10min，收集沉淀用75％乙醇洗涤，干燥沉淀30 min，然后加水或TE溶解DNA。最后置于-20℃下保存备用。此过程简称为改进后液氮研磨提取法。
c、根据黄曲霉AF05的产毒基因omt基因、AfIR基因，烟曲霉02的RPB2基因和烟曲霉特异性基因YA[9]基因，镰刀菌属IST基因[8]、串珠镰刀菌的腐马素生物合成所必须的聚酮化合物合成酶FUM1基因及丝氨酸-十六酞基转移酶基因FUM8基因[10]，利用DNAMAN设计各种菌特异性PCR引物，如下：
黄曲霉A05 omt omt-F GTGGACGGACCTAGTCCGACATCAC
omt-R GTCGGCGCCACGCACTGGGTTGGGG
AfIR afIR-F TATCTCCCCCCGGGCATCTCCCGG
afIR-R CCGTCAGACAGCCACTGGACACGG
烟曲霉02 RPB2.2 RPB2.2-F CTGCCGGGTCAGAATCTGT
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YA-R CCTGGTTCCCCCCACAG
镰刀菌 Ist IstF AACTCCCAAACCCCTGTGAACATA
IstR TTTAACGGCGTGGCCGC
FUM1 rp32*-F ACAAGTGTCCTTGGGGTCCAGG
rp32*-R GATGCTCTTGGAAGTGGCCTACG
FUM8 rp679*-F CGTAGTAGGAATGAGAAGGATG
rp679*-R GCAAGCTTTGTGGCTGATTGTC
d、检测体系为50 μL体系：0.5 μL黄曲霉A05DNA模板＋0.4 μL烟曲霉DNA模板＋0.6 μL串珠镰刀菌DNA模板，2×0.67 μL omt-F/omt-R（10μM/L），2×0.47 μL RPB2.2-F/ RPB2.2-R（10μM/L），2×0.87 μ LIstF/ IstR（10μM/L），10×TransStart™ Taq Buffer 5 μL，dNTPs（2.5mM/L）4 μL，TransStart™ Taq DNA Ploymerase 0.5 μL，ddH2O加至50 μL。
e、程序为：94℃ 预变性4 min，30个循环（94 ℃ 变性30 s；53.9 ℃ 退火30 s；72℃ 延伸1 min），72℃ 终延伸10 min。
实施例2
a、从10份霉变花生中挑出4份霉变情况较严重的，分别称取40g霉变的花生，与80mL无菌水于500mL的锥形瓶中，每份做2个平行，然后将装有样品的锥形瓶放入超声波振荡器中震荡0.5h，简称超声法前处理。
b、参照（Raeder U, Broda P. Rapid preparation of DNA from filamentousfungi[J]. Letters in Applied Microbiology, 1985, 1(1): 17-20.）的方法，并做适当改进，经过a处理后的玉米样品的菌体，取0.3 mg菌体于研钵中，液氮研磨至粉末状时，加入5 mL DNA提取缓冲液（200 mmol/L Tris-HCL（pH7.5），10mmol/L Na2EDTA，500mmol/LNaCL，1% SDS），继续研磨；待混合物变为液体后分装入15 mL离心管，并添加等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液（体积比25：24：1），剧烈震荡3-6 min；4℃ 下2300 r/min离心10 min，收集上清液转移到新15 mL离心管中，加等体积的氯仿-异戊醇(体积比24：1)混匀后再次2300r/min离心10 min；上清液转移至1.5 mL离心管中，添加1/10体积3 mol/L NaAc、2.5倍体积预冷的无水乙醇，颠倒混匀后置于-20℃ 下冷冻1 h；然后在4℃ 下12000 r/min离心10min，收集沉淀用75％乙醇洗涤，干燥沉淀30 min，然后加水或TE溶解DNA。最后置于-20℃下保存备用。此过程简称为改进后液氮研磨提取法。
c、根据黄曲霉AF05的产毒基因omt基因、AfIR基因，烟曲霉02的RPB2基因和烟曲霉特异性基因YA[9]基因，镰刀菌属IST基因[8]、串珠镰刀菌的腐马素生物合成所必须的聚酮化合物合成酶FUM1基因及丝氨酸-十六酞基转移酶基因FUM8基因[10]，利用DNAMAN设计各种菌特异性PCR引物，如下：
黄曲霉A05 omt omt-F GTGGACGGACCTAGTCCGACATCAC
omt-R GTCGGCGCCACGCACTGGGTTGGGG
AfIR afIR-F TATCTCCCCCCGGGCATCTCCCGG
afIR-R CCGTCAGACAGCCACTGGACACGG
烟曲霉02 RPB2.2 RPB2.2-F CTGCCGGGTCAGAATCTGT
RPB2.2-R CCAACAAGCGTGTTCGTTCAG
YA YA-F CCAATGCCCTTCGGGGCTCCT
YA-R CCTGGTTCCCCCCACAG
镰刀菌 Ist IstF AACTCCCAAACCCCTGTGAACATA
IstR TTTAACGGCGTGGCCGC
FUM1 rp32*-F ACAAGTGTCCTTGGGGTCCAGG
rp32*-R GATGCTCTTGGAAGTGGCCTACG
FUM8 rp679*-F CGTAGTAGGAATGAGAAGGATG
rp679*-R GCAAGCTTTGTGGCTGATTGTC
d、检测体系为50 μL体系：0.6 μL黄曲霉A05DNA模板＋0.55 μL烟曲霉DNA模板＋0.65μL串珠镰刀菌DNA模板，2×0.8 μL omt-F/omt-R（10μM/L），2×0.5μL RPB2.2-F/ RPB2.2-R（10μM/L），2×0.9 μ LIstF/ IstR（10μM/L），10×TransStart™ Taq Buffer 5 μL，dNTPs（2.5mM/L）4 μL，TransStart™ Taq DNA Ploymerase 0.5 μL，ddH2O加至50 μL。
e、程序为：94℃ 预变性4.5min，30个循环（94 ℃ 变性30 s；55℃ 退火30 s；72℃ 延伸1 min），72℃ 终延伸10 min。
实施例3
a、从10份霉变小麦中挑出4份霉变情况较严重的，分别称取40g霉变的花生，与80mL无菌水于500mL的锥形瓶中，每份做2个平行，然后将装有样品的锥形瓶放入超声波振荡器中震荡0.5h，简称超声法前处理。
b、参照（Raeder U, Broda P. Rapid preparation of DNA from filamentousfungi[J]. Letters in Applied Microbiology, 1985, 1(1): 17-20.）的方法，并做适当改进，经过a处理后的玉米样品的菌体，取0.3 mg菌体于研钵中，液氮研磨至粉末状时，加入5 mL DNA提取缓冲液（200 mmol/L Tris-HCL（pH7.5），10mmol/L Na2EDTA，500mmol/LNaCL，1% SDS），继续研磨；待混合物变为液体后分装入15 mL离心管，并添加等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液（体积比25：24：1），剧烈震荡3-6 min；4℃ 下2300 r/min离心10 min，收集上清液转移到新15 mL离心管中，加等体积的氯仿-异戊醇(体积比24：1)混匀后再次2300r/min离心10 min；上清液转移至1.5 mL离心管中，添加1/10体积3 mol/L NaAc、2.5倍体积预冷的无水乙醇，颠倒混匀后置于-20℃ 下冷冻1 h；然后在4℃ 下12000 r/min离心10min，收集沉淀用75％乙醇洗涤，干燥沉淀30 min，然后加水或TE溶解DNA。最后置于-20℃下保存备用。此过程简称为改进后液氮研磨提取法。
c、根据黄曲霉AF05的产毒基因omt基因、AfIR基因，烟曲霉02的RPB2基因和烟曲霉特异性基因YA[9]基因，镰刀菌属IST基因[8]、串珠镰刀菌的腐马素生物合成所必须的聚酮化合物合成酶FUM1基因及丝氨酸-十六酞基转移酶基因FUM8基因[10]，利用DNAMAN设计各种菌特异性PCR引物，如下：
黄曲霉A05 omt omt-F GTGGACGGACCTAGTCCGACATCAC
omt-R GTCGGCGCCACGCACTGGGTTGGGG
AfIR afIR-F TATCTCCCCCCGGGCATCTCCCGG
afIR-R CCGTCAGACAGCCACTGGACACGG
烟曲霉02 RPB2.2 RPB2.2-F CTGCCGGGTCAGAATCTGT
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YA YA-F CCAATGCCCTTCGGGGCTCCT
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镰刀菌 Ist IstF AACTCCCAAACCCCTGTGAACATA
IstR TTTAACGGCGTGGCCGC
FUM1 rp32*-F ACAAGTGTCCTTGGGGTCCAGG
rp32*-R GATGCTCTTGGAAGTGGCCTACG
FUM8 rp679*-F CGTAGTAGGAATGAGAAGGATG
rp679*-R GCAAGCTTTGTGGCTGATTGTC
d、检测体系为50 μL体系：0.5μL黄曲霉A05DNA模板＋0.44 μL烟曲霉DNA模板＋0.5μL串珠镰刀菌DNA模板，2×0.7μL omt-F/omt-R（10μM/L），2×0.53μL RPB2.2-F/ RPB2.2-R（10μM/L），2×0.94 μ LIstF/ IstR（10μM/L），10×TransStart™ Taq Buffer 5 μL，dNTPs（2.5mM/L）4 μL，TransStart™ Taq DNA Ploymerase 0.5 μL，ddH2O加至50 μL。
e、程序为：94℃ 预变性3.5 min，30个循环（94 ℃ 变性30 s；54℃ 退火30 s；72℃ 延伸1 min），72℃ 终延伸9.5 min。
通过设计黄曲霉、烟曲霉、镰刀菌的特异性引物，并建立三种菌的三重PCR检测体系，优化得到较为理想的检测效果，能够在混合菌株中同时检测出黄曲霉、烟曲霉、镰刀菌的存在，黄曲霉最低检测限为0.60×10-5 μg/μL、烟曲霉最低检测限为2.08×10-5 μg/μL、镰刀菌最低检测限为1.10×10-5 μg/μL，特异性较为良好，具有一定的实用性，整个操作耗时不足5小时，与传统培养相比，节约时间至少72小时。
Claims (2)
1.三种产毒真菌的快速检测方法，其特征在于通过设计黄曲霉、烟曲霉、镰刀菌的特异性引物，建立三种产毒真菌的三重PCR快速检测体系；得到的优体系为50 μL体系：0.5 -0.6μL黄曲霉A05＋0.4 -0.6μL烟曲霉＋0.6 -0.7μL串珠镰刀菌，2×0.67-2×0.8 μL omt-F/omt-R（10μM/L），2×0.47 -2×0.6μL RPB2.2-F/ RPB2.2-R（10μM/L），2×0.87 -2×1.0μLIstF/ IstR（10μM/L），10×TransStart™ Taq Buffer 5 μL，dNTPs（2.5mM/L）4 μL，TransStart™ Taq DNA Ploymerase 0.5 μL，ddH2O加至50 μL；程序为：94℃预变性3.5-4.5min，30个循环（94 ℃变性30 s；53.9 -55 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min），72℃终延伸9-10 min；该检测体系黄曲霉最低检测限为0.60×10-5 μg/μL、烟曲霉最低检测限为2.08×10-5 μg/μL、镰刀菌最低检测限为1.10×10-5 μg/μL，特异性较为良好，检测结果稳定，整个检测时间不足5 h，具有一定的实用性。
2.根据权利要求1所述的三种产毒真菌的快速检测方法，其特征在于，其制法包括以下步骤：a、超声处理样品法；b、改进后液氮研磨提取法；c、根据黄曲霉AF05的产毒基因omt基因、AfIR基因，烟曲霉02的RPB2基因和烟曲霉特异性基因YA基因，镰刀菌属IST基因、串珠镰刀菌的腐马素生物合成所必须的聚酮化合物合成酶FUM1基因及丝氨酸-十六酞基转移酶基因FUM8基因，利用DNAMAN设计各种菌特异性PCR引物，如下：
黄曲霉A05 omt omt-F GTGGACGGACCTAGTCCGACATCAC
omt-R GTCGGCGCCACGCACTGGGTTGGGG
AfIR afIR-F TATCTCCCCCCGGGCATCTCCCGG
afIR-R CCGTCAGACAGCCACTGGACACGG
烟曲霉02 RPB2.2 RPB2.2-F CTGCCGGGTCAGAATCTGT
RPB2.2-R CCAACAAGCGTGTTCGTTCAG
YA YA-F CCAATGCCCTTCGGGGCTCCT
YA-R CCTGGTTCCCCCCACAG
镰刀菌 Ist IstF AACTCCCAAACCCCTGTGAACATA
IstR TTTAACGGCGTGGCCGC
FUM1 rp32*-F ACAAGTGTCCTTGGGGTCCAGG
rp32*-R GATGCTCTTGGAAGTGGCCTACG
FUM8 rp679*-F CGTAGTAGGAATGAGAAGGATG
rp679*-R GCAAGCTTTGTGGCTGATTGTC
d、得到的体系为50 μL体系： 0.5 -0.6μL黄曲霉A05＋0.4 -0.6μL烟曲霉＋0.6 -0.7μL串珠镰刀菌，2×0.67-2×0.8 μL omt-F/omt-R（10μM/L），2×0.47 -2×0.6μLRPB2.2-F/RPB2.2-R（10μM/L），2×0.87 -2×1.0μ LIstF/ IstR（10μM/L），10×TransStart™ TaqBuffer 5 μL，dNTPs（2.5mM/L）4 μL，TransStart™ Taq DNA Ploymerase 0.5 μL，ddH2O加至50 μL；e、程序为：94℃预变性3.5-4.5min，30个循环（94 ℃变性30 s；53.9 -55 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min），72℃终延伸9-10 min。
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