CN102094080A

CN102094080A - 一种同时检测三类镰刀菌毒素的快速分子检测方法与应用

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Publication number: CN102094080A
Application number: CN2009102502389A
Authority: CN
Inventors: 张昊; 冯洁; 徐进; 许景升; 潘哲超; 张力勍; 田茜
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2009-12-09
Filing date: 2009-12-09
Publication date: 2011-06-15
Anticipated expiration: 2029-12-09
Also published as: CN102094080B

Abstract

本发明专用于检测三类最常见的镰刀菌毒素，属于植物检疫技术领域，具体的说涉及一种镰刀菌毒素的分子检测技术领域。该方法根据镰刀菌基因组内与毒素合成密切相关的Tri11基因，自行设计一组复合引物，从中国和国外采集得到的镰刀菌中检测分离得到镰刀菌毒素NIV、15ADON和3ADON的特异片段，该片段全长分别为643bp、424bp和342bp。本发明仅仅采用一组特异性引物，进行一次PCR扩增反应，利用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，直接根据产物片断的长度，即可检测出禾谷镰刀菌产生的三种B型毒素的类型，本发明可应用于谷物、饲料和食品安全中毒素DON和NIV污染的检测。

Description

一种同时检测三类镰刀菌毒素的快速分子检测方法与应用

(一)技术领域

本发明“一种同时检测三类镰刀菌毒素的快速分子检测方法与应用”，专用于检测三种类镰刀菌毒素，属于植物检疫技术领域，与分子检测技术有关。

(二)背景技术

由镰刀菌引起的赤霉病(Fusarium head blight or scab)是危害小麦、大麦、燕麦、玉米、水稻、黑麦等多种禾谷类作物的一种重要病害，广泛分布于世界温暖潮湿地区。19世纪90年代，北美、欧洲、亚洲等地大麦、小麦赤霉病暴发成灾；近些年来，我国小麦赤霉病也越来越严重，几乎蔓延到全国所有的小麦种植区，造成严重的产量损失和品质的大幅下降。除此之外，更为重要的是镰刀菌产生的毒素能够使人畜中毒，严重威胁人畜健康，造成食品安全上的重大隐患。欧美许多国家的啤酒和饲料加工企业明确提出所收购的大麦容忍零毒素，我国也明确规定收购的大、小麦赤霉病粒率不得超过4％。

镰刀菌可以产生单端孢霉烯族毒素(trichothecene)，他可以抑制真核细胞蛋白质的合成，破坏人畜的免疫系统，使中毒者出现腹泻、呕吐和头晕等症状，而赤霉病麦中毒是我国最主要的真菌毒素导致的食物中毒之一。在我国，禾谷镰刀菌是赤霉病的主要病原菌(Fusariumgraminearum Schwabe)，近些年研究表明F.graminearum是一个含有许多特定种系的复合种(Fg complex)，O’Donnell通过宗系谱法将Fg complex划分成12个特定的正式命名的种。禾谷镰刀菌产生B型单端孢霉烯族毒素毒素，主要包括雪腐镰刀菌烯醇(nivalenol，简称NIV)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，简称DON)，其中DON毒素又具有两种衍生物，分别为3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-Acetyldeoxynivalenol，简称3ADON)和15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-Acetyldeoxynivalenol，简称15ADON)。由于这三种镰刀菌毒素严重威胁到人类和动物的安全，国内外育种界、病理学界、医学界以及各国政府检验检疫部门对这三种毒素的监测监控研究十分重视。

镰刀菌毒素的检测主要有生物测定法、化学测定法、酶联免疫吸附法、特异性聚合酶链式反应等手段。生物测定法由于没有统一的规范标准，并且有易污染、检测分析不准确以及与毒素互作机制复杂等缺点，所以在实际镰刀菌毒素含量检测中未能得到广泛应用。化学测定法是目前用于镰刀菌毒素定量测定的主要方法，具有是快速、准确、重演性好的优点。但其纯化程序比较费时和复杂，技术含量要求也较高，不能满足口岸快速检测的要求。酶联免疫吸附法操作简单，费用较低，但因为检测出的毒素中常含有一些其它衍生物，所以测定的结果往往偏高。而且目前已有商品化的只有快速检测DON毒素的ELISA试剂盒，还没有检测NIV的试剂盒问世，也不能区分DON毒素的两种衍生物。根据美国农业部Ward博士的最新报道，产生3ADON的镰刀菌具有更强的产孢率和生长速率，对麦类作物的危害更为严重，并且正在取代产生其他毒素的镰刀菌，表现出更强的适应性(Ward，T.J.et al.2008.An adaptiveevolutionary shift in Fusarium head blight pathogen populations is driving the rapid spread of moretoxigenic Fusarium graminearum in North America.Fungal Genet.Biol.45：473-484.)。在中国，我们也发现了类似的情况(Zhang et al.2009.Population genetic analysis of Fusarium asiaticumpopulations from barley suggest a recent shift favoring 3ADON producers in southern China.Unpublished)。所以对于3ADON和15ADON的检测也是十分必要的。随着近年来国际贸易中各国之间粮食进出口规模不断扩大，各国口岸都加强了对粮食作物的出入境管理，检疫实践中急需一种套快速、简单、灵敏的检测方法来检测进出口粮食是否存在毒素污染。

近年来随着分子生物学的快速发展，在镰刀菌毒素合成的基因表达调控方面取得了一系列的重要进展，揭示了trichothecen毒素合成途径中多个基因的作用。因此，国内外研究者都希望通过这些分子生物学结果和相关基因的序列信息，找到一种简便、快速、低成本的镰刀菌毒素检测方法。Kim等通过Tri5、Tri13和Tri7基因序列，检测分别来自大麦、小麦和棉花的禾谷镰刀菌产生的毒素DON和NIV(Kim et al.2003.Polymorphism of trichothecenebiosynthesis genes in deoxynivalenol-and nivalenol-producing Fusarium graminearum isolates.Mycol.Res.107：190-197.)，但其中Tri5检测法涉及Southern杂交，费用高，耗时长，难以在实际中推广应用。Chandler等通过Tri7和Tri13基因检测了三种镰刀菌F.graminearu，F.culmorum和F.cereali产毒情况，应用了10对引物，但DON和NIV特异片段长度不确定，而且较多的毒素检测结果相互之间不吻合(Chandler et al.2003.Development of PCR assays toTri 7 and Tri13 and characterisation of chemotypes of Fusarium graminearum，Fusarium culmorum，and Fusarium cerealis.Physiol.Mol.Plant Pathol.62：355-367.)。李和平等利用Tri5-Tri6基因间隔区序列设计一对引物，能够稳定的检测出禾谷镰刀菌产生的NIV和DON毒素(Li et al.2005.Development of a generic PCR detection of deoxynivalenol-and nivalenol-chemotypes ofFusarium graminearum.FEMS Microbiol.Lett.243：505-511.)，同时能够应用于小麦、玉米籽粒的检测，但仍然不能检测出DON毒素的两种衍生物，并且只适用于禾谷镰刀菌，对于产生此类毒素的其他镰刀菌的检测并无说明。并且以上方法由于DNA提取方法的限制，并不能真正满足快速检测的需求。

(三)发明内容

技术问题本发明的目的是研制一种能够快速准确检测镰刀菌本身产生毒素和粮食、食品安全中镰刀菌毒素污染的分子检测方法，已达到快速、准确、低成本并且能够同时检测出三种重要镰刀菌毒素(NIV，3ADON和15ADON)的目的，适用于禾谷镰刀菌复合种(Fgcomplex)下的全部12个种和同样产生trichothecen毒素的四个近缘种(F.culmorum，F.cerealis，F.pseudograminearum，F.lunulosporum)。同时，本方法采用多重PCR技术，四对引物在同一反应体系中同时高效扩增三种类型毒素的特异片段，提高了检测的准确性，结合DNA快速提取技术，无需繁杂耗时的传统DNA提取步骤，大大节约了检测时间，并且需要样品量极少，只要5mg菌丝或单个小麦病籽粒即可完成检测，非常适合检验检疫的需要，可以试剂盒的形式在我国大规模推广。

本发明是这样实现的：利用已经公开发表的多个镰刀菌毒素合成调控基因Tri11的序列信息，通过序列比对，找到产生不同类型毒素菌株的特异性单核苷酸多态性位点(SNP)，设计一组复合引物。经过一次PCR扩增后，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，根据产物大小可直接检测出镰刀菌本身产生的毒素NIV、3ADON和15ADON，同时可用于田间小麦籽粒中三种毒素的检测。

技术方案

用于检测三种重要镰刀菌毒素的复合PCR方法，包括：

1)用于检测镰刀菌毒素的样品制备

a)菌丝DNA的快速提取技术

将保存的赤霉病菌活化，首先挑取菌丝在PDA培养基(去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml)上，28℃，培养3天，用枪头挑取少量菌丝，放入PCR管，加入50μl Buffer A溶液(100mM NaOH，2％

20，Buffer A用10M NaOH和20％

20现配)，95℃温育10分钟。再加入50μl Buffer B溶液(100mM Tris-HCl，2mM EDTA)，振荡混匀，12000rpm离心15秒，取1μl上清液做PCR扩增的模板，直接加到PCR反应体系中。DNA提取过程耗时15分钟。本实验采用菌株见表1.

b)单个小麦赤霉病籽粒DNA的快速提取技术

取小麦赤霉病籽粒一粒，液氮冷冻，用Biospec公司的MiniBeadbeater-96珠磨式组织研磨仪进行高速振荡研磨40秒。加入50μl Buffer A溶液，振荡混匀2分钟，再加入50μl Buffer B溶液，震荡混匀1分钟，12000rpm离心15秒，取1μl上清液做PCR扩增的模板，直接加到PCR反应体系中。DNA提取过程耗时5分钟。

2)用于检测镰刀菌毒素的特异性引物

四条引物序列为：

Primer A：5’-CTTGTCAGGCGGCACAGTAG-3’

Primer B：5’-AAGTATGGTCCAGTTGTCCGTATT-3’

Primer C：5’-GCAAGTCTGGCGAGGCC-3’

Primer D：5’-TCAAAGGCCAGAGCAACCC-3’

其中primer A/D引物对在产生雪腐镰刀菌烯醇(NIV)毒素的镰刀菌中特异性扩增出643bp的产物，primer B/D引物对产生15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15ADON)毒素的镰刀菌中特异性扩增出424bp的产物，primer C/D引物对产生3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3ADON)毒素的镰刀菌中特异性扩增出342bp的产物。

3)PCR扩增的反应体系

在20μl反应液中，包含0.3μM primer A，0.1μM primer B，0.15μM primer C和0.3μMprimer D，10μl 2×TaqMix(包含0.1U Taq Polymerase/μl，500μM dNTP，20mM Tris-HCl，100mM KCl，3mM MgCl₂)，1μl菌丝DNA或小麦赤霉病籽粒DNA做模板。

4)PCR扩增程序

94℃预变性3min，94℃变性40min，69℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。整个PCR过程用时2小时。

4)PCR产物的鉴定

取5μl PCR产物用1.5％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离30分钟，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果。

有益效果

本发明根据已发现的镰刀菌毒素生物合成调控基因序列信息，设计一套引物，仅仅通过一步PCR反应，即可简单快速可靠的鉴定出多个种下的镰刀菌产生的毒素类型NIV、3ADON和15ADON，与化学分析法检测菌株本身产生的毒素类型完全吻合。与国内外现有方法相比，本发明具有以下的技术优势：

1)检测毒素更多。本方法根据Tri11基因内三种不同毒素类型菌株的单核苷酸多态性位点进行PCR扩增检测。通过扩增一个基因同时检测到三种重要的镰刀菌毒素NIV、3ADON和15ADON。

2)操作简便快捷。本发明采用复合PCR技术，四对引物在同一反应体系中同时扩增，同时采用新的DNA快速提取技术，省去了传统DNA制备的繁琐过程。整个过程简单、快速、高效。一般整个检测过程可在3个小时内完成。

3)特异性强，应用范围广。本方法适用于禾谷镰刀菌复合种(Fg complex)下的全部12个种和同样产生trichothecen毒素的四个近缘种(F.culmorum，F.cerealis，F.pseudograminearum，F.lunulosporum)的检测。同时，既可检测镰刀菌本身产生的毒素，也可用于田间小麦籽粒中三种毒素的检测，与植物基因组DNA无交叉扩增反应。

4)成本低。本方法所用DNA快速提取和PCR过程均为常规试剂，价格低廉，每个样品的检测成本约为1元人民币。

因此本方法实用性强，可满足植物检疫及病害监测的需要。

(四)附图说明

图1：本发明技术流程图

图2：对国际标准菌株的PCR扩增鉴定结果

M：分子量标准100bp；1-8，产生NIV毒素菌株：NRRL13818，NRRL25797，NRRL29297，NRRL38380，NRRL28721，NRRL28723，NRRL13393，NRRL13721；9-12，产生15ADON毒素菌株：NRRL38208，NRRL46722，NRRL5883，NRRL 29020；13-17，产生3ADON毒素菌株：NRRL6101，NRRL31281，NRRL2903，NRRL3288，NRRL28338。

图3：对中国采集菌株的PCR扩增鉴定结果

M：分子量标准100bp；18-20，产生NIV毒素菌株：13033，7071，7069；21-25，产生15ADON毒素菌株：7076，3002，5226，4021，5167；26-34，产生3ADON毒素菌株：13082，13081，5039，4022，7107，7092，11036，1009，8003。

图4：田间接种小麦赤霉病籽粒的PCR扩增鉴定结果

M：分子量标准100bp；1，健康小麦籽粒；2，接种菌株13033(NIV)的小麦病籽粒；3接种菌株7076(15ADON)的小麦病籽粒；4，接种菌株13082(3ADON)的小麦病籽粒；5，接种混合菌株13033、7076和13082的小麦病籽粒

图5：田间自然发病小麦赤霉病籽粒的PCR扩增鉴定结果

M：分子量标准100bp；1，健康小麦籽粒；2，四川宣汉采集病粒，3，河北邯郸采集病粒，4-6湖北荆州采集病粒。

(五)具体实施方式

实施实例1：NRRL国际标准菌株的产生毒素的检测鉴定

1)菌株DNA的快速提取

NRRL菌株由美国农业部O’Donnell博士提供(表1)，其毒素类型已知。将NRRL菌株活化，首先挑取菌丝在PDA培养基(去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml)上，28℃，培养3天，用枪头挑取少量菌丝，放入PCR管，加入50μl BufferA溶液(100mM NaOH，2％20，Buffer A用10M NaOH和20％

20现配)，95℃温育10分钟。再加入50μl Buffer B溶液(100mM Tris-HCl，2mM EDTA)，振荡混匀，12000rpm离心15秒，取1μl上清液做PCR扩增的模板，直接加到PCR反应体系中。

表1本发明采用的不同国家和地区产毒素的镰刀菌菌株

2)特异性引物的合成

Primer A：5’-CTTGTCAGGCGGCACAGTAG-3’

Primer B：5’-AAGTATGGTCCAGTTGTCCGTATT-3’

Primer C：5’-GCAAGTCTGGCGAGGCC-3’

Primer D：5’-TCAAAGGCCAGAGCAACCC-3’

由上海生工公司合成。

3)PCR扩增反应

4)PCR扩增程序

5)PCR产物的鉴定

实施结果

利用本发明的复合引物以NRRL菌株的菌丝为模板，PCR扩增。结果如图2，在1-8泳道扩增出NIV毒素特异性条带643bp；9-12泳道扩增出15ADON毒素特异性条带424bp；13-17泳道扩增出3ADON毒素特异性条带342bp，完全与化学法测定相符合(表1)。

实施实例2：中国采集菌株产生毒素的检测鉴定。

菌株采集自中国8个省(表2)，毒素类型经GC/MS法检测确定已知。菌株DNA的快速提取、特异性引物的合成、PCR扩增反应、PCR扩增程序和产物鉴定同实施实例1。

表2本发明所采用的中国采集镰刀菌菌株

实施结果

利用本发明的复合引物以中国采集菌株的菌丝为模板，PCR扩增。结果如图3，在1-3泳道扩增出NIV毒素特异性条带643bp；4-8泳道扩增出15ADON毒素特异性条带424bp；9-17泳道扩增出3ADON毒素特异性条带342bp，完全与化学法测定相符合(表1)。

实施实例3：田间接种小麦赤霉病籽粒的毒素检测

1)分生孢子悬浮液制备

将纯化鉴定过的菌株13033(NIV)、7076(15ADON)和13082(3ADON)接种在灭菌的绿豆汤培养基中，28℃，150rpm震荡培养4天。用血球计数板计数，将孢子浓度调整到5×10⁵个/毫升左右。

2)田间花期接种

将扬花期小麦分为5组，剪去中部小麦小穗内外颖顶部少许，用微量注射器分别注入分生孢子悬浮液20μl。第一组作对照注入无菌水，第二组注射菌株13033，第三组注射7076，第四组为13082，第五组注射三个菌株等量混合的孢子悬浮液。套袋保湿，7天后去掉保湿袋，20天后采集样品，用于毒素测定。

3)单个小麦赤霉病籽粒DNA的快速提取

取小麦赤霉病籽粒一粒，液氮冷冻，用Biospec公司的MiniBeadbeater-96珠磨式组织研磨仪进行高速振荡研磨40秒。加入50μl Buffer A溶液，振荡混匀2分钟，再加入50μl BufferB溶液，震荡混匀1分钟，12000rpm离心15秒，取1μl上清液做PCR扩增的模板，直接加到PCR反应体系中。

特异性引物的合成、PCR扩增反应、PCR扩增程序和产物鉴定同实施实例1。

实施结果

利用本发明的复合引物以单个小麦赤霉病籽粒DNA为模板，PCR扩增。结果如图4，1泳道为健康籽粒，无特异条带产生；在2泳道扩增出NIV毒素特异性条带643bp；3泳道扩增出15ADON毒素特异性条带424bp；4泳道扩增出3ADON毒素特异性条带342bp，5泳道为混合侵染籽粒，扩增出全部三种特异性条带，完全与预期结果相符合。

实施实例4：田间自然侵染小麦赤霉病籽粒的毒素检测

小麦赤霉病籽粒分别采集于四川宣汉、河北邯郸、湖北荆州。单个小麦赤霉病籽粒DNA的快速提取、特异性引物的合成、PCR扩增反应、PCR扩增程序和产物鉴定同实施实例3.

实施结果

利用本发明对田间采集自然发病的小麦赤霉病粒进行毒素检测，效果如图5，1泳道为健康籽粒，无特异条带产生；在2泳道为四川宣汉采集病粒，扩增出NIV毒素特异性条带643bp；3泳道为河北邯郸采集病粒，扩增出15ADON毒素特异性条带424bp；4-6泳道为湖北荆州采集病粒，扩增出3ADON毒素特异性条带342bp。

附件：

由引物A+D扩增出的产生NIV毒素菌株的DNA序列

PrimerA 5’-CTTGTCAGGCGGCACAGTAG-3’

CTTGTCAGGCGGCACAGTAGGTTCCATTGCTTGTTTGCAGAGATCTGGATACATCTAACACTGGATCTTATAGGCGGTTG

CATATTTTGTGATTATGCTTGTGTACAACCTCTTTTTCCACCCCCTGCGGAACTACCCAGGGCCTTGGCTCAATACCATG

ACTCAAATCCCCCATACTCTCCTCATGCTCTGTGGACTTCCTCACAAGAGACATCTTGCACTTCACATGAAGTATGGTCC

AGTGGTGCGAATAGGGCCTAACATGCTCTCGTTCAACCACCCAGACGCCATGAAGGATGTTCGTGGTCATCGCAAGTCTG

GTGAGGCTGAACATGGTAAGGATCCAATCATAGTACTGTCCAATGGCGACAACATTGTCGGTAGCGATCGAGAGAATCAT

ACTCGTTTCCGCCGTGCTCTAGCATATGGCTTCTCTGCCCAAGCCATGCTTGAACAAGAGCCTACCTTTAAAGCATATGT

CAACCAGCTATTCCAGCGTCTCCATGAGCAGTCATCCAATGGTACAAAGACTGTTGACATTTCTAAATGGTATACATTTA

CGACATTTGACATGATCGGTGACTTGGCGTTTGGAGAGTCTTTTGGCTGTCTTGATAACTCTACTTACCATCCCTGGGTT

GCTCTGGCCTTTGA

(互补序列)3′CCCAACGAGACCGGAAACT 5′PrimerD

由引物B+D扩增出的产生15ADoN毒素菌株DNA序列

Primer B：5’-AAGTATGGTCCAGTTGTCCGTATT-3’

AAGTATGGTCCAGTTGTCCGTATTGGGCCAAACATGCTCTCGTTCAACCACCCGGACGCCATGAAGGATGTTCGCGGCCA

TCGCAAGTCTGGTGAGGCTGAACATGGCAAGGACCCAATCATAGTACTGTCAAATGGCGACAACATTGTTGGTAGTGATC

GAGAGAATCATACTCGTTTCCGCCGTGCTCTAGCATATGGCTTCTCCGCCCAGGCCATGCTTGAACAAGAGCCTACCTTC

AAAGCATATGTCAATCAGCTATTCCAGCGTCTCCATGAGCAGTCATCCAGTGGTATAAAGCCTGTTGACATTTCTAAATG

GTATACCTTTACGACATTTGACATGATCGGTGACTTGGCATTTGGAGAGTCTTTCGGTTGTCTTGATAACTCTACTTACC

ACCCCTGGGTTGCTCTGGCCTTTGA

(互补序列)3′CCCAACGAGACCGGAAACT 5′PrimerD

由引物C+D扩增出的产生3ADoN毒素菌株DNA序列

Primer C：5’-GCAAGTCTGGCGAGGCC-3’

GCAAGTCTGGCGAGGCCGAACATGGTAAGGACCCAATCATAGTACTGTCAAATGGCGACAACATTGTGGGTAGCGA

TCGAGAGAATCATACTCGTTTCCGCCGTGCTCTAGCATATGGCTTCTCTGCTCAGGCCATGCTTGAACAAGAGCCT

ACCTTTAAAGCATATGTCAATCAGCTATTCCAGCGTCTCCATGAGCAGTCATCCAATGGTACAAAGACTGTTGACA

TTTCTAAATGGTATACTTTCACGACATTTGACATGATCGGTGACTTGTCGTTTGGAGAGTCTTTCGGCTGTCTTGA

AAACTCTACTTACCACCCCTGGGTTGCTCTGGCCTTTGA

(互补序列)3′CCCAACGAGACCGGAAACT 5′PrimerD

Claims

1.用于检测三类镰刀菌毒素的特异性引物四条，primer A/B和primier E/F，其引物序列为：

Primer A：5’-CTTGTCAGGCGGCACAGTAG-3’

Primer B：5’-AAGTATGGTCCAGTTGTCCGTATT-3’

Primer C：5’-GCAAGTCTGGCGAGGCC-3’

Primer D：5’-TCAAAGGCCAGAGCAACCC-3’

2.一种同时检测三类镰刀菌毒素的快速分子检测方法，其步骤包括：

1)从被测生物材料中抽提DNA，得到DNA样品；

2)用权利要求1中的所示的引物对步骤1)中的DNA样品进行PCR扩增，得到权利要求1中的特异性大小的DNA片段。

3)用步骤2)的到的DNA片段，检测所述生物材料重视否存在所述的毒素3ADON和/或15ADON和/或NIV。

3.根据权利要求2所述镰刀菌毒素特异性检测方法，其中的PCR步骤包括：

1)扩增反应体系：在20μl反应液中，包含50ng模板DNA，0.3μM primerA，0.1μM primerB，0.15μM primer C和0.3μM primer D，10μl 2×TaqMix(包含0.1U Taq Polymerase/μl，500μM dNTP，20mM Tris-HCl，100mM KCl，3mM MgCl₂)。

2)PCR扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性40min，69℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。

3)电泳检测：反应完成后，取7μl PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统中紫外灯下照相，根据扩增产物大小判定结果。

4.一种同时检测三类镰刀菌毒素的快速分子检测方法在检测镰刀菌毒素中的应用。

5.一种同时检测三类镰刀菌毒素的快速分子检测方法在检测籽粒，饲料或食品安全中镰刀菌毒素的应用。