CN110172526B - 一种快速鉴定禾谷镰刀菌产毒基因型的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速鉴定禾谷镰刀菌产毒基因型的试剂盒，属于分子生物学领域。所述试剂盒包含ComF、3A‑R、15A‑R和NIV‑R四种引物，分别具有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。本发明的试剂盒重复性好，特异性高。本发明还公开了上述试剂盒在鉴定禾谷镰刀菌产毒基因型中的应用，准确性高，操作简单，适用于禾谷镰刀菌产毒基因型的快速鉴定。

Description

一种快速鉴定禾谷镰刀菌产毒基因型的试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体地，涉及一种快速鉴定禾谷镰刀菌产毒基因型的试剂盒及其应用。

背景技术

小麦赤霉病是一种严重的植物病害，在世界范围内广泛流行，在我国的长江中下游地区、华南地区以及东北地区等小麦产区均有发生。小麦赤霉病会影响小麦的产量，并且真菌分泌的毒素会引起呕吐等症状，可能有致癌的危害。

禾谷镰刀菌是小麦赤霉病的主要病原菌，属于半知菌亚门镰孢属真菌，单个孢子是无色的，大型分生孢子呈镰刀型，主要产生B型单端孢烯族毒素，包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和雪腐镰刀菌烯醇(NIV)，其中DON的乙酰化产物包括3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3Ac-DON)和15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15Ac-DON)两种。根据所产毒素类型的不同，禾谷镰刀菌菌株被划分为3Ac-DON型、15Ac-DON型和NIV型三种基因型。开展禾谷镰刀菌产毒基因型快速鉴定方法研究对进行小麦等谷物中真菌毒素污染风险评估研究，有针对性地开展病害及毒素污染防控工作具有重要的指导意义。然而，目前尚没有能够快速鉴定谷镰刀菌产毒基因型的方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，发明人的目的是提供快速对禾谷镰刀菌的毒素化学型进行检测的试剂盒。为此，发明人进行了大量的研究，开发了可用于禾谷镰刀菌毒素化学型分子鉴定的特异性引物，通过对禾谷镰刀菌DNA进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，获得特异性条带来区分毒素的化学型。

本发明第一方面提供一种快速鉴定禾谷镰刀菌产毒基因型的试剂盒，包含由引物ComF、引物3A-R、引物15A-R、引物NIV-R组成的引物组合，其中，引物ComF、引物3A-R、引物15A-R、引物NIV-R分别具有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包含DNA聚合酶、dNTPs和PCR缓冲液。

在本发明的另一些实施方案中，所述试剂盒还包含2×EasyTaq PCR SuperMix。

本发明的第二方面提供本发明第一方面所述的试剂盒在快速鉴定禾谷镰刀菌产毒基因型中的应用。

在本发明的一些实施方案中，快速鉴定禾谷镰刀菌产毒基因型包括以下步骤：

获取待鉴定禾谷镰刀菌的基因组DNA；

以所述DNA为模板，利用权利要求1所述的试剂盒进行PCR扩增；

检测PCR扩增产物，以确定禾谷镰刀菌产毒基因型。

在本发明的一些实施方案中，利用测序法检测PCR扩增产物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述测序是指Sanger法测序。

在本发明的另一些实施方案中，利用琼脂糖凝胶电泳法检测PCR扩增产物。

在本发明中，如果PCR扩增产物为836bp，则待鉴定禾谷镰刀菌能够产生3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇；如果PCR扩增产物为1116bp，则待鉴定禾谷镰刀菌能够产生15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇；如果PCR扩增产物为1404bp，则待鉴定禾谷镰刀菌能够产生雪腐镰刀菌烯醇。

在本发明的一些实施方案中，其中PCR扩增的体系为：总体积20μL：2×EasyTaqPCR SuperMix 10μL，10μmol/L上游引物1μL，10μmol/L下游引物1μL，DNA模板50ng，ddH2O补至20μL。

在本发明的一些实施方案中，其中PCR扩增的程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，62℃复性40s，72℃延伸90s，25个循环；72℃延伸5min。

本发明的有益效果

本发明试剂盒中的引物重复性好，特异性高。

本发明的试剂盒能够用于快速鉴定禾谷镰刀菌毒素基因型，速度快、操作简单，准确性高。

使用本发明可快速、准确地对禾谷镰刀菌毒素化学型进行鉴定，因而对其实施田间针对性防治、开展生物多样性研究及植物检验检疫等具有重要意义。

附图说明

图1示出了ComF、15A-R、NIV-R和3A-R四种引物对17份镰刀菌DNA的扩增产物电泳图。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

实施例

1材料与仪器

实验材料为由上海市农业科学院提供的17份已知产毒基因型的禾谷镰刀菌菌株(菌株产毒基因型详见参考文献Development of a Generic PCR Detection of 3-Acetyldeoxynivalenol-,15-Acetyldeoxynivalenol-and Nivalenol-Chemotypes ofFusarium graminearum Clade[J].International Journal of Molecular Sciences,2008,9(12):2495-2504.)。实验仪器主要有水浴锅、高速离心机、NanoDrop 2000、PCR仪、琼脂糖凝胶电泳仪、紫外凝胶成像仪。

2禾谷镰刀菌培养

将17份禾谷镰刀菌菌株接种到PDA培养基上，26℃培养三天，观察镰刀菌菌丝量，当菌丝量满足基因组DNA提取量后即可进行后续实验。

3禾谷镰刀菌基因组DNA的快速提取

利用基因组DNA快速提取方法提取镰刀菌基因组DNA，详细步骤如下：

溶液A：50mM Tris-HCl，50mM EDTA，10％SDS，2M NaCl，N-月桂酰肌氨酸钠3g/100mL；

溶液B：3M NaAC，PH 5.2；

溶液C：异丙醇；

溶液D：75％的乙醇；

溶液E：含有50μg/mL RNA酶的ddH₂O。

(1)分取20～50mg镰刀菌的菌丝，加入至1.5mL离心管中，

(2)加入400μL的溶液A；

(3)在94℃下水浴加热10min，每隔3min颠倒混匀一次；

(4)冷却至室温后，12000rpm离心1min，取上清液350μL至新的离心管中；

(5)加入35μL的溶液B，颠倒混匀，加入350μL溶液C，颠倒混匀，室温放置2min；

(6)将750μL混合液全部转移至吸附柱中，9000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；

(7)在吸附柱中加入650μL溶液D，9000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，9000rpm再次离心30s，将吸附柱转移至新的离心管中，打开吸附柱盖子，室温放置2min；

(8)向吸附柱中加入30μL 50℃预热的溶液E，静置3min后，12000rpm离心1min，获得真菌基因组DNA，-20℃保存。

4特异性引物的PCR扩增反应

将上述方法提取的17份禾谷镰刀菌基因组DNA稀释至100ng/μL作为模板，以ComF、3A-R、15A-R、NIV-R的组合为引物，对17份禾谷镰刀菌DNA进行PCR扩增。

其中，各引物的序列(5'-3')如下：

ComF：AACCCCTTR(G/A)TTTGGGCCGAG(SEQ ID NO.1)

3A-R：GACGTAACACGAGAGTTGTG(SEQ ID NO.2)

15A-R：TACCTATGACATCGGTTAGC(SEQ ID NO.3)

NIV-R：TCATCTCTTGACCTCTCTGG(SEQ ID NO.4)

用ComF、3A-R、15A-R、NIV-R四种引物的组合对禾谷镰刀菌基因组进行PCR扩增，每一株禾谷镰刀菌只能产生一种DNA条带类型。其中，产毒基因型为3Ac-DON的禾谷镰刀菌可获得836bp的DNA条带、产毒基因型为15Ac-DON的禾谷镰刀菌可获得1116bp的DNA条带、产毒基因型为NIV的禾谷镰刀菌可获得1404bp的DNA条带。

PCR体系和反应程序如下：

PCR扩增体系(总体积20μL)：2×EasyTaq PCR SuperMix 10μL，10μmol/L引物ComF、3A-R、15A-R和NIV-R各1μL，DNA模板50ng，ddH₂O补至20μL。

PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，62℃复性40s，72℃延伸90s，25个循环；72℃延伸5min。

5PCR产物的琼脂糖凝胶检测

准确称取2g琼脂糖于锥形瓶中，加入100mL TAE缓冲液摇匀，置于微波炉中加热至琼脂糖全部融化，加入10μL GelStain核酸染液，摇匀后，倒入凝胶板中，室温放置10min至凝固。取5μL PCR扩增产物上样，160V恒压电泳50min，在凝胶成像仪下观察是否为单一明亮条带。

结果显示(如图1所示)，菌株1-6可扩增出1404bp的DNA片段，表明其能够产生雪腐镰刀菌烯醇毒素(NIV)，这些菌株产毒基因型属于NIV型；菌株7-12可扩增出1116bp的DNA片段，表明其够产生15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素(15Ac-DON)，这些菌株产毒基因型属于属于15Ac-DON型；菌株13-17可扩增出836bp的DNA片段，表明其能够产生3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素(3Ac-DON)，这些菌株产毒基因型属于3Ac-DON型。该方法的鉴定结果与菌株已报道的产毒基因型是一致的，详见参考文献Development of a Generic PCR Detectionof 3-Acetyldeoxynivalenol-,15-Acetyldeoxynivalenol-and Nivalenol-Chemotypesof Fusarium graminearum Clade[J].International Journal of Molecular Sciences,2008,9(12):2495-2504。

从图1还可以看出，每个菌株都仅扩增出一条单一明亮的条带，表明上述引物特异性很强。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海市农业科学院

<120> 一种快速鉴定禾谷镰刀菌产毒基因型的试剂盒及其应用

<130> XY-2019-1-W-037

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaccccttrt ttgggccgag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gacgtaacac gagagttgtg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tacctatgac atcggttagc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcatctcttg acctctctgg 20

Claims (6)

1.试剂盒在快速鉴定禾谷镰刀菌产毒基因型中的应用，所述试剂盒包含由引物ComF、引物3A-R、引物15A-R、引物NIV-R组成的引物组合，其中，引物ComF、引物3A-R、引物15A-R、引物NIV-R分别具有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述应用包括以下步骤：

获取待鉴定禾谷镰刀菌的基因组DNA；

以所述DNA为模板，利用所述的试剂盒进行PCR扩增；

检测PCR扩增产物，以确定禾谷镰刀菌产毒基因型，

如果PCR扩增产物为836bp，则待鉴定禾谷镰刀菌能够产生3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇；如果PCR扩增产物为1116bp，则待鉴定禾谷镰刀菌能够产生15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇；如果PCR扩增产物为1404bp，则待鉴定禾谷镰刀菌能够产生雪腐镰刀菌烯醇。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包含DNA聚合酶、dNTPs和PCR缓冲液。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用测序法检测PCR扩增产物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，利用琼脂糖凝胶电泳法检测PCR扩增产物。

5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，其中PCR扩增的体系为：总体积20μL：2×EasyTaq PCR SuperMix 10μL，10μmol/L上游引物1μL，10μmol/L下游引物1μL，DNA模板50ng，ddH₂O补至20μL。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，其中PCR扩增的程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，62℃复性40s，72℃延伸90s，25个循环；72℃延伸5min。

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