CN115216552A

CN115216552A - 一种基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速检测青枯菌的方法和试剂盒

Info

Publication number: CN115216552A
Application number: CN202210783143.9A
Authority: CN
Inventors: 梅余霞; 范智玉; 梁运祥; 陈振民; 李英俊; 刘洋洋
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2022-06-27
Filing date: 2022-06-27
Publication date: 2022-10-21

Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas12a‑LAMP快速检测青枯菌的方法和试剂盒，涉及病原微生物检测领域。本发明提供了一种青枯菌的LAMP检测引物组，包括上游外引物F3、下游外引物B3、上游内引物FIP和下游内引物BIP。本发明还提供一种基于CRISPR/Cas12a‑LAMP快速检测青枯菌的试剂盒和方法。本发明的检测方法将LAMP的扩增方法与CRISPR/Cas12的检测方法结合成为CRISPR/Cas12a‑LAMP的分子检测方法，该方法具有良好的特异性、敏感性、重复性，操作简便快捷，成本低廉，不需要大型仪器设备，具有快速检测的的优势。

Description

一种基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速检测青枯菌的方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及病原微生物检测领域，特别是涉及一种基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速检测青枯菌的方法和试剂盒。

背景技术

植物细菌性青枯病(Bacterial wilt of plants)，是由茄科雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum，简称青枯菌)引起的一种世界性重大病害。作为一种生物分类学复杂的复合菌种，青枯菌寄主范围广泛，可侵染54个科的450余种植。其中经济上重要的寄主包括马铃薯、西红柿、辣椒、茄子、烟草、生姜、桑树和香蕉等。

目前最为常用的青枯菌检测方法是平板划线分离技术，该方法简单廉价，但费时费力，且操作人员需具备准确识别青枯菌菌落形态的能力。血清学检测技术是基于抗原与抗体的专一性识别与结合，它利用抗体与抗原产生的凝集反应、沉淀反应等对靶标病原菌作出快速有效的诊断与鉴定。已报道用于青枯菌检测的血清学方法，包括酶联免疫吸附(ELISA)、免疫萤光(IF)、荧光原位杂交(FISH)以及免疫试纸条(Immuno-strip)等。美国阿格迪(AgdiaR)公司商品化生产的ELISA试剂盒和免疫试纸条在欧美一些国家已被用于室内及田间青枯病疑似样品的初步筛查。但此类方法的缺点在于价格昂贵，检测灵敏度不高。如Agdia的检测试纸条每个样品的检测成本约￥50，检测灵敏度阈值一般在10⁰-10¹cfu/mL。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新的等温扩增技术，因其操作简单快速、特异性、灵敏度高、成本低等特点，逐渐成为可以替代传统PCR的新的核酸扩增检测技术。它是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用Bst DNA聚合酶的链置换活性在同一反应体系中恒温高效扩增，大量合成目的DNA的同时，产生副产物–白色焦磷酸镁沉淀。由于扩增反应依赖于靶DNA的6个独立的区域，因此特异性非常高，反应在等温条件下进行，则不需要PCR仪等昂贵设备，仅用水浴锅等能够维持稳定恒温的设备即可完成，检测成本大大降低，应用范围显著扩大，可以在田间进行快速检测。

由规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein，Cas蛋白)组成的CRISPR/Cas系统被认为是存在于大多数细菌与所有古生菌中的一种适应性免疫系统，以消灭外来的遗传物质。CRISPR序列是一个特殊的DNA重复序列，包含有高度保守的长度约为21-48bp的重复序列(repeats)和26-72bp的间隔序列(spacer)。重复序列被不同的间隔序列隔开，CRISPR通过间隔序列对靶基因进行识别。Cas位于CRISPR位点附近，是双链DNA核酸酶家族的总称。随着对CRISPR/Cas系统的作用机制和Cas蛋白功能的逐步揭示，CRISPR/Cas系统逐渐发展成为一种由引导RNA指引Cas核酸酶对靶基因进行特定核酸编辑的技术。CRISPR/Cas系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶如Cas9蛋白至与crRNA配对的靶序列位点处剪切双链DNA，从而实现对基因组DNA序列进行编辑，CRISPR/Cas系统不仅可以应用于基因编辑，而且已经成为核酸检测的一种工具，显示了下一代分子诊断方法的巨大潜力。目前已鉴定出很多种Cas蛋白能在sgRNA引导下对靶位点进行切割。Cas12a属于该家族中的一种，能在sgRNA引导下对靶基因进行特定切割，同时被激活的Cas12a可发挥非特异性剪切酶活性，对所遇到的单链DNA(ssDNA)进行非特异性剪切。利用Cas12a可被靶向激活的特性，经过特异性地设计，可以用于靶基因的特异性检测。

相比较于传统病原体的鉴定方法，核酸检测技术是早期诊断的利器。尽管qPCR作为核酸检测金标准已经广泛应用于一线检测中，但是基于变温扩增的检测技术需昂贵的设备，且需要标准化的实验室和专业技术人员进行操作，反应时间长，难以满足即时检测要求，对于病原体含量极低的情况无法实现早期监测。如何更加快速、简便、准确、低成本的检测，是病原体核酸检测未来的发展方向。现有的一些核酸快速检测方法有LAMP(环介导等温扩增)以及RPA-exo探针法(重组酶聚合酶扩增-探针法)等，在一些特殊恒温核酸扩增酶介导下，摆脱了对变温设备的依赖，靶标核酸可以在固定温度进行核酸扩增与检测。基于LAMP或RAA的核酸恒温扩增检测，虽然摆脱了热循环设备的限制，但是其高速扩增和高灵敏度带来了假阳性的可能。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速检测青枯菌的方法和试剂盒，以解决上述现有技术存在的问题，本发明的检测方法将LAMP的扩增方法与CRISPR/Cas12的检测方法结合成为CRISPR/Cas12a-LAMP的分子检测方法，该方法具有良好的特异性、敏感性、重复性，操作简便快捷，成本低廉，不需要大型仪器设备，具有快速检测的的优势。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种青枯菌的LAMP检测引物组，包括如SEQ ID NO.1所示的上游外引物F3、如SEQ ID NO.2所示的下游外引物B3、如SEQ ID NO.3所示的上游内引物FIP和如SEQID NO.4所示的下游内引物BIP。

本发明还提供一种基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速检测青枯菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述的LAMP检测引物组、如SEQ ID NO.7所示的crRNA、LbaCas12a和修饰荧光基团和淬灭基团的如SEQ ID NO.8所示的ssDNA探针。

进一步地，所述荧光基团和淬灭基团为FAM和BHQ基团。

本发明还提供一种非疾病诊断目的的基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速检测青枯菌的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样品中的基因组DNA；

(2)以所述基因组DNA为模板，利用上述的LAMP检测引物组进行LAMP扩增；

(3)将步骤(2)得到的扩增产物在CRISPR/Cas12a反应体系中反应后，进行荧光检测，出现荧光信号，即为含有所述青枯菌；所述CRISPR/Cas12a反应体系包括如SEQ ID NO.7所示的crRNA、LbaCas12a和修饰荧光基团和淬灭基团的如SEQ ID NO.8所示的ssDNA探针。

进一步地，在步骤(2)中，所述LAMP扩增反应的反应体系为：2.5μL IsothermalAmplification Buffer I，6mM Mg²⁺，320U/mL Bst 2.0DNApolymerase，1.6mM dNTPs，0.1μMF3和B3，0.8μM FIP和BIP，模板DNA1.0μL，加去核酸酶水补足至25μL。

进一步地，在步骤(2)中，所述LAMP扩增反应的反应条件为：63℃扩增25min。

进一步地，所述荧光基团和淬灭基团为FAM和BHQ基团。

进一步地，所述CRISPR/Cas12a反应体系具体为：30nM的LbaCas12a，30nM crRNA，3μL LAMP扩增产物，3μL 10X NEBuffer R2.1，0.8Μm FAM-BHQ标记的ssDNA，用DEPC水补至25μL。

进一步地，在步骤(3)中，所述扩增产物在CRISPR/Cas12a反应体系中的反应温度为37℃。

进一步地，在步骤(3)中，所述扩增产物在CRISPR/Cas12a反应体系中的反应时间为20min。

本发明公开了以下技术效果：

本发明的检测方法将LAMP的扩增方法与CRISPR/Cas12的检测方法结合成为CRISPR/Cas12a-LAMP的分子检测方法，该方法具有良好的特异性、敏感性、重复性，操作简便快捷，成本低廉，不需要大型仪器设备，具有快速检测的的优势，更有利于对青枯菌的分子检测技术在基层中的推广和应用，有利于在基层农户使用，预防青枯病的发生。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为LAMP-CRISPR/cas12a检测操作流程示意图；

图2为含目的基因序列的PUC19质粒图谱；

图3为本发明设计的crRNA的示意图；

图4为实施例2建立的LAMP法检测下线；

图5为实施例2建立的qPCR法检测下线；

图6为CRISPR/Cas12a-LAMP检测体系的灵敏度检测；

图7为CRISPR/Cas12a-LAMP检测体系的特异性检测。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1特异性靶基因筛选及引物设计

1.1保守序列的分析

在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)中下载多条青枯菌的内切葡聚糖酶基因(endoglucanase)，通过MEME(MEME-MEME Suite(meme-suite.org))网站进行egl基因的多序列比对分析，最终得到保守序列，该序列为(5’-3’)：GACGGATAGATGTAGTTGCTCCCGTAGGTGCCCGGCAGGCTGCCCTCCCCGAACTCGGCGCCGGCCAGGCTGACGCCGCGCCACAGCAGGGTGCCCGTGCCCTGCGCCACCTGGCATACCTTGGCGACACCGGCCGCCGGATCCTTGCCAAAGAAGGCGGCGGTGCACTGGCCTGTGCCGGACATGCTCTTCGCCACCCACGCGCTGCCGGCGCCATAGCGCACCGTGCGCGTGCCGCTCACCGTGAACGCCGCGCTGTCCTTGGCGATGGTGAGCCACAACGGCGAGATCGAGGTGGTGGCGGCCGTCTTCAGGGTCGTGG(SEQID NO.8)。

1.2LAMP引物设计

以1.1中获得的保守序列在LAMP引物设计网站，(LAMP primer designingsoftware:PrimerExplorer)中设计特异性引物，设计完成以下引物：

上游外引物F3：ACAGCAGGGTGCCCGT(SEQ ID NO.1)；

下游外引物B3：CGTTGTGGCTCACCATCG(SEQ ID NO.2)；

上游内引物FIP：AGTGCACCGCCGCCTTCTTGGCATACCTTGGCGACAC(SEQ ID NO.3)；

下游内引物BIP：CGGACATGCTCTTCGCCACCCACAGCGCGGCGTTCAC(SEQ ID NO.4)。

该特异性引物用于LAMP技术检测，其中外引物还用作PCR反应的上、下游引物，用做于青枯菌的鉴定。

实施例2检测方法的建立

1DNA的提取

用天根生化科技(北京)有限公司细菌基因组DNA小量提取试剂盒对青枯菌的基因组DNA进行抽提回收。

步骤如下：

(1)取细菌培养液1mL，10000rpm离心1min，尽量吸净上清。

(2)向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。

(3)向管中加入20μL Proteinase K溶液，混匀。

(4)加入220μL缓冲液GB，振荡15秒，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

(5)加入220μL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(8)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。

(9)重复操作步骤8。

(10)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

(12)收集到的青枯菌基因组DNA置于-20℃保存备用。

2目的基因质粒构建及获得(本步骤构建的目的基因质粒如图2所示)

(1)靶序列PCR扩增

以青枯菌的基因组DNA为PCR模板，对特异基因egl进行PCR扩增，将其扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳验证。

PCR扩增引物对：上游外引物F3：ACAGCAGGGTGCCCGT(SEQ ID NO.1)；下游外引物B3：CGTTGTGGCTCACCATCG(SEQ ID NO.2)。

(2)PCR产物的清洁纯化

经验证单一条带的PCR产物用Axygen公司的AxyPrep PCR清洁试剂盒抽提回收，步骤如下:

1)在PCR、酶切、酶标、或测序反应液中，加3个体积的Buffer PCR-A(若Bu fferPCR-A不足100μL，加至100μL)；混匀后，转移到制备管中，将制备管置于2mL离心管(试剂盒内提供)中，12000×g离心1min，弃滤液。

2)将制备管置回2mL离心管，加700μL Buffer W2，12000×g离心1min，弃滤液。

3)将制备管置于离心管中，将制备管置回2mL离心管，加400μL Buffer W2，12000×g离心1min。

4)将制备管置于洁净的1.5mL离心管(试剂盒内提供)中，在制备管膜中央加25-30μL Eluent或去离子水，室温静置1min。12000×g离心1min洗脱DNA。

(3)目的基因和质粒的双酶切

配置好目的基因和pUC57质粒(购自武汉擎科生物科技有限公司)的双酶切体系，在37℃下反应3小时。酶切反应结束后，使用AxyPrep PCR试剂盒进行清洁纯化。

表1双酶切反应体系

试剂	体积μL
		DNA	5(to1μg)
EcoRI	1
		HindIII	1
10XFastDigestbuffer	2
		DEPC水	11
Total	20

(4)目的基因与质粒的酶连

1)配置好如下酶连体系

表2酶连反应体系

在22℃下反应6h，保存于-20℃备用。

(5)转化至大肠杆菌

1)取出冻存于-80℃的DH5α大肠杆菌，于冰上解冻5min。

2)加入目的DNA，轻轻混匀后置于冰上保存30min。

3)将其转移到42℃水浴锅中热激45秒。

4)立即冰浴2min。

5)向离心管中加入500μL培养基，在37℃220rpm的摇床下进行复苏1小时。

6)取100μL涂布于带有氨苄青霉素抗性的平板中，37℃过夜培养。

(6)挑选阳性克隆子

1)挑取上述单菌落于含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃缓慢振荡培养4小时，以M13F(TGTAAAACGACGGCCAGT)和M13R(CAGGAAACAGCTATGACC)测序引物进行菌落PCR扩增。对扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳后紫外观察，将经PCR验证正确的阳性克隆送武汉擎科生物科技有限公司进行测序。

(7)阳性质粒提取

挑取上述单菌落于含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃缓慢振荡培养4小时，进行PCR扩增。扩增引物及扩增条件同前述最优反应条件。将经PCR确证的阳性克隆，接种于LB液体培养基，37℃，160rpm培养过夜。取每个菌株过夜培养液5mL，用赛默飞公司小量质粒提取试剂盒进行质粒抽提，试剂盒的具体操作步骤如下：

1)将收集的菌体重悬于250μL重悬液中。将细胞悬液转移至离心管中。菌体必须充分悬浮，可以通过涡旋及移液器枪头吹吸，直到没有细胞团残留。注：确保重悬液中已经加入RNase A。

2)向细胞重悬液中加入250μL裂解液，小心颠倒离心管4-6次以完全混匀，直到溶液变得黏稠且部分澄清。注：不能涡旋，以免剪切染色体DNA。混合时间不要超过5min，以免超螺旋质粒DNA变性。

3)加入350μL中和液，立即颠倒离心管4-6次以充分混匀。注：加入中和液后轻轻混匀，以避免细菌细胞碎片发生局部沉淀。加入中和液后，溶液应变浑浊。

4)离心5min以除去细胞碎片和染色体DNA。

5)将上清转移至试剂盒提供的GeneJET离心柱中，转移时注意不要吸入白色沉淀物质。

6)离心1min，倒掉收集管中的流穿液，将离心柱再次放入收集管中。

7)向GeneJET离心管中加入500μL漂洗液(首次使用时加入一定量的无水乙醇)，离心30-60秒，倒掉流穿液，将离心柱再次放入同一收集管中。

8)用500μL漂洗液重复步骤7)。

9)弃掉流穿液，再次离心1min以除去残留的漂洗液。该步骤在质粒制备中至为关键，避免制备的质粒中残留乙醇。

10)将GeneJET离心柱转移至新的1.5mL离心管中(试剂盒未提供)，向离心柱膜中心加入50μL洗脱液以溶解质粒DNA。注意枪头不触碰离心柱膜。室温下放置2min后离心2min。注：再次用洗脱液或水洗脱(可选)可提高10-20％的质粒产量。洗脱大于20kb的质粒或黏粒，需将洗脱液加热至70℃。

11)弃掉离心柱，将提纯的质粒DNA贮存于-20℃。

(7)阳性质粒浓度测定

打开Thermo Scientific NanoDrop One紫外分光光度计，选定稀释倍数为30倍进行测定，读取质粒DNA浓度。

(8)质粒数目换算及梯度稀释

阳性质粒测完浓度后，分别根据其所测浓度换算成质粒拷贝数目。质粒拷贝数目换算公式为：

(注：X为质粒浓度ng/μL；Y为目的产物碱基对数；N_A为阿伏伽德罗常数；2910为载体碱基对数；660为碱基平均分子量)。取已知浓度的质粒进行10倍梯度稀释。

3建立qPCR扩增体系

(1)qPCR扩增条件

qPCR具体反应体系为：2×qPCR premix 10μL，0.2μM的上游引物和下游引物F3/B3各1.0μL，模板DNA 1.0μL，加无核酸酶水补足20μL。

(2)在荧光定量PCR仪中按以下程序扩增：

预变性95℃30秒；95℃5秒，58℃15秒，72℃10秒，40个循环；按照默认程序进行熔解曲线分析。

(3)灵敏度检测

利用构建好的质粒进行10倍梯度稀释后作为模板进行qPCR扩增，其反应体系和反应程序如前所述。qPCR鉴定体系的灵敏度检测结果如图5所示，本步骤建立的qPCR的鉴定体系的灵敏度为8*10⁰拷贝数/μL质粒。

4.建立LAMP鉴定体系

(1)LAMP反应建立和优化

经过优化的反应体系为2.5μL Isothermal Amplification Buffer I，6mM Mg²⁺，320U/mL Bst 2.0DNA polymerase，1.6mM dNTPs，0.1μMF3和B3，0.8μM FIP和BIP，模板DNA1.0μL，加去核酸酶水补足至25μL。

反应条件：63℃扩增25min。

(2)灵敏度检测

利用构建好的质粒进行10倍梯度稀释后作为模板进行LAMP扩增其反应体系和反应程序如(1)所述。

如图4，LAMP鉴定体系的灵敏度检测结果显示，本发明中的LAMP的鉴定体系的灵敏度为8*10⁰拷贝数/μL质粒。

5.建立CRISPR/Cas12a-LAMP鉴定体系

(1)特异性crRNA DNA体外转录模板的制备

crRNA DNA体外转录所需的上游DNA单链和下游DNA单链设计如下：

上游DNA单链为T7启动子，即T7-Foward：TAATACGACTCACTATAGGG。

下游DNA单链设计上涵盖crRNA spacer区转录模板、crRNA repeat区转录模板、T7启动子互补序列，具体结构为：20bp spacer+21bp repeat+20bp T7启动子互补序列。

根据青枯菌egl基因保守区靶点序列设计并合成上游DNA单链：

CRRNA427F(SEQ ID NO.5)：

TAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTAAGTGTAGATGCAAGGATCCGGCGGCCGGT；

CRRNA427R(SEQ ID NO.6)：

ACCGGCCGCCGGATCCTTGCATCTACACTTAGTAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTATTA。

上述序列中，下划线表示T7启动子的序列。

具体操作示意图见图3。

采用退火的方式制备特异性crRNA的DNA体外转录模板，在PCR管中配置如下退火体系：

表3退火反应体系

在pcr仪中进行如下表所示反应程序：

表4退火反应程序

	环	温度	时间
				1	1	95℃	5min
2	40	95℃(-1℃/环)	1min
				3	1	55℃	30min
4	30	55℃(-1℃/环)	1min
				5		4℃	保持

退火完成的DNA双链在Nanodrop中测定其浓度，并于-20℃保存备用。

采用NEB生产的RNA体外转录试剂盒中的T7转录酶，在PCR管中配置转录体系如下：

表5T7体外转录生成crRNA体系

试剂	体积
		T7RNAPolymerase	2μL
NTPBufferMix	10μL
		DNA模板	2μL
DepcH<sub>2</sub>O	16μL
		总体积	30μL

将转录体系置于37℃培养箱中过夜孵育。用NEB生产的RNA纯化回收试剂盒进行crRNA的回收。回收的crRNA序列如下：

RS-egl-crRNA1(SEQ ID NO.7)：

UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCAAGGAUCCGGCGGCCGGU。

(2)CRISPR/Cas12a-LAMP检测体系的建立(图1)

以8*10⁰拷贝数/μL的质粒作为LAMP扩增的模板，于管底发生LAMP扩增反应。为避免热量传播，管底LAMP扩增反应覆盖20μL石蜡油。共10μL LAMP反应产物作为酶切底物，采用20μL的CRISPR/Cas12a反应体系对crRNA切割活性进行筛选。为避免LAMP扩增后开盖操作造成气溶胶传播，CRISPR/Cas12a反应体系预置在PCR管盖部，包含30nM的LbaCas12a，30nMcrRNA(SEQ ID NO.7)，3μL LAMP反应产物，3μL NEBuffer R2.1(10X)，0.8Μm FAM-BHQ标记的ssDNA(FAM-TTATT-BHQ)探针(SEQ ID NO.8)，用DEPC水补至25μL，加样完成后简短离心以混匀PCR反应管，并在37℃条件下进行20min的酶切。荧光信号由CFX96 Touch Real-TimePCR检测系统采集，有荧光信号即为阳性。

对13个样本，利用本发明的CRISPR/Cas12a-LAMP检测体系和传统qPCR进行检测，结果如表6。

表6

使用该方法对实验室保存的13个土壤常见菌株进行检测，其中前6份样品为青枯菌的不同菌株，7-13为其他土传致病菌，在使用LAMP法检测第10号样品时出现了假阳性，qPCR法和CRISPR/Cas12a-LAMP检测结果与样本的实际类型准确率为100％，证明本发明研究的方法有较好的重复性。

针对本发明中使用的三种方法重复性试验的检出率结果整理如表7。

表7

	qPCR法	LAMP法	CRISPR/Cas12a-LAMP法
				阳性检出率	100％	100％	100％
阴性检出率	100％	85.70％	100％

在使用本发明中三种检测方法对13个样品进行检测时,使用LAMP法检测出现了假阳性的情况,其阴性检出率为85.7％，而使用CRISPR/Cas12a-LAMP法则有效地解决了假阳性的问题。其阳性检出率和阴性检出率和传统qPCR法结果相同均为100％，证明该方法有较好的重复性，有较好的应用潜力。

6CRISPR/Cas12a-LAMP检测方法灵敏度分析

利用“2目的基因质粒构建及获得”构建好的质粒进行10倍梯度稀释后作为模板进行CRISPR/Cas12a-LAMP检测，其反应体系和反应程序如前所述。如图6，CRISPR/Cas12a-LAMP鉴定体系的灵敏度检测结果显示，本发明中的CRISPR/Cas12a-LAMP的鉴定体系的灵敏度为8*10⁰拷贝数/μL质粒。

7CRISPR/Cas12a-LAMP检测方法特异性分析

根据LAMP反应体系的最佳反应条件和CRISPR/Cas12a最佳切割反应条件下对青枯菌，罗伊斯乳杆菌、成团泛菌、枯草芽孢杆菌、赫伯斯芽孢杆菌、微小杆菌、杀香鱼假单胞菌等进行检测，用以验证该方法对青枯菌的特异性检测。

如图7所示，本发明中，经CRISPR/Cas12a-LAMP鉴定体系检测，有且仅有青枯菌菌检测产生荧光呈阳性，罗伊斯乳杆菌(Lactobacillus reus)、成团泛菌(Pantoeaagglomerans)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、赫伯斯芽孢杆菌(Bacillus herbersteinensis)、微小杆菌(Exiguobacterium)、杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas amygdal us)检测结果均呈阴性，CRISPR/Cas12a-LAMP监测体系特异性良好。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速检测青枯菌的方法和试剂盒

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acagcagggt gcccgt 16

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgttgtggct caccatcg 18

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agtgcaccgc cgccttcttg gcataccttg gcgacac 37

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggacatgct cttcgccacc cacagcgcgg cgttcac 37

<210> 5

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taatacgact cactataggg taatttctac taagtgtaga tgcaaggatc cggcggccgg 60

t 61

<210> 6

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

accggccgcc ggatccttgc atctacactt agtagaaatt accctatagt gagtcgtatt 60

a 61

<210> 7

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

uaauuucuac uaaguguaga ugcaaggauc cggcggccgg u 41

<210> 8

<211> 322

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gacggataga tgtagttgct cccgtaggtg cccggcaggc tgccctcccc gaactcggcg 60

ccggccaggc tgacgccgcg ccacagcagg gtgcccgtgc cctgcgccac ctggcatacc 120

ttggcgacac cggccgccgg atccttgcca aagaaggcgg cggtgcactg gcctgtgccg 180

gacatgctct tcgccaccca cgcgctgccg gcgccatagc gcaccgtgcg cgtgccgctc 240

accgtgaacg ccgcgctgtc cttggcgatg gtgagccaca acggcgagat cgaggtggtg 300

gcggccgtct tcagggtcgt gg 322

Claims

1.一种青枯菌的LAMP检测引物组，其特征在于，包括如SEQ ID NO.1所示的上游外引物F3、如SEQ ID NO.2所示的下游外引物B3、如SEQ ID NO.3所示的上游内引物FIP和如SEQ IDNO.4所示的下游内引物BIP。

2.一种基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速检测青枯菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的LAMP检测引物组、如SEQ ID NO.7所示的crRNA、Lba Cas12a和修饰荧光基团和淬灭基团的如SEQ ID NO.8所示的ssDNA探针。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光基团和淬灭基团为FAM和BHQ基团。

4.一种非疾病诊断目的的基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速检测青枯菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测样品中的基因组DNA；

(2)以所述基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的LAMP检测引物组进行LAMP扩增；

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述LAMP扩增反应的反应体系为：2.5μL Isothermal Amplification Buffer I，6mM Mg²⁺，320U/mL Bst 2.0 DNApolymerase，1.6mM dNTPs，0.1μM F3和B3，0.8μM FIP和BIP，模板DNA 1.0μL，加去核酸酶水补足至25μL。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述LAMP扩增反应的反应条件为：63℃扩增25min。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述荧光基团和淬灭基团为FAM和BHQ基团。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a反应体系具体为：30nM的LbaCas12a，30nM crRNA，3μL LAMP扩增产物，3μL 10X NEBuffer R2.1，0.8Μm FAM-BHQ标记的ssDNA，用DEPC水补至25μL。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述扩增产物在CRISPR/Cas12a反应体系中的反应温度为37℃。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述扩增产物在CRISPR/Cas12a反应体系中的反应时间为20min。