CN112210614A

CN112210614A - 检测剑麻紫色卷叶病植原体的实时荧光定量lamp引物组及其应用

Info

Publication number: CN112210614A
Application number: CN202011226064.5A
Authority: CN
Inventors: 吴伟怀; 易克贤; 鹿鹏鹏; 王桂花; 贺春萍; 梁艳琼; 习金根; 黄兴; 郑金龙; 谭施北
Original assignee: CATAS Environment and Plant Protection Institute
Current assignee: CATAS Environment and Plant Protection Institute
Priority date: 2020-11-05
Filing date: 2020-11-05
Publication date: 2021-01-12
Anticipated expiration: 2040-11-05
Also published as: CN112210614B

Abstract

本发明公开了检测剑麻紫色卷叶病植原体的实时荧光定量LAMP引物组及其应用。紫色卷叶病植原体的LAMP引物组，由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸以及序列表中序列4所示的核苷酸组成。本检测方法具有特异性强、灵敏度高、易于操作、结果可靠的LAMP分子检测方法。

Description

检测剑麻紫色卷叶病植原体的实时荧光定量LAMP引物组及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种检测剑麻紫色卷叶病植原体实时荧光定量LAMP引物对、试剂盒及检测方法。

背景技术

剑麻紫色卷叶病是一种毁灭性的病害，该病害给剑麻产业可造成巨大的损失。该病于2001年11月在海南昌江青坎农场首先发现，不到半年时间便迅速蔓延全场及周边农场，2003年1～2月份在广东省东方剑麻集团公司属下东方红、金星农业公司和国有火炬、五一等农场及周边农村剑麻发生零星病株，此后该病逐步蔓延到整个广东省。据不完全统计，截至2018年，仅广东湛江地区剑麻紫色卷叶病发病田块达10万亩，因发病严重而淘汰的剑麻种植面积高达3万亩，整个湛江地区的发病率达到30％，给广东省的剑麻产业造成了巨大的损失。本研究室经过多年的研究，已成功从剑麻紫色卷叶病株中检测出植原体，并通过新菠萝灰粉蚧传毒，首次证明了植原体为剑麻紫色卷叶病病原，新菠萝灰粉蚧为其传播媒介。

植原体与世界上的许多植物病害有关，引起多种重要作物的病害。如我国发生的枣疯病、小麦蓝矮病、槟榔黄化病以及国外发生的葡萄黄化病、椰子致死黄化病等[徐启聪(2009)中国各地不同枣树品种上枣疯病植原体的PCR检测及分子变异分析.微生物学报,49(11):1510-1519；Laimer M(2009)Resistance to viruses,phytoplasmas and theirvectors in the grapevine in Europe.a review.J.Plant Pathol.,91(1):7-23；Wu YF(2010)Identification of the phytoplasma associated with wheat blue dwarfdisease in China.Plant Dis.,94(8):977-985；Yang Y(2016)Molecularidentification of a 16SrII-A group-related phytoplasma associated withcinnamon yellow leaf disease in China.J.Phytopathol.,164(1):52-55；Gurr GM(2016)Coconut lethal yellowing diseases：a phytoplasma threat to palms ofglobal economic and social significance.Front.Plant Sci.,7:21.]。虽然，近年的研究表明可对植原体进行体外培养，但其培养条件极其苛刻[Contaldo N(2012)Axenicculture of plant pathogenic phytoplasmas.Phytopathol.Mediterr.,51(3)：607–617；Contaldo N(2016)Development and evaluation of different complex media forphytoplasma isolation and growth.J.Microbiol.Meth.,127:105–110.]多数实验室很难获得植原体的纯培养。因此，不能像其他的原核或真核生物一样采用传统的分离培养法获得纯培养后，对植原体进行系统的鉴定和分类等研究。因此，建立一种行之有效的检测方法，对寄主植物/昆虫媒介中植原体进行鉴定与监测，这是开展植原体病害病理学、流行学及防治等研究工作必不可少的第一步[范国权(2015)植原体病害研究进展.黑龙江农业科学,(11):148-153；王洁(2017)柿树带化病相关植原体的形态及分子鉴定.植物生理学报,53(2)：219–226；Li S(2015)Occurrence and identification of a new vector of riceorange leaf phytoplasma in South China.Plant Dis.99:1483-1487；López-Romero JC(2018)Biological activities of Agave by-products and their possibleapplications in food and pharmaceuticals.J.Sci.Food Agric.,2018,98:2461–2474.]。

传统上植原体的分类主要基于保守性较高的16S rDNA序列分析和基于计算机模拟限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析。根据IRPCM规定，当植原体株系与已确定种的16S rDNA序列相似度低于97.5％，即可确定为新种。根据16S rDNA的序列特征和限制性片段长度多态性(RFLP)，已将植原体划分为28个组和若干亚组。然而16S rDNA的高度保守性不利于亲缘关系较近的亚组间划分，研究中常依据核糖体蛋白(rp)基因、延伸因子(tuf)基因、16S～23S间隔区等核苷酸序列变异较大的区域进行亚组的分类。目前，植原体的检测方法有电子显微镜检测法、血清学检测法、核酸杂交检测法、PCR检测法。电子显微镜检测法样品制备繁琐，成本高；血清学检测法中的抗血清制备较难，抗体易于寄主产生交叉反应；核酸杂交检测法中由于植原体在部分木本植物体内含量低,许多植原体纯化极为困难。

LAMP(loop-mediated isothermal amplification；环介导等温扩增)技术是日本荣研株式会发明的一种新的核酸扩增技术[Notomi T(2000)Loop-mediated isothermalamplification of DNA.Nucleic Acids Research,28:e63]。LAMP技术的基本原理是基于靶基因3’端的F3c、F2c和Flc区以及5’端的Bl、B2和B3区等6个特定区域设计两对特异性引物(分别为一对内引物和一对外引物)来识别目的靶基因的六个特定区域，所以该技术具有特异性强的特点。并且LAMP核酸扩增是利用DNA链置换聚合酶(BstDNA polymerase)在恒温条件下对靶基因扩增在等温条件下进行，仅需要水浴锅便可满足反应要求，其产物可以用肉眼直接观察或用浊度仪对其进行半定量的实时检测分析，也可以在反应体系中加入DNA染料进行可视化判断。然而在LAMP反应中焦磷酸镁沉淀在少量的情况下，肉眼观测容易受到干扰。因此近些年，实时荧光定量为LAMP发展方向之一。不过，LAMP检测技术设计效果优异的引物是关键，引物设计的不合适，效果也很难达到预期效果。目前还未见有关LAMP检测技术应用于剑麻紫色卷叶病病原检测的。总之，目前，迫切需要建立一种简便、快速、且灵敏的紫色卷叶病植原体实时荧光定量LAMP方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有植原体通用引物在检测剑麻紫色卷叶病相关植原体时存在大量非特异性条带，以及大量假阳性序列的技术缺陷问题，为了更加快速、准确、实用地检测剑麻紫色卷叶病植原体。本发明提供一组检测紫色卷叶病植原体特异性实时荧光定量LAMP分子检测引物，以及特异性强、灵敏度高、易于操作、结果可靠的LAMP分子检测方法。

本发明首先提供一组用于准确、高效检测紫色卷叶病植原体的LAMP引物组，其特征在于，由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸组成。

所述引物组中的外侧正向引物F3的序列如序列表中序列1所示，外侧反向引物B3序列如序列表中序列2所示，内侧正向引物FIP的序列如序列表中序列3所示，内侧反向引物BIP的序列如序列表中序列4所示。具体地，所述引物组的序列如下所示：

外侧正向引物F3：CCACGCCGTAAACGATGAG(序列表中序列1)；

外侧反向引物B3：GCAGAAGCATGTCAAGACCT(序列表中序列2)。

内侧正向引物FIP：

GCGTACGTACTACTCAGGCGGAACGTTGGGTAAAACCAGTGT

(序列表中序列3)；

内侧反向引物BIP：

AAGGAATTGACGGGACTCCGCGGTTTTTCGGGTACCTTCGA

(序列表中序列4)。

本发明的第二个方面是提供一种用于快速检测剑麻紫色卷叶病植原体的试剂盒，其包含本发明的第一个方面所述的引物组。即本发明的第二个方面的试剂盒中包含具有序列表中序列1、序列表中序列2、序列表中序列3以及序列表中序列4所示的核苷酸序列的引物组。

本发明的第三个方面是提供如第一个方面所述的引物组或本发明第二个方面所述的试剂盒在高效检测剑麻紫色卷叶病植原体中的应用。

本发明的第四个方面是提供一种用于高效检测剑麻紫色卷叶病植原体的实时荧光定量LAMP方法，该方法包括使用本发明第一个方面所述的引物组或者本发明第二个方面所述的试剂盒中的引物组进行LAMP扩增的步骤。

进一步地，所述方法包括以下步骤：

步骤1，从样品中提取DNA；

步骤2，用第一个方面所述的引物组或者本发明第二个方面所述的试剂盒中的引物组进行实时荧光定量LAMP扩增，得到扩增产物；

步骤3，通过QuantStudio 6Flex实时荧光定量仪进行检测，并进行实验有效性判定。检测结果如无Ct值且无典型的扩增曲线，则表示样品中不含有剑麻紫色卷叶病植原体；如观察到Ct值≤35.0并出现典型的扩增曲线，表示样品中含有剑麻植原体(Phytoplasma)。

本发明中，提取待测样品的基因组DNA的方法不受特别限制，可以采用任何已知的基因组DNA提取方法或试剂盒进行。

本发明中，将所述待测样品的基因组DNA进行LAMP扩增的条件不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，所述的LAMP扩增反应体系为25μL：ddH₂O10.25μL；10×Bst-DNAPolymerase Buffer 2.5μL(1×Bst-DNA Polymerase Buffer:20mM Tris-HCl，10mM(NH4)₂SO₄，50mM KCl，2mM MgSO₄，0.1％Tween-20，pH8.8@25℃)；10mM dNTP 3.5μL；5μM的F3(序列1所示的核苷酸)和B3(序列表中序列2所示的核苷酸)引物各1μL；20μM的FIP(序列表中序列3所示的核苷酸)和BIP(序列表中序列4所示的核苷酸)引物各1.5μL；100mM Mg²⁺1.25μL，Bst2.0DNA Polymerase 0.5μL；SYTO-9绿色荧光核酸染料1μL；20～30ng/μL的DNA模板1μL。

所述环介导等温扩增具体在63℃条件下进行。

本发明的引物组是基于实验室自测剑麻紫色卷叶病植原体16SrDNA序列与剑麻植株中假阳性条带序列进行多重比较而筛选出来的多态性丰富区域，从而设计LAMP引物。

实验证明，在本发明中，对所述一种检测剑麻植原体(Phytoplasma)的LAMP试剂盒及其专用引物组能特异性的检测剑麻植原体，而从其它供试菌株DNA中不能检测出任何条带，如剑麻斑马纹病菌(Phytophthora nicotianae)、剑麻茎腐病菌(Aspergilus niger)。根据本发明的一些具体示例，本发明提供一种检测剑麻植原体(Phytoplasma)的LAMP试剂盒及其专用引物组对剑麻植原体(Phytoplasma)基因组DNA的最小检测量为1fg，比普通PCR检测方法的灵敏度高100倍。具有高度的灵敏度和特异性，符合日常检测的要求。同时，通过本发明的检测引物可以缩短对剑麻植原体(Phytoplasma)进行鉴定的时间，较快地鉴定出植原体(Phytoplasma)，从而克服传统鉴定方法步骤繁琐、鉴定周期长、存在污染等问题。使用本发明的引物组进行检测，具有灵敏度高、特异性强的特点，且本发明的检测方法具有高效、快速和敏感度高的优点，特别适合于批量检测。

附图说明

图1为本发明的引物组设计的具体位置。

图2为本发明提供的实时荧光定量LAMP检测剑麻紫色卷叶病植原体(Phytoplasma)体系优化。

图3为本发明提供的检测植原体(Phytoplasma)实时荧光定量LAMP引物组特异性检测的结果。1:剑麻紫色卷叶病病株；2:剑麻斑马纹病菌；3:剑麻茎腐病菌；4:咖啡露湿拟漆斑菌；5:咖啡棕榈拟盘多毛孢菌；6:咖啡腐皮镰孢菌；7:咖啡炭疽病菌；8:甘蔗赤腐病菌；9:甘蔗黑穗病菌；10:水稻稻瘟病菌；11:水稻细菌性条斑病菌；12:枯草芽孢杆菌；CK:ddH₂O。

图4为本发明提供的引物组灵敏度检测的结果

CK:H₂O；1:1pg/μL；2:100fg/μL；3:10fg/μL；4:1fg/μL；5:100ag/μL。

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进步一步地说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1、检测剑麻紫色卷叶病植原体(Phytoplasma)的实时荧光定量LAMP组引物制备

1、引物设计：

根据本实验从紫色卷叶病病株中克隆所获得植原体(Phytoplasma)16Sr DNA序列(序列表中序列5)和剑麻植株中假阳性序列进行多重比较，选择多态性丰富的区域进行引物设计。利用在线软件Primer-Primer Explore(Fujitsu Ltd.,Toky,Japan)(http://primer explorer.jp/e/)围绕特异性区域及其侧翼序列进行引物设计。

设计本发明的引物组，为：

F3上游引物序列：CCACGCCGTAAACGATGAG(自序列表中序列5的5’端第657-669位核苷酸，即序列表中序列1)；

B3下游引物序列为：GCAGAAGCATGTCAAGACCT(自序列表中序列5的5’端第825-844位核苷酸，即序列表中序列2)；

FIP引物序列＝F1C(自序列表中序列5的5’端第717-739位核苷酸)+F2(自序列表中序列5的5’端第676-695位核苷酸)：GCGTACGTACTACTCAGGCGGAACGTTGGGTAAAACCAGTGT

(序列表中序列3)；

BIP引物序列＝B1C(自序列表中序列5的5’端第752-772位核苷酸)+B2(自序列表中序列5的5’端第800-819位核苷酸的反向互补序列)AAGGAATTGACGGGACTCCGCGGTTTTTCGGGTACCTTCGA

(序列表中序列4)。

上述引物设计的具体位置详见图1。

2、引物合成

将设计好的上游引物F3、B3、FIP以及BIP引物，委托英潍捷基(上海)贸易有限公司广州合成部合成。

本发明的荧光实时定量LAMP检测的原理是在LAMP扩增反应体系中加入SYTO-9绿色荧光核酸染料，并通过QuantStudio 6Flex实时荧光定量仪观察，将实时荧光定量与LAMP扩增相结合，从而达到检测效果可视化。

实施例2、实时荧光定量LAMP检测剑麻植原体(Phytoplasma)体系优化

利用实施例1制备所得引物组，以剑麻紫色卷叶病植原体质粒DNA为模板进行四因素、四水平正交试验(表1，表2)。

将上述25μL LAMP反应体系迅速置于63℃下进行实时荧光定量LAMP反应。其中体系具体如下：

通过QuantStudio 6Flex实时荧光定量仪进行检测，通过观察扩增曲线可判断LAMP反应结果：检测结果如无Ct值且无典型的扩增曲线，则表示样品中不含有剑麻紫色卷叶病植原体；如观察到Ct值≤35.0并出现典型的扩增曲线，表示样品中含有剑麻植原体(Phytoplasma)。结果如图2，在16种组合(表2所示)中，组合1、2、3、4、12、13和15均未出现有效的扩增。而组合7、14、15的Ct值大于35。从扩增曲线可以看出，组合5、6、8、9和11的扩增效率不及组合10，同时，组合10也具有良好的重复性。可见，组合10为最佳反应体系。

因此，确定本发明的LAMP扩增的反应体系为25μL，具体如下：

实施例3：检测剑麻紫色卷叶病植原体(Phytoplasma)的实时荧光定量LAMP引物组的特异性

利用实施例1制备所得引物组，以剑麻紫色卷叶病病株，剑麻斑马纹病菌(Phytophthora nicotianae)，剑麻茎腐病菌(Aspergilus niger)，咖啡露湿拟漆斑菌(Paramyrothecium roridum)，咖啡棕榈拟盘多毛孢(Pestalotiopsis trachicarpicola)，咖啡腐皮镰孢菌(Fusarium solani)，咖啡炭疽病菌(Coletotrichum gloeosporioides)，甘蔗赤腐病菌(Coletotrichum falcatum)，甘蔗黑穗病菌(Ustilago scitaminea)，水稻稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)，水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzaepv.Oryzicola)，枯草芽孢杆菌(Bacilus subtilis)DNA进行LAMP反应，分析本发明所提供的引物组的特异性。

采用DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN公司，德国)提取上述剑麻紫色卷叶病病株样品的DNA。采用真菌DNA提取试剂盒(E.Z.N.A Fungal DNA kit,Omega bio-tek)提取剑麻斑马纹病菌(Phytophthora nicotianae)、剑麻茎腐病菌(Aspergilus niger)、咖啡露湿拟漆斑菌(Paramyrothecium roridum)、咖啡棕榈拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsistrachicarpicola)、咖啡腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、咖啡炭疽病菌(Coletotrichumgloeosporioides)、甘蔗赤腐病菌(Coletotrichum falcatum)、甘蔗黑穗病菌(Ustilagoscitaminea)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)菌株菌丝体的DNA。而采用细菌DNA提取试剂盒(Bacterial DNA kit,Omega bio-tek)提取试剂盒提取水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.Oryzicola)、枯草芽孢杆菌(Bacilus subtilis)基因组DNA。采用常规方法对上述材料进行分子鉴定。

LAMP反应体系为25μL，具体如下：

置于63℃下进行实时荧光定量LAMP反应。

通过QuantStudio 6Flex实时荧光定量仪进行检测，检测结果如无Ct值且无典型的扩增曲线，则表示样品中不含有剑麻紫色卷叶病植原体；如观察到Ct值≤35.0并出现典型的扩增曲线，表示样品中含有剑麻植原体(Phytoplasma)。结果如图3，只有模板为紫色卷叶病病株DNA时，可见一条拐点清晰、具有明显指数期的扩增曲线，且Ct值<35.0；反之，其它非紫色卷叶病病株DNA样本扩增出的均为一条平直线。因此表明，所建立的剑麻紫色卷叶病植原体实时荧光LAMP反应具有特异性。

实施例4：检测剑麻紫色卷叶病植原体的实时荧光定量LAMP引物组的灵敏性

剑麻紫色卷叶病植原体16S rDNA重组质粒的构建及提取

利用植原体通用引物(R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2)对剑麻紫色卷叶病病株DNA进行巢式PCR扩增，其中，第一轮PCR扩增，扩增引物R16mF2/R16mR1(R16mF2：CATGCAAGTCGAACGGA/R16mR1：CTTAACCCCAATCATCGAC)，反应体系如下：

第一轮PCR扩增的反应条件为：94℃3分钟；94℃30秒，52℃30秒，72℃1分钟，35个循环；72℃10分钟；4℃保存。

第一轮扩增完成后，将产物稀释10倍，并利用R16F2n/R16R2引物(R16F2n：GAAACGACTGCTAAGACTGG/R16R2：TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG)开展巢式扩增；

其中，巢式扩增的反应体系如下：

将扩增所获得的与预期大小一致以及相差不大的所有条带进行切胶回收。回收产物连接pEASY-T1载体，并于大肠杆菌克隆。

利用pEASY-T1 Cloning Kit对扩增产物进行克隆，具体操作如下：

(1)加入4μL PCR产物与1μL T1载体混合，轻弹混匀，瞬时离心后，25℃连接15min，结束后将其在冰上。

(2)待Trans-T1感受态细胞即将解冻时，取50μL感受态细胞与连接产物轻轻混合，冰浴30min。

(3)从冰上取下离心管，42℃水浴锅中热激60s，再迅速插在冰上2min，于无菌条件下加入250μL的LB液体培养基(不加抗生素)，200rpm、37℃培养1h。

(4)取8μL 500mmol/L的IPTG以及40μL 20mg/mL的X-gal均匀混合后涂抹在新鲜的LB平板中，培养箱中37℃倒置30min。

(5)将培养好的菌液在无菌操作条件下取150μL均匀涂抹在LB平板上，37℃倒置培养过夜。

(6)挑取白色菌落至5μL无菌水中作为模板DNA，进行阳性克隆鉴定。然后在无菌超净工作台上，挑单菌落于已添加AMP的LB液体培养基中，37℃、180rpm的摇床培养12-16h。

(7)将菌液加入2ml离心管中，在室温下10000rpm离心1min，弃上清，保留下部沉淀。直至将菌液离心完。

(8)加入250μL SolutionⅠ(已经提前加入RNase)，涡旋混匀。然后加入250μLSolutionⅡ，上下轻轻颠倒混匀数次。

(9)加入350μL的SolutionⅢ，上下颠倒混匀直至形成白色絮状沉淀。室温下13000rpm离心10min。

(10)转移上清液至装有2mL收集管的Hi Bind DNA柱子中。室温下10000rpm离心1min，弃去滤液。加入500μL HBC Buffer，室温下10000rpm离心1min，丢掉滤液。

(11)加入700μL的DNA Wash Buffer，室温下10000rpm离心1mim。重复此步骤1次。

(11)弃滤液，15000rpm下空管离心2min。将柱子转移到1.5mL离心管，加入60μL已经提前预热至65℃的Elution Buffer或dd H20，静至2min，13000rpm离心1min，洗脱质粒DNA。对获得的质粒DNA进行测序验证，鉴定结果含有序列5所示的核苷酸的重组质粒，即为紫色卷叶病菌植原体16S rDNA质粒DNA。

利用实施例1制备所得引物组，将剑麻紫色卷叶病植原体16S rDNA质粒浓度调整为1g/μL，按10的数量级逐步向下稀释至100ag/μL作为模板，进行实时荧光定量LAMP扩增，分析本发明所提供的引物组的灵敏度。通过ABI QuantStudio 6Flex实时荧光定量仪进行检测。结果见图4，当待测样品反应液中模板DNA浓度大于或等于1fg/μL时会出现扩增曲线，结果表明，本发明引物组可特异性地检测剑麻紫色卷叶病植原体基因组DNA浓度≥1fg/μL。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110>中国热带农业科学院环境与植物保护研究所

<120>检测剑麻紫色卷叶病植原体的实时荧光定量LAMP引物组及其应用

<130>WHOI201067

<160> 5

<170>Patent-In 3.5

<210> 1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列（Artificial sequence）

<400>1

ccacgccgta aacgatgag 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

gcagaagcat gtcaagacct 20

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

gcgtacgtac tactcaggcg gaacgttggg taaaaccagt gt 42

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

aaggaattga cgggactccg cggtttttcg ggtaccttcg a 41

<210> 5

<211> 1246

<212> DNA

<213>剑麻紫色卷叶病（Phytoplasma）

<400> 5

gaaacgactg ctaagactgg ataggagaca agaaggcatc ttcttgtttt taaaagacct 60

agcaataggt atgcttaggg aggagcttgc gtcacattag ttagttggtg gggtaaaggc 120

ctaccaagac tatgatgtgt agccgggctg agaggttgaa cggccacatt gggactgaga 180

cacggcccaa actcctacgg gaggcagcag tagggaattt tcggcaatgg aggaaactct 240

gaccgagcaa cgccgcgtga acgatgaagt atttcggtac gtaaagttct tttattaggg 300

aagaataaat gatggaaaaa tcattctgac ggtacctaat gaataagccc cggctaacta 360

tgtgccagca gccgcggtaa tacatagggg gcaagcgtta tccggaatta ttgggcgtaa 420

agggtgcgta ggcggttaaa taagtttatg gtctaagtgc aatgctcaac attgtgatgc 480

tataaaaact gtttagctag agtaagatag aggcaagtgg aattccatgt gtagtggtaa 540

aatgcgtaaa tatatggagg aacaccagta gcgaaggcgg cttgctgggt ctttactgac 600

gctgaggcac gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta 660

aacgatgagt actaaacgtt gggtaaaacc agtgttgaag ttaacacatt aagtactccg 720

cctgagtagt acgtacgcaa gtatgaaact taaaggaatt gacgggactc cgcacaagcg 780

gtggatcatg ttgtttaatt cgaaggtacc cgaaaaacct caccaggtct tgacatgctt 840

ctgcaaagct gtagaaacac agtggaggtt atcagttgca caggtggtgc atggttgtcg 900

tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttattgttag 960

ttaccagcac gtaatggtgg ggactttagc aagactgcca gtgataaatt ggaggaaggt 1020

ggggacgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacaaacgtg atacaatggc 1080

tgttgcaaag ggtagctgaa gcgcaagttt ttggcgaatc tcaaaaaaac agtctcagtt 1140

cggattgaag tctgcaactc gacttcatga agttggaatc gctagtaatc gcgaatcagc 1200

atgtcgcggt gaatacgttc tcggggtttg tacacaccgc ccgtca 1246

Claims

1.检测紫色卷叶病植原体的LAMP引物组，由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸以及序列表中序列4所示的核苷酸组成。

2.一种检测剑麻紫色卷叶病植原体的试剂盒，包括权利要求1所述的LAMP引物组。

3.根据权利要求2所示的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括LAMP反应试剂。

4.权利要求1所述的LAMP引物组以及权利要求2或3所述的试剂盒在检测剑麻紫色卷叶病植原体中的应用。

5.检测剑麻紫色卷叶病植原体的方法，包括下述步骤：

1)提取待测样品DNA；所述待测样品为剑麻紫色卷叶病病株组织总DNA；

2)以待测样品DNA为模板，用权利要求1所述的LAMP引物组进行实时荧光定量LAMP扩增；

3)通过QuantStudio 6Flex实时荧光定量仪进行检测，并进行实验有效性判定；检测结果如无Ct值且无典型的扩增曲线，则表示样品中不含有剑麻紫色卷叶病植原体；如观察到Ct值≤35.0并出现典型的扩增曲线，表示样品中含有剑麻紫色卷叶病(Phytoplasma)。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述的LAMP扩增反应体系为25μL：ddH₂O 10.25μL；10×Bst-DNA Polymerase Buffer2.5μL(1×Bst-DNA Polymerase Buffer:20mM Tris-HCl，10mM(NH4)₂SO₄，50mM KCl，2mMMgSO₄，0.1％Tween-20，pH8.8@25℃)；10mM dNTP 3.5μL；5μM的序列1所示的核苷酸和5μM的序列表中序列2所示的核苷酸各1μL；20μM的序列表中序列3所示的核苷酸和20μM的序列表中序列4所示的核苷酸各1.5μL；100mM Mg²⁺1.25μL，Bst 2.0DNA Polymerase 0.5μL；SYTO-9绿色荧光核酸染料1μL；20～30ng/μL的DNA模板1μL。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：实时荧光定量LAMP扩增在63℃条件下进行。