CN115786568A - 一种感染剑麻紫色卷叶病相关植原体的媒介方法及其应用 - Google Patents
一种感染剑麻紫色卷叶病相关植原体的媒介方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115786568A CN115786568A CN202211242071.3A CN202211242071A CN115786568A CN 115786568 A CN115786568 A CN 115786568A CN 202211242071 A CN202211242071 A CN 202211242071A CN 115786568 A CN115786568 A CN 115786568A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sisal
- phytoplasma
- new
- leaves
- healthy
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种感染剑麻紫色卷叶病相关植原体的媒介方法。该方法包括无植原体健康剑麻苗的筛选、经南瓜饲养脱毒获得不携带植原体的新菠萝灰粉蚧、从待传植原体发病剑麻植株叶片基部剪取布满新菠萝灰粉蚧的叶片，经特异性巢式PCR方法检测确认携带有植原体后，置于健康剑麻苗叶片基部处，待其自主迁移至接种剑麻植株，隔离培养4～6个月，即可获得经新菠萝灰粉蚧介导传播获得携带植原体的剑麻植株，其传毒率高达88.89％。本发明方法首次建立了一种感染剑麻紫色卷叶病相关植原体的媒介方法，为研究剑麻紫色卷叶病相关植原体的致病机理，以及开展抗紫色卷叶病剑麻种质筛选、鉴定、评价等工作提供技术指导。此方法具有操作性强、效率高、结果可靠等特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种感染剑麻紫色卷叶病相关植原体的媒介方法及其应用。
背景技术
紫色卷叶病是剑麻生产中的一种毁灭性病害，该病害给剑麻产业造成巨大的损失。该病最初于2001年11月份在海南昌江青坎农场(私营企业)麻区零星发生，2002年4月该病便迅速蔓延全场及周边农村麻园，严重田块发病率达80％，造成严重失收；2006年该病又蔓延至广东雷州北和镇个体麻区，2007年便蔓延至广东湛江农垦徐闻、雷州麻区及其周边农村麻园，接着又迅速蔓延至广东廉江及揭阳农垦麻区，2007年10月以后该病大爆发，导致湛江麻区累计淘汰麻田4000hm2。近年该病又进一步蔓延，2018年11月该病在广西钦州市张黄镇东方农场麻区零星出现，2019年4月后该地区周围部分农场已经开始逐渐暴发。该病造成的危害非常严重，仅海南、广东因该病危害已造成剑麻淘汰6666多hm2，已成为制约我国剑麻产业发展的瓶颈问题[黄标(2015).紫色卷叶病病因·病原鉴定和抗性苗应用研究.安徽农业科学，2015，43(34):177-179；黄标(2017)几种营养液药液及脱毒粉蚧对剑麻紫色卷叶病的影响.热带农业科学，2017，37(7)：41–46]。
经本研究组研究证实植原体为剑麻紫色卷叶病病原。植原体为难培养植物病原物，属于细菌界(Bacteria)硬壁菌门(Firmicutes)柔膜菌纲(Mollicutes)非固醇菌原体目(Acholeplasmatales)非固醇菌原体科(Acholeplasmataceae)植原体暂定属(CandidatusPhytoplasma)。植原体无细胞壁，形态多样，大小为80～800μm[Doi M,(1967).Mycoplasma or PLT Mycoplasma or PLT group like organism found in the phloemelements of plants infected with mulberry dwarf,potate witches’broom,asteryellow,or paulownias,broom.Ann Phytopathol Soc Jpn,33:259–266]。定殖于植物韧皮部筛管以及刺吸式介体昆虫的肠道、淋巴、唾腺等组织内，植原体通常在植物体中含量较低，难以人工培养，且分布不均匀。
植原体与世界上的许多植物病害有关，引起多种重要作物的病害。如我国发生的枣疯病、小麦蓝矮病、槟榔黄化病以及国外发生的葡萄黄化病、椰子致死黄化病等[徐启聪(2009)中国各地不同枣树品种上枣疯病植原体的PCR检测及分子变异分析.微生物学报,49(11):1510-1519；Laimer M(2009)Resistance to viruses,phytoplasmas and theirvectors in the grapevine in Europe.a review.J.Plant Pathol.,91(1):7-23；Wu YF(2010)Identification of the phytoplasma associated with wheat blue dwarfdisease in China.Plant Dis.,94(8):977-985；Yang Y(2016)Molecularidentification of a 16SrII-A group-related phytoplasma associated withcinnamon yellow leaf disease in China.J.Phytopathol.,164(1):52-55；Gurr GM(2016)Coconut lethal yellowing diseases：a phytoplasma threat to palms ofglobal economic and social significance.Front.Plant Sci.,7:21.]。虽然，近年的研究表明可对植原体进行体外培养，但其培养条件极其苛刻[Contaldo N(2012)Axenicculture of plant pathogenic phytoplasmas.Phytopathol.Mediterr.,51(3)：607–617；Contaldo N(2016)Development and evaluation of different complex media forphytoplasma isolation and growth.J.Microbiol.Meth.,127:105–110.]，多数实验室很难获得植原体的纯培养。因此，不能像其他真核生物一样采用传统的分离培养法获得纯培养后，对植原体进行室内离体操作。
植原体是一种主要依赖于昆虫媒介传播的植物病原菌。通常通过叶蝉、木虱、飞虱、蜡蝉、蝽等具刺吸式口器的昆虫传播[Chen WY(2011)Detection and identificationof a new phytoplasma associated with periwinkle leaf yellowing disease inTaiwan.Australas.Plant Pathol.,40:476–483.Kosovac A(2019)Role of plant-specialized Hyalesthes obsoletus associated with Convolvulus arvensis andCrepis foetida in the transmission of‘Candidatus Phytoplasma solani’-inflicted bois noir disease of grapevine in Serbia.Eur.J.Plant Pathol.,153:183–195.Quaglino F(2019)Identification and ecology of alternative insectvectors of‘Candidatus Phytoplasma solani’to grapevine.Sci.Rep.,9:19522.]。自从新菠萝灰粉蚧入侵我国以来，国内关于新菠萝灰粉蚧研究主要集中风险性分析[覃振强(2010)外来入侵害虫新菠萝灰粉蚧在中国的风险性分析.中国农业科学，43(3)：626-631],潜在地理分布[傅辽(2012)新菠萝灰粉蚧在中国目前及未来的潜在地理分布研究.植物检疫，26(4)：1-5.]、不同寄主、温度对其生长发育与繁殖的影响[胡钟予(2017)温度对新菠萝灰粉蚧生长发育和繁殖的影响.应用生态学报，28(2):651-657.)、天敌利用[赵家流(2015)丽草蛉生物学特性与防控新菠萝灰粉蚧效果研究.安徽农业科学，43(30):14-16，19.]、分子鉴定[马光昌(2017)快速鉴定新菠萝灰粉蚧的分子标记技术.环境昆虫学报，39(4):893-897.]；黄蓬英(2017)利用28SrDNA种特异引物鉴定新菠萝灰粉蚧.应用昆虫学报，54(4)：646-651.]、防控药剂[莫秀芳(2019)新烟碱类杀虫剂对新菠萝灰粉蚧的毒力.环境昆虫学报，2019，41(6):1375－1379.]等方面做了许多工作。而关于新菠萝灰粉蚧作为植原体传播媒介的相关方法研究国内外仍未见报道。正是因如此，严重阻碍了抗紫色卷叶病剑麻品种的筛选、鉴定、评价，以及培育等一系列的工作。因此，建立一种操作性强、效率高、结果可靠的剑麻紫色卷叶病相关媒介传播方法，对于深入研究剑麻紫色卷叶病相关植原体的致病机理，阐明剑麻-植原体-新菠萝灰粉蚧互作机制，以及开展抗紫色卷叶病剑麻种质筛选、鉴定、评价等研究工作是必不可少的。
发明内容
本发明的目的是提供一种感染剑麻紫色卷叶病相关植原体的媒介方法。
多年的调查发现，新菠萝灰粉蚧的暴发与紫色卷叶病的发生存在明显的相关性，一般新菠萝灰粉蚧暴发的麻区常伴有紫色卷叶病的大面积流行，而新菠萝灰粉蚧控制较好的麻区则很少发生。经本研究组研究证实植原体为剑麻紫色卷叶病病原，新菠萝灰粉蚧则为其传播媒介。
基于此，本发明提供的一种感染剑麻紫色卷叶病相关植原体的媒介方法，包括如下步骤：
(1)无植原体的健康剑麻苗的筛选：于无紫色卷叶病的剑麻苗圃选择株高25-30cm的剑麻小苗，于网室内隔离种植；待植株定植后，取同一植株的根、茎、叶组织按等质量比例混合为一个样品，进行DNA提取，利用特异性巢式PCR方法检测，筛选出无植原体的健康剑麻苗；
(2)不携带植原体的新菠萝灰粉蚧的获得：从剑麻植株叶片基部剪取布满新菠萝灰粉蚧的叶片，置于南瓜表面，28±1℃室内恒温，让新菠萝灰粉蚧从剑麻叶片自主迁移到南瓜表面取食，待粉蚧全部迁移完后，清除剑麻叶片组织块，经南瓜饲养新菠萝灰粉蚧繁殖3代后可获得不携带植原体的新菠萝灰粉蚧；
(3)携带植原体新菠萝灰粉蚧的获得：从待传媒发病剑麻植株叶片基随机选取部分新菠萝灰粉蚧，提取DNA并经特异性巢式PCR方法检测后，确认携带植原体即可；
(4)接种新菠萝灰粉蚧：从待传媒发病剑麻植株叶片基部剪取布满新菠萝灰粉蚧的剑麻叶片组织块，置于步骤(1)中获得的无植原体的健康剑麻苗叶片基部处；于外面罩上纱网(250目)的铁架内(长×宽×高＝90cm×60cm×60cm)生长培养，让新菠萝灰粉蚧从剑麻叶片组织块自主迁移到剑麻植株基部取食，一周后清除接种剑麻叶块，培养4～6个月；同时设置健康对照和阴性对照；健康对照组为不接种新菠萝灰粉蚧的无菌健康剑麻。阴性对照组则为剪取步骤(2)中经南瓜脱毒繁殖4代时布满新菠萝灰粉蚧的南瓜表皮组织块(厚度1cm)的2～3龄若虫，置于步骤(1)获得的健康剑麻苗叶片基部处；罩网隔离培养；一周后清除接种南瓜表皮组织块，隔离培养4～6个月。
接种4个月后，接种携带植原体的新菠萝灰粉蚧的健康剑麻植株开始零星发病；至接种第5个月时，在接种携带植原体的新菠萝灰粉蚧的27株剑麻苗中，有24株剑麻叶片自叶尖变紫并卷叶症状；至接种第6个月时，在接种携带植原体的新菠萝灰粉蚧的剑麻植株发病叶片前1/2部位均出现退绿黄斑。而健康对照组与阴性对照组则均未发病。经特异性巢式PCR方法检测，只有接种携带植原体的新菠萝灰粉蚧的健康剑麻植株组检测为阳性，即为由新菠萝灰粉蚧介导传播后获得携带植原体的剑麻植株。
所述方法中，巢式PCR检测的引物如下：
第一轮扩增正向引物AGF：CTGGATAGGAGACAAGAAGGCAT(序列1)；第一轮扩增对反向引物ASR2：GCAACTGATAACCTCCACTGTGT(序列2)；巢式正向引物ASF1：CAATAGGTATGCTTAGGGAGGA(序列3)G；巢式反向引物ASR1:CACTGGTTTTACCCAACGTTTA(序列4)；扩增出632bp的条带为阳性结果，反之扩增无条带的为阴性结果。
步骤(2)中，通过南瓜表面取食饲养繁殖3代后获得不携带植原体新菠萝灰粉蚧。
步骤(3)中，从待传媒发病剑麻植株叶片的新菠萝灰粉蚧，经特异性巢式PCR方法检测确认携带有植原体。
将不同头数携带植原体的新菠萝灰粉蚧2～3龄若虫分别接种于健康剑麻幼苗上，一周后移除新菠萝灰粉蚧，以此开始计算天数，60d后对剑麻植株取样检测，仅5头携带植原体的新菠萝灰粉蚧便可使剑麻感染紫色卷叶病相关植原体；随着单株剑麻上接种新菠萝灰粉蚧数量的增多，感染植原体的剑麻植株比率不断增大，当单株剑麻上菠萝灰粉蚧数量达到40头时，感染紫色卷叶病相关植原体的剑麻植株比率可达75％，之后随着接种新菠萝灰粉蚧头数的增加，感染率上升势头减慢。
因此，步骤(4)中，新菠萝灰粉蚧接种密度为每株剑麻植株接种≥40头新菠萝灰粉蚧。
步骤(4)中，接种4个月后，接种携带植原体的新菠萝灰粉蚧的剑麻植株开始零星发病；至接种第6个月时，在接种携带植原体的新菠萝灰粉蚧的剑麻植株发病叶片出现退绿黄斑，其传毒率高达88.89％。
所建立的感染剑麻紫色卷叶病相关植原体的媒介方法可用于剑麻紫色卷叶病相关植原体致病机理，以及剑麻-植原体-新新菠萝灰粉蚧三者的互作等科学研究，也可用于生产中剑麻抗性种质的筛选、鉴定与评价。此方法具有操作性强、效率高、结果可靠等特点。
附图说明
图1为无植原体健康剑麻苗的筛选鉴定；
“+”为阳性对照，“-”为阴性对照，“1～35”为所筛选的剑麻苗。
图2为来自剑麻紫色卷叶病植株新菠萝灰粉蚧相关植原体的特异性巢式PCR检测；
“A”为来自健康剑麻的新菠萝灰粉蚧样品，“B”为来自剑麻紫色卷叶病病株的新菠萝灰粉蚧样品，M为2000marker，“+”为阳性对照，“-”为阴性对照，“1”为1龄，“2”为2龄，“3”为3龄，“4”为成虫。
图3为新菠萝灰粉蚧接种无菌剑麻苗4～6个月的症状变化；
A为未接种新菠萝灰粉蚧的无菌苗；B为接种未携带植原体新菠萝灰粉蚧的无菌苗；C为接种携带植原体新菠萝灰粉蚧的无菌苗；D为未接种(I)、接种后4个月(II)和接种后6个月(III)叶片症状的变化图。
图4为新菠萝灰粉蚧接种无菌剑麻苗相关植原体特异性巢式PCR检测；
I：未接种新菠萝灰粉蚧的剑麻植株特异性巢式PCR检测结果，Ⅱ：接种未携带植原体新菠萝灰粉蚧6个月后剑麻植株特异性巢式PCR检测结果，Ⅲ：接种携带植原体新菠萝灰粉蚧6个月后剑麻植株特异性巢式PCR检测结果。
图5为不同数量新菠萝灰粉蚧对剑麻紫色卷叶病相关植原体的传播效率。
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
本发明的一种感染剑麻紫色卷叶病相关植原体的媒介方法，步骤如下：
首先分别于无紫色卷叶病的苗圃以及在已发紫色卷叶病的苗圃选择大小一致，株高25～30cm左右的剑麻小苗，于网室内隔离种植。待植株定植后，取同一植株的根、茎、叶组织等质量比例混合为一个样品，进行DNA提取，利用特异性巢式PCR方法检测，筛选出无植原体的健康苗。
其次，利用剪刀从发病剑麻植株叶片基部剪取布满新菠萝灰粉蚧的发病叶片。随机选取新菠萝灰粉蚧通过特异性巢式PCR检测确认其带毒情况。将获得的携带有植原体的新菠萝灰粉蚧相应剑麻叶片组织块置于南瓜表面，28±1℃室内恒温，让新菠萝灰粉蚧从剑麻叶基部自主迁移到南瓜表面取食，待粉蚧全部迁移完后，清除剑麻叶片组织块。经南瓜饲养新菠萝灰粉蚧繁殖3代后可获得不带植原体的新菠萝灰粉蚧。
第三，用剪刀剪取携带植原体的剑麻叶片组织块，以及用接种刀切取经南瓜脱毒繁殖3代后布满新菠萝灰粉蚧2～3若虫(约100头)的南瓜表皮组织块(厚度1cm)，分别置于健康剑麻植株叶片基部处，同时以不接种新菠萝灰粉蚧的无菌健康剑麻为对照。于外面罩上纱网(250nm)的铁架内(长×宽×高＝90cm×60cm×60cm)生长培养。一周后清除接种剑麻叶片组织块与南瓜表皮组织块。接种4个月后，接种携带植原体的新菠萝灰粉蚧的健康剑麻植株开始零星发病；至接种第5个月时，在接种携带植原体的新菠萝灰粉蚧的27株剑麻苗中，有24株剑麻叶片自叶尖变紫并卷叶症状；至接种第6个月时，在接种携带植原体的新菠萝灰粉蚧的剑麻植株发病叶片前1/2部位均出现退绿黄斑。而健康对照组与阴性对照组则均未发病。
所建立的感染剑麻紫色卷叶病相关植原体的媒介方法可用于剑麻紫色卷叶病相关植原体致病机理，以及剑麻-植原体-新新菠萝灰粉蚧三者的互作等科学研究，也可用于生产中剑麻抗性种质的筛选、鉴定与评价。此方法具有操作性强、效率高、结果可靠等特点。
实施例1：携带植原体剑麻植株的获得
分别于无紫色卷叶病以及在已发紫色卷叶病的剑麻苗圃选择大小一致，株高25～30cm左右的剑麻苗，于网室内隔离种植。待其植株定植后，取同一植株的根、茎、叶植株组织等质量比例混合为一个样品，进行DNA提取，利用特异性巢式PCR方法检测，筛选出无植原体的健康剑麻苗，以及携带植原体剑麻苗。
巢式PCR检测技术如下所示：第一轮扩增正向引物AGF：CTGGATAGGAGACAAGAAGGCAT；第一轮扩增对反向引物ASR2：GCAACTGATAACCTCCACTGTGT；
巢式正向引物ASF1：CAATAGGTATGCTTAGGGAGGAG；巢式反向引物ASR1:CACTGGTTTTACCCAACGTTTA。扩增出632bp的条带为阳性结果，反之扩增无条带的为阴性结果。
实施例2：携带植原体新菠萝灰粉蚧种群的获得
于广东省湛江市东方农场(N:21°15′58.46″,E:110°21′55.22″)发病剑麻种植基地，利用剪刀剪取带有新菠萝灰粉蚧的剑麻叶片，取相同田块健康剑麻株上的新菠萝灰粉蚧为对照。置于保鲜盒中，于实验室进行植原体检测。
新菠萝灰粉蚧DNA提取方法参考天根动物组织提取试剂盒，具体步骤如下：取新菠萝灰粉蚧虫体，置于5cm口径的研钵中研磨，待充分研磨后，加入GA混匀，之后将混合液转移到1.5ml的离心管中，加入4μL RNAaseA，涡旋30s；加入5μL Protein K，水浴30min，期间翻转混匀；加入200μL无水乙醇，反转混匀；将全部液体转移到离心柱上，12000rpm离心1min；加入500μLGB漂洗；加入700μL的PW冲洗，重复一次；开盖晾干5min；加入30μL TE，放置5min，12000rpm离心2min；将得到的DNA重新过柱依次，置于-20℃暂存，待用。
利用特异性巢式PCR(实施例1中所述巢式PCR检测)对来自剑麻紫色卷叶病株的新菠萝灰粉蚧1龄、2龄、3龄和雌成虫DNA样品进行特异性巢式PCR检测，结果表明，在剑麻健康株上采集的新菠萝灰粉蚧DNA样品中均没有扩增出条带(如图2中A)，而在所检测的4种不同龄期的样品中均有相似的扩增条带(如图2中B)，由此表明，来自剑麻紫色卷叶病株新菠萝灰粉蚧均携带植原体。
实施例3：脱毒新菠萝灰粉蚧种群的获得
取新鲜南瓜，清水洗净，在表面喷洒酒精消毒，晾干后，将实施案例2中获得的携带植原体的新菠萝灰粉蚧剑麻叶片组织块，置于南瓜表面，让新菠萝灰粉蚧从剑麻叶基部自主迁移至南瓜表面取食，待新菠萝灰粉蚧全部迁移完后，清除剑麻叶片组织块。待新菠萝灰粉蚧发育为成虫，取大小一致的F0代母虫100头，提取DNA，巢式PCR检测其携带植原体率，同时剪取布满50头雌成虫南瓜表皮组织块(厚度1cm)，转移到新的南瓜表面上，继代饲养。于F1代、F2代直至F10，每代取其雌成虫100头，利用已建立的巢式PCR检测技术，检测其带毒率。试验在温度28±1℃，相对湿度60～70％，L:D＝14:10h的人工温室内进行。
巢式PCR检测技术如下所示：第一轮扩增正向引物AGF：CTGGATAGGAGACAAGAAGGCAT；第一轮扩增对反向引物ASR2：GCAACTGATAACCTCCACTGTGT；巢式正向引物ASF1：CAATAGGTATGCTTAGGGAGGAG；巢式反向引物ASR1:CACTGGTTTTACCCAACGTTTA。扩增出632bp的条带为阳性结果，反之，无扩增条带的则为阴性结果。
检测结果表明，在F0代植原体检出率为23％。将上述新菠萝灰粉蚧接种于南瓜上，待其产仔后，去除母虫，待幼虫发育为母虫后，取其雌成虫进行检测，结果表明，第一代的检出率为10％，第二代的检出率为6％，第三代为1％，从第四代开始直至第十代，均未检测到植原体(表1)。由此表明，经南瓜饲养后，脱毒3代后即可获得不带植原体的无毒群体。
表1、新菠萝灰粉蚧南瓜饲养脱毒代数与效果
注：Fn中“n”表示带毒新菠萝灰粉蚧在南瓜上饲养的不同代数。
实施例4：由新菠萝灰粉蚧介导传毒至植株显症所需时间确定
将上述试实施例2中获得携带植原体的新菠萝灰粉蚧接种到无菌苗，每株接种100头；以及实施例3中获得的脱毒新菠萝灰粉蚧接种以及无菌苗组剑麻植株，每株接种100头。定期观察，以及正常肥水管理保证新菠萝灰粉蚧的正常生长。
待上述植株开始出现症状，记录接虫剑麻植株的变化情况，并及时对发病植株进行取样检测，待所有植株均发病并取样检测完毕后，同时取健康对照和阴性对照剑麻样品进行特异性巢式PCR检测。
结果表明，在健康对照、阴性对照、以及接种携带菌新菠萝灰粉蚧的健康剑麻苗三个处理试验中。自接种后4个月，只用接种携带菌新菠萝灰粉蚧的健康剑麻苗开始零星发病；至接种第5个月时，在接种27株剑麻苗中，有24株剑麻叶片自叶尖变紫卷叶；至接种第6个月时，在接种剑麻植株发病叶片前1/2出现退绿黄斑。而健康对照和阴性对照组均未表现出任何症状(如图3)。特异性巢式PCR检测表明，健康对照和阴性对照组样本中未检测到植原体，而接种携带新菠萝灰粉蚧的27株健康剑麻苗中则有24株均检测到植原体(如图4)，其昆虫媒介传毒率高达88.89％。
实施例5：不同数量新菠萝灰粉蚧对剑麻紫色卷叶病相关植原体传播效率
将携带有植原体的新菠萝灰粉蚧2～3龄若虫，按虫数分别为1、5、10、20、40、80头接种于健康剑麻幼苗上，一周后移除新菠萝灰粉蚧，以此开始计算天数，60d后对剑麻植株取样，通过特异性巢式PCR检测剑麻植株体内是否含有剑麻紫色卷叶病相关植原体，并计算剑麻感染紫色卷叶病植原体的比率。每个处理12株剑麻。试验在温度28±1℃，相对湿度60～70％，L:D＝14:10h的人工温室内进行。
结果表明，仅5头新菠萝灰粉蚧便可使剑麻感染紫色卷叶病植原体。随着每株剑麻上接种粉蚧数量的增多，剑麻感染紫色卷叶病植原体的比率不断增大，当单株剑麻上新菠萝灰粉蚧数量达到40头时，剑麻感染紫色卷叶病相关植原体的比率可达75％，之后随着新菠萝灰粉蚧头数的增加，感染率上升势头减慢。
以上说明对本发明而言只是说明性的，而非限制性的，本领域普通技术人员理解，在不脱离所附权利要求所限定的精神和范围的情况下，可做出许多修改、变化或等效，但都将落入本发明的保护范围内。
Claims (4)
1.一种感染剑麻紫色卷叶病相关植原体的媒介方法，包括如下步骤：
(1)无植原体健康剑麻苗的筛选：于无紫色卷叶病的剑麻苗圃选择株高25-30cm的剑麻小苗，于网室内隔离种植；待植株定植后，取同一植株的根、茎、叶组织等质量比例混合为一个样品，进行DNA提取，利用特异性巢式PCR方法检测，筛选出无植原体的健康剑麻苗；
(2)不携带植原体新菠萝灰粉蚧的获得：从剑麻植株叶片基部剪取布满新菠萝灰粉蚧的叶片，置于南瓜表面，28±1℃室内恒温，让新菠萝灰粉蚧从剑麻叶基部自主迁移到南瓜表面取食，待粉蚧全部迁移完后，清除剑麻叶片组织块，经南瓜饲养新菠萝灰粉蚧繁殖3代后可获得不携带植原体的脱毒新菠萝灰粉蚧；
(3)携带植原体新菠萝灰粉蚧的获得：从待传媒发病剑麻植株叶片基部随机选取部分新菠萝灰粉蚧，提取DNA并经特异性巢式PCR方法检测，确认携带有植原体；
(4)接种新菠萝灰粉蚧与培养：从步骤(3)中经特异性巢式PCR方法检测确认携带有植原体的待传媒发病剑麻植株叶片基部剪取布满新菠萝灰粉蚧的叶片组织块，置于步骤(1)获得的健康剑麻苗叶片基部处，罩网隔离培养观察，让新菠萝灰粉蚧从南瓜表面自主迁移至剑麻叶基部取食；一周后清除接种剑麻叶片；隔离培养4～6个月；同时设置健康对照和阴性对照组；健康对照组为不接种新菠萝灰粉蚧的无菌健康剑麻；阴性对照组为割取步骤(2)中经南瓜脱毒繁殖4代时布满新菠萝灰粉蚧的南瓜表皮组织块的2～3龄若虫，置于步骤(1)获得的健康剑麻苗叶片基部处；罩网隔离培养；一周后清除接种南瓜表皮组织块，隔离培养4～6个月；接种4个月后，接种携带植原体的新菠萝灰粉蚧的健康剑麻植株开始零星发病；至接种第5个月时，在接种携带植原体的新菠萝灰粉蚧的27株健康剑麻苗中，有24株剑麻部分叶片自叶尖变紫卷叶；至接种第6个月时，在接种携带植原体的新菠萝灰粉蚧的剑麻植株发病叶片前1/2部位均出现退绿黄斑，而健康对照组与阴性对照组则均未发病，经特异性巢式PCR方法检测接种携带植原体新菠萝灰粉蚧的剑麻植株，检测阳性的即经由新菠萝灰粉蚧媒介传播获得携带植原体的剑麻植株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，巢式PCR检测的引物如下：
第一轮扩增正向引物AGF：CTGGATAGGAGACAAGAAGGCAT；第一轮扩增对反向引物ASR2：GCAACTGATAACCTCCACTGTGT；巢式正向引物ASF1：CAATAGGTATGCTTAGGGAGGAG；巢式反向引物ASR1:CACTGGTTTTACCCAACGTTTA；扩增出632bp条带为阳性结果，反之扩增无条带的为阴性结果。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，培养条件为温度28±1℃，相对湿度60～70％，L:D＝14:10h的人工温室内进行。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，新菠萝灰粉蚧接种密度为每株健康剑麻小苗接种≥40头新菠萝灰粉蚧。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211242071.3A CN115786568A (zh) | 2022-10-11 | 2022-10-11 | 一种感染剑麻紫色卷叶病相关植原体的媒介方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211242071.3A CN115786568A (zh) | 2022-10-11 | 2022-10-11 | 一种感染剑麻紫色卷叶病相关植原体的媒介方法及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115786568A true CN115786568A (zh) | 2023-03-14 |
Family
ID=85432764
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211242071.3A Pending CN115786568A (zh) | 2022-10-11 | 2022-10-11 | 一种感染剑麻紫色卷叶病相关植原体的媒介方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115786568A (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010027783A1 (en) * | 2008-08-25 | 2010-03-11 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Methods and compositions for the treatment and prevention of citrus greening disease |
| CN102084850A (zh) * | 2010-12-05 | 2011-06-08 | 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 | 一种饲养新菠萝灰粉蚧的方法 |
| WO2016002790A1 (ja) * | 2014-06-30 | 2016-01-07 | 日産化学工業株式会社 | 殺虫、殺ダニ、殺線虫、殺軟体動物、殺菌又は殺バクテリア組成物及び病害虫の防除方法 |
| CN105671163A (zh) * | 2016-03-03 | 2016-06-15 | 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 | 用于新菠萝灰粉蚧检测的试剂和实时荧光pcr |
| CN111183812A (zh) * | 2020-01-22 | 2020-05-22 | 云南省农业科学院甘蔗研究所 | 一种甘蔗白叶病植原体传播媒介的测定方法 |
| CN112176080A (zh) * | 2020-11-05 | 2021-01-05 | 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 | 特异性检测剑麻紫色卷叶病植原体的巢式pcr引物组、试剂盒及检测方法 |
| CN112210614A (zh) * | 2020-11-05 | 2021-01-12 | 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 | 检测剑麻紫色卷叶病植原体的实时荧光定量lamp引物组及其应用 |
-
2022
- 2022-10-11 CN CN202211242071.3A patent/CN115786568A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010027783A1 (en) * | 2008-08-25 | 2010-03-11 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Methods and compositions for the treatment and prevention of citrus greening disease |
| CN102084850A (zh) * | 2010-12-05 | 2011-06-08 | 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 | 一种饲养新菠萝灰粉蚧的方法 |
| WO2016002790A1 (ja) * | 2014-06-30 | 2016-01-07 | 日産化学工業株式会社 | 殺虫、殺ダニ、殺線虫、殺軟体動物、殺菌又は殺バクテリア組成物及び病害虫の防除方法 |
| CN105671163A (zh) * | 2016-03-03 | 2016-06-15 | 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 | 用于新菠萝灰粉蚧检测的试剂和实时荧光pcr |
| CN111183812A (zh) * | 2020-01-22 | 2020-05-22 | 云南省农业科学院甘蔗研究所 | 一种甘蔗白叶病植原体传播媒介的测定方法 |
| CN112176080A (zh) * | 2020-11-05 | 2021-01-05 | 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 | 特异性检测剑麻紫色卷叶病植原体的巢式pcr引物组、试剂盒及检测方法 |
| CN112210614A (zh) * | 2020-11-05 | 2021-01-12 | 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 | 检测剑麻紫色卷叶病植原体的实时荧光定量lamp引物组及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ZHENQIANG QIN ET AL.: "Effects of host plant on the development, survivorship and reproduction of Dysmicoccus neobrevipes Beardsley (Hemiptera: Pseudoccocidae)", CROP PROTECTION, vol. 30, pages 1124 - 1128 * |
| 杨荣 等: "剑麻抗病种苗的引进试种及抗病效应研究", 安徽农业科学, vol. 43, no. 31, pages 101 - 104 * |
| 王真辉 等: "假臭草丛枝病植原体昆虫媒介的传毒特性研究", 西南农业学报, vol. 26, no. 6, pages 2357 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2016258912A1 (en) | Isolated complex endophyte compositions and methods for improved plant traits | |
| Parke et al. | Hazard analysis for Phytophthora species in container nurseries: Three case studies | |
| Ezrari et al. | Characterization of Fusarium species causing dry root rot disease of citrus trees in Morocco | |
| CN109077067A (zh) | 一种生防菌及其在农作物灰霉病防治方面的应用 | |
| Alizadeh et al. | Isolation and characterization of bacterial agents associated of wetwood disease on elm trees in Iran | |
| Om | The roles of psyllids, host plants and environment in the aetiology of huanglongbing in Bhutan | |
| CN108559718A (zh) | 一株捕食植物病原细菌的叶柄粘球菌及其在细菌性病害生物防治中的应用 | |
| CN108441443B (zh) | 一株防治植物线虫的菌株及其应用 | |
| Mannai et al. | Characterization of Fusarium species associated with apple decline in Tunisian nurseries | |
| CN109055265B (zh) | 一种生防菌及其在农作物蔓枯病防治方面的应用 | |
| CN115786568A (zh) | 一种感染剑麻紫色卷叶病相关植原体的媒介方法及其应用 | |
| CN105002111B (zh) | 一种防治黄瓜霜霉病的菌株tdjn1及其应用 | |
| Yang et al. | Identification and pathogenicity of Fusarium lactis, causal agent of internal fruit rot of greenhouse sweet pepper in Alberta | |
| Patzek et al. | Stunting of Onion in the Columbia Basin of Oregon and Washington Caused by Rhizoctonia spp. | |
| Abdullahi et al. | Isolation and identification of bacteria associated with aerial part of rice plant from Kware lake | |
| Haque et al. | Weather parameters largely regulate the outbreak of the rice bacterial blight: an endemic disease poses a threat to food security in Bangladesh | |
| Suputra et al. | Identification and Characterization of Soft Rot Bacterial Pathogens on Phalaenopsis Orchid in Bali | |
| Yan et al. | Simulation of the spreading trend of Camellia oleifera Anthracnose in Guangdong Province | |
| Greiner | Inoculation and spread of Dickeya in potatoes | |
| Baki et al. | ISOLATION AND MORPHO MOLECULAR IDENTIFICATION OF INDIGENOUS SOIL BORNE ENTOMOPATHOGENIC FUNGI, AND THEIR PATHOGENICITY TO L.(LEPIDOPTERA: PYRALIDAE) AS A MODEL INSECT | |
| Rytkönen | Phytophthora in Finnish nurseries | |
| Hembrom et al. | Evaluation of Gladiolus genotypes for resistance to different isolates of Fusarium oxysporum f. sp. gladioli | |
| CN116716190B (zh) | 一种螺卷毛壳菌201及其应用 | |
| CN117903950B (zh) | 一种用于烟草靶斑病的弱毒菌株by168及其应用 | |
| CN114437943B (zh) | 一种高效致病力生防菌斐济曲霉菌株及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |