CN113046450A - 一种基于CRISPR/Cas12a点切割可视化检测植原体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于CRISPR/Cas12a点切割可视化检测植原体的方法，该方法通过设计针对植原体16SrDNA序列保守区域的crRNA，激活CRISPR/Cas12a的蛋白的切口功能实现对linker‑arm DNA的切割，以产生所需要的断裂DNA片段，并利用纳米金显色技术成功检测出多种植原体，这对实现植原体田间快速可视化检测具有重大意义。本发明具有成本低，操作简便，效率高，灵敏度高和特异性强等特性，并且通过显色即可肉眼判断，显色反应效果持久明显。减少了对实验室大型仪器和精密信号采集仪器的依赖，为植原体的检测提供了新思路和新选择。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及采用生物学的方法对植原体进行检测，更具体涉及一种基于CRISPR/Cas12a点切割可视化检测植原体的方法。
背景技术
植原体(phytoplasma)是一种专性寄生于植物韧皮部筛管细胞的类菌原体。在世界范围内引起上千种植物的病害发生。植物感染植原体后，表现出丛枝、小叶簇生、植株矮化、花器官畸形及花变叶等异常发育表型，严重时整株枯死。由于植原体专性寄生在植物韧皮部筛管细胞，由于生长条件苛刻无法离体培养，植原体病害目前仍缺乏有效的治疗手段。植物一旦感染植原体，很难挽回损失，在缺乏有效治疗手段的背景下，植原体的检测是防治植原体病害的关键环节。因此建立起简便，灵敏，快速和准确的植原体检测体系对防治植原体病害具有重要意义。
在缺乏有效治疗手段的背景下，植原体的检测是防治植原体病害的关键环节。随着分子生物学技术的发展，植原体的检测技术发展迅速。目前植原体的检测手段主要包括电子显微镜检测，组织化学法检测，血清学检测，分子生物学检测等方法。电子显微镜法和血清法结果准确可信，但是操作复杂且对样本质量要求高。组织化学法成本低廉，操作简便但准确性和灵敏性较低。分子生物学检测是目前植原体检测中最为常用的检测手段。具有灵敏性高，结果准确等优点。但是无法脱离实验室大型设备且检测时间较长。因此建立起灵敏，准确，快速的田间检测方法是未来植原体检测领域的研究方向。近年来，CRISPR/Cas系统作为一种基因工程中非常重要的工具被广泛应用于基因编辑、基因表达调控及基因检测等研究中。最近的进展表明，CRISPR相关(Cas)内切核酸酶系统，如Cas12a、Cas13a和Cas14，均具有可用于核酸检测的特征(Chen et al，2018；Gootenberg et al.，2017；Harringtonet al.，2018)。而CRISPR/Cas12a系统可以作为识别切割DNA片段的理想手段，当Cas12a/crRNA/靶DNA三元复合物形成时，Cas12a具有DNA激活的一般DNase活性，可以非特异切割任何DNA片段(Chen et al.，2018；Li et al.，2018)。
发明内容
针对现状，本发明提供一种基于CRISPR/Cas12a点切割可视化检测植原体的方法，旨在解决传统植原体检测中成本高、对实验室设备高度依赖性、要求检测人员具有较深的专业知识等问题，使植原体的田间可视化检测成为可能。
本发明的目的之一在于提供一种识别植原体16SrDNA序列保守区域的crRNA。
本发明的目的之二在于提供用于等温扩增植原体16SrDNA片段的RPA引物。
本发明的目的之三在于提供用于CRSPR/Cas12a切割体系的linker-arm DNA。
本发明的目的之四在于提供一种通过纳米金显色原理检测植原体的方法。
为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
一种基于CRISPR/Cas12a点切割可视化检测植原体的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)设计合成crRNA的引物序列，制备针对植原体16SrDNA序列保守区域的crRNA；
1)从NBCI上下载得到具有代表性的植原体16SrDNA核苷酸序列，通过DNAMAN软件进行比对分析，选择最保守区域设计合成crRNA的引物，正向引物为T7-crRNA-F，反向引物为crRNA-R，其引物序列如下：
正向引物T7-crRNA-F：5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGG-3’；
反向引物crRNA-R：
5’-GGCAATGGAGGAAACTCTGAATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC-3；
2)将步骤1)所述引物按照1∶1的比例进行混合，在PCR仪器中进行退火试验，制备生成crRNAs的DNA模板；所述退火试验的反应体系为20uL；其中T7启动子引物T7-crRNA-F(100μM)为4μL，crRNA引物crRNA-R(100uM)为4μL，HF 5×buffer为4μL，ddH2O为8μL。退火程序为：95℃解链5min后每分钟递减1℃，75个循环之后降到20℃；
3)使用Transcript Aid T7 High Yield Transcription Kit(Thermo FisherScientifific)对制备好的上述DNA模板进行转录，生成crRNA。使用RNA-Clean&ConcentratorTM-5(Zymo-Research)试剂盒纯化crRNA后，利用NanoDrop 2000(ThermoFisher Scientific)检测crRNA浓度，使用ddH2O将制备好的crRNA的浓度稀释至10μM；-80℃保存，用于后续试验；
(2)根据GenBank数据库中得到植原体16SrDNA序列，通过与多个序列对比，在其最保守的区域设计针对植原体16SrDNA序列的等温扩增引物RPA-F和RPA-R，提取多个感染植原体植物的总DNA，以感病植物总DNA为模板，使用RPA引物，根据说明书，使用RPA等温扩增试剂盒进行等温扩增试验得到等温扩增产物；
所述RPA等温扩增引物序列为：
RPA-F：5’-CACATTGGGACTGAGACACG-3’
RPA-R：5’-CCTACGCACCCTTTACGC-3’。
具体地，等温扩增试验中植原体16SrDNA序列等温扩增体系为50uL，其中RPA-F和PRA-R各加2.4μL，Primer Free Rehydration buffer加1μL，280mM的MgOAc溶液加2.5μL，最终使用样品DNA溶液将扩增体系补全到50μL。
(3)识别切割link-arm DNA序列：制备基于CRISPR/Cas12a点特异性切割体系，并于37℃条件下孵育30-50min，识别切割link-arm DNA序列，得到点特异性切割产物；
所述linker-arm DNA的序列为：
GTGTGAGTGTGTGTGGTGTTGGTGGTGAGG。
所述点特异性切割体系为50μL，其中Cas12a蛋白为2μL，crRNA为1μL，RNA酶抑制剂为1μL，等温扩增产物为2μL，Linker-arm DNA为1.5μL，1×NEB buffer为42.5μL。
(4)将切割产物加入纳米金反应液中进行显色反应，若反应溶液表现出明显的红色，则含有植原体。
本发明具有如下优点：
1.本发明提供了一种全新的检测植原体的方法，该方法通过设计针对植原体16SrDNA序列保守区域的crRNA，激活CRISPR/Cas12a的蛋白的切口功能实现对linker-armDNA的切割，以产生所需要的断裂DNA片段，并利用纳米金显色技术成功检测出多种植原体，这对实现植原体田间快速可视化检测具有重大意义。
2.本发明具有成本低，操作简便，效率高，灵敏度高和特异性强等特性，并且通过显色即可肉眼判断，显色反应效果持久明显。减少了对实验室大型仪器和精密信号采集仪器的依赖。为植原体的检测提供了新思路和新选择，也将在植物病害在田间的检测中发挥模范作用，具有良好的应用前景。
3.本发明提供了识别植原体16SrDNA序列保守区域的crRNA，这是CRISPR技术首次用于植原体检测，而CRISPR/Cas12a体系得以准确完成的重要环节就是针对靶标序列的crRNA的生成。本发明首次设计完成了针对植原体的crRNA，这对CRISPR技术在植原体检测领域的发展提供了关键的依据，为植原体检测领域的研究提供了新的方向。
附图说明
图1是不同植原体16SrDNA序列保守区域比对图；
图中框选部分为crRNA所识别的位于植原体16SrDNA保守序列上的靶标序列。
图2是CRISPR/Cas12a/linker-arm DNA/纳米金技术检测多种植原体结果图。
图3是普通PCR技术与CRISPR/Cas12a/linker-arm DNA/纳米金技术检测枣疯病植原体的对比效果图；
图中，A为PCR技术检测结果，B为本发明技术检测结果。
图4是CRISPR/Cas12a/linker-arm DNA/纳米金技术检测植原体原理图。
图5是普通PCR技术与CRISPR/Cas12a/linker-arm DNA/纳米金技术检测枣疯病植原体的灵敏度对比图；
图中，A为PCR技术检测结果，B为本发明技术检测结果。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
本发明中健康的以及感染植原体的泡桐，枣和桃材料均由河南农业大学园艺学院果树重点实验室提供。健康的以及感染植原体的板栗材料由中国林科院提供。
实施例
一种基于CRISPR/Cas12a点切割可视化检测植原体的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)crRNA的DNA模板引物设计
对于植原体，RPA引物是在GenBank数据库中可用植原体16SrDNA序列的多序列比对后从保守区域设计的。我们生成了crRNA来识别植原体16SrDNA序列的特定位点，并与RPA引物对扩增出的片段具有同源性(图1)。crRNA识别一个与TTTN或NAAA位点相邻的20bp目标序列，并从NCBI中发现的每个病毒/病毒高度保守的区域设计。然后以设计好的crRNA序列为探针，使用BLAST指令在NCBI GenBank数据库中的可用序列进行筛查，以确保crRNA只存在于植原体16SrDNA序列中，其他地方没有高度同源的序列，设计的引物对序列为：
T7-crRNA-F：5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGG-3’：
crRNA-R：
5’-GGCAATGGAGGAAACTCTGAATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC-3’。
(2)crRNA的生成
将T7-crRNA-F/crRNA-R引物对合成的寡核苷酸以1∶1的比例进行混合。混合均匀后在PCR仪器中进行退火，制备生成crRNAs的DNA模板。所述退火试验的反应体系为20μL；其中T7启动子引物T7-crRNA-F(100μM)为4μL，crRNA引物crRNA-R(100uM)为4μL，HF 5×buffer为4μL，ddH2O为8μL。退火程序为：95℃解链5min后每分钟递减1℃，75个循环之后降到20℃。
根据说明书使用Transcript Aid T7 High Yield Transcription Kit(ThermoFisher Scientifific)对制备好的上述DNA模板进行转录，生成crRNA。使用RNA-Clean&ConcentratorTM-5(Zymo-Research)试剂盒纯化crRNA后，利用NanoDrop2000(ThermoFisher Scientific)检测crRNA浓度，使用ddH2O将制备好的crRNA的浓度稀释至10μM；-80℃保存，用于后续试验；
(3)RPA引物设计和等温扩增
根据GenBank数据库中得到植原体16SrDNA序列，通过与多个序列对比，在其最保守的区域设计针对植原体16SrDNA序列的等温扩增引物RPA-F和RPA-R，所述RPA等温扩增引物序列为：
RPA-F：5’-CACATTGGGACTGAGACACG-3’
RPA-R：5’-CCTACGCACCCTTTACGC-3’。
使用CTAB法分别提取健康及感染植原体的枣叶片、泡桐叶片、桃叶片以及板栗叶片的总DNA，分别以感染植原体植物的总DNA为模板，使用RPA引物，根据说明书，使用RPA等温扩增试剂盒进行等温扩增试验得到等温扩增产物；
等温扩增试验中植原体16SrDNA序列等温扩增体系为50μL，具体为：
(3)识别切割link-arm DNA序列
选择的linker-arm DNA的序列为：
GTGTGAGTGTGTGTGGTGTTGGTGGTGAGG。
将上述RPA扩增产物吸取2μL加入至CRISPR/Cas12a/linker-arm DNA切割体系中，37℃条件下切割30min，识别切割link-arm DNA序列，得到点特异性切割产物；切割体系共50μL如下：
(4)纳米金显色试验
将上述切割产物加至10μL制备好的纳米金溶液中，3000rpm/min，室温条件下离心1min即可进行观察。结果表明含有感染植原体的植物叶片DNA的显色体系表现出明显的红色，而健康植物DNA的显色体系则为白色。结果表明，CRISPR/Cas12a/linker-arm DNA/纳米金显色试验可有效检测出多种植物中的植原体(图2)，和传统的PCR技术相比，通过显色来判断是否感染植原体更加直观简单(图3)。
其中，CRISPR/Cas12a/linker-arm DNA/纳米金技术的检测原理(图4)为：
使用CTAB法提取待测样品的总DNA。使用等温扩增(RPA)引物，以待测样品DNA为模板进行等温扩增，将等温扩增后的产物加入至CRISPR/Cas12a/linker-arm DNA的切割体系中，如若待测样品中含有植原体16SrDNA序列，则可被crRNA所识别并激活Cas12a蛋白的切割属性，将linker-arm DNA切割成片段，失去连接纳米金颗粒的功能。如若样品中无植原体，crRNA识别不到靶标序列，则Cas12a蛋白的切割属性无法被激活，切割体系中的linker-arm DNA完整，拥有连接纳米金颗粒的功能。将CRISPR/Cas12a/linker-arm DNA体系的切割产物加入至纳米金溶液中，linker-arm DNA被剪切的显色体系中，linker-arm DNA无法连接纳米金颗粒，离心后仍为红色。不含有，linker-arm DNA的显色体系中，linker-arm DNA成功连接纳米金颗粒，离心后纳米金形成沉淀，红色转变为白色。
(5)CRISPR/Cas12a/linker-arm DNA/纳米金技术的检测灵敏度试验
以枣疯病病叶总DNA为模板，根据植原体16SrDNA的等温扩增引物进行PCR扩增，将扩增产物连接至T载体上并转入大肠杆菌。从阳性大肠杆菌中提取T-16SrDNA重组质粒，将质粒进行梯度稀释(5ng/μL-5×10-6ng/μL)。将稀释后的产物分别进行传统PCR扩增及CRISPR/Cas12a/linker-arm DNA/纳米金显色试验。结果表明，CRISPR/Cas12a/linker-armDNA/纳米金显色技术比传统PCR技术灵敏度强1000倍左右(图5)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种基于CRISPR/Cas12a点切割可视化检测植原体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)设计合成crRNA的引物序列，制备针对植原体16SrDNA序列保守区域的crRNA；
(2)根据GenBank数据库中得到植原体16SrDNA序列，通过与多个序列对比，在其最保守的区域设计针对植原体16SrDNA序列的等温扩增引物RPA-F和RPA-R，提取多个感染植原体植物的总DNA，以感病植物总DNA为模板，使用RPA引物，使用RPA等温扩增试剂盒进行等温扩增试验得到等温扩增产物；
(3)识别切割link-arm DNA序列：制备基于CRISPR/Cas12a点特异性切割体系，并于37℃条件下切割30-50min，识别切割link-arm DNA序列，得到点特异性切割产物；
(4)将切割产物加入纳米金反应液中进行显色反应，若反应溶液表现出明显的红色，则含有植原体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述crRNA的引物序列为：
T7-crRNA-F：5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGG-3’；
crRNA-R：5’-GGCAATGGAGGAAACTCTGAATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC-3’。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RPA等温扩增引物序列为：
RPA-F:5’-CACATTGGGACTGAGACACG-3’
RPA-R:5’-CCTACGCACCCTTTACGC-3’。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)等温扩增试验中植原体16SrDNA序列等温扩增体系为50μL，其中RPA-F和PRA-R各加2.4μL，Primer Free Rehydration buffer加1μL，280mM的MgOAc溶液加2.5μL，最终使用样品DNA溶液将扩增体系补全到50μL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述点特异性切割体系为50μL，其中Cas12a蛋白为2μL，crRNA为1μL，RNA酶抑制剂为1μL，等温扩增产物为2μL，Linker-arm DNA为1.5μL，1×NEB buffer为42.5μL。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述linker-arm DNA的序列为：GTGTGAGTGTGTGTGGTGTTGGTGGTGAGG。
7.识别植原体16SrDNA序列保守区域的crRNA，其特征在于，所述crRNA的引物序列为：
T7-crRNA-F：5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGG-3’；
crRNA-R：5’-GGCAATGGAGGAAACTCTGAATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC-3’。
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| CN111855990A (zh) * | 2019-04-29 | 2020-10-30 | 华南师范大学 | 一种基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法及试剂盒与应用 |
| CN112210614A (zh) * | 2020-11-05 | 2021-01-12 | 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 | 检测剑麻紫色卷叶病植原体的实时荧光定量lamp引物组及其应用 |
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