CN113430276A

CN113430276A - 一种基于coⅰ基因鉴别绵羊毛与山羊毛的方法

Info

Publication number: CN113430276A
Application number: CN202110815538.8A
Authority: CN
Inventors: 张夏颖; 吴小锋; 郑海玲; 杨海亮; 周旸
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2021-07-19
Filing date: 2021-07-19
Publication date: 2021-09-24

Abstract

本发明公开了一种基于COⅠ基因鉴别绵羊毛与山羊毛的方法。提取羊毛的DNA；利用COⅠ基因引物对提取到的DNA进行PCR扩增，扩增出380bp长度的PCR扩增产物；将PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，利用胶纯化试剂盒回收，测序得到测序结果，根据测序结果进行绵羊毛与山羊毛的物种鉴别。本发明方法特异性强，简单易操作，避免了传统外观鉴定的主观因素影响，且可鉴别经纺织加工后外观改变难以从形态上进行识别的羊毛制品，结果客观准确，可信度高。

Description

一种基于COⅠ基因鉴别绵羊毛与山羊毛的方法

技术领域

本发明属于分子生物技术领域的一种鉴别生物物种方法，具体涉及一种基于COⅠ基因鉴别绵羊毛与山羊毛的方法。

背景技术

山羊毛与绵羊毛都是市场上常见的用于纺织的动物毛纤维，山羊毛制品和绵羊毛制品在手感、质感等方面略有差别，以满足不同需求。然而，由于山羊毛和绵羊毛的结构和组成非常相似，且经过一系列的加工工艺后二者更加难以辨别，因此对山羊毛和绵羊毛进行鉴别就显得尤为重要。目前的鉴别方法主要是外观鉴别法，即在显微镜下根据其鳞片层、皮质层和髓质层的特征加以辨别。但是在纺织物制造的过程中，毛发的形态结构会受到一定程度的破坏，此方法不仅辨别难度较大，而且主观性过强，比对标准不明确，对辨别人员的经验和技术要求较高，不容易快速得出准确结果。

动物毛发的基因组大多存在于毛囊中，而用于纺织的动物毛发通常没有毛囊，因而在对毛发DNA进行分析时，主要是针对毛发干中的线粒体DNA。CO Ⅰ基因是动物线粒体DNA上的基因，广泛用于动物物种鉴定。

发明内容

为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种基于COⅠ基因鉴别绵羊毛与山羊毛的方法，该方法具有准确可靠、快速高效、特异性强、灵敏度高的优点。

本发明方法特异性强，简单易操作，避免了传统外观鉴定的主观因素影响，且可鉴别经纺织加工后外观改变难以从形态上进行识别的羊毛制品，结果客观准确，可信度高。

基于上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

(1)提取羊毛的DNA；

(2)利用COⅠ基因引物对提取到的DNA进行PCR扩增，扩增出380bp 长度的PCR扩增产物；

(3)将PCR扩增产物经质量浓度为2％的琼脂糖凝胶电泳检测后，利用胶纯化试剂盒回收，测序得到测序结果，根据测序结果进行绵羊毛与山羊毛的物种鉴别。

所述步骤(2)中，COⅠ基因引物包括【上游的】GS380-F核苷酸序列和【下游的】GS380-R核苷酸序列，GS380-F核苷酸序列如SEQ ID NO.1，【具体为ATCGGCACCCTCTACCTTCT，】GS380-R核苷酸序列如SEQ ID NO.2【，具体为GCTCCTGCATGGGCTAGATT】。

所述步骤(2)中，PCR扩增的反应体系为：加入5μl羊毛DNA、0.5μl的浓度为10μmol/L的上游引物GS380-F、0.5μl的浓度为10μmol/L的下游引物 GS380-R、2μl Taq酶缓冲液、2μl dNTP混合液、0.5μl Taq酶溶液，用ddH₂O将总体积补足至20μl；扩增条件为：94℃预变性1min；94℃变性30s、55℃退火 30s、72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸5min；最后温度设置4℃【且时间设置∞以实现扩增结束后的暂时性低温】保存。

【所述的Taq酶缓冲液、dNTP混合液、Taq酶溶液分别采用TaKaRa 10x Ex TaqBuffer、TaKaRa dNTP Mixture、TaKaRa Ex Taq酶。】

所述步骤(3)中，根据测序结果进行比对判断：

若测序结果的序列为SEQ ID NO.3，则羊毛为绵羊毛；

若测序结果的序列为SEQ ID NO.4，则羊毛为山羊毛。

【所述步骤(3)中，具体可根据获得的绵羊和山羊的COⅠ基因序列，得到如表1所示的绵羊PCR扩增目的基因序列和山羊PCR扩增目的基因序列之间存在的核苷酸序列特征变异位点，根据核苷酸序列特征变异位点进行绵羊毛和山羊毛的物种鉴别。

表1绵羊与山羊的380bp扩增目的基因核苷酸序列特征变异位点

本发明提供的是一种线粒体COⅠ基因的引物，利用该引物对提取到的山羊毛和绵羊毛毛干中的线粒体DNA上的COⅠ基因片段进行扩增，得到380bp扩增产物，通过序列比对来鉴别毛发物种，进而来进行物种鉴别。相较于外观鉴别法，利用COⅠ基因对山羊毛和绵羊毛进行鉴别，不仅结果客观可靠，而且所需样本量小，灵敏度高，是一种简单、准确且高效的鉴别方法。

本发明的PCR技术本身有特异性强灵敏度高的特点，灵敏度高即反应体系中的基因拷贝数极低也可成功扩增，具体如何定量不太清楚。

本发明的有益效果是：

本发明方法进行引物的构建，并利用构建的引物对山羊毛和绵羊毛中的线粒体DNA进行扩增和测序，用于特异性地鉴别山羊毛和绵羊毛。该方法准确可靠、快速高效、特异性强、灵敏度高，可以鉴别经过纺织工艺加工后通过外观鉴别无法准确识别的羊毛制品，有助于满足对羊毛制品的不同需求。

附图说明

图1为绵羊毛DNA和山羊毛DNA的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。

图2为实施例所提取到的绵羊毛DNA和山羊毛DNA的COⅠ基因部分片段特异性碱基序列比对图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

实施例：

1、试剂来源：

10x Ex Taq Buffer、dNTP Mixture和Ex Taq酶均购自宝日医生物技术(北京)有限公司，引物委托上海生工有限公司合成，DNA序列委托上海生工有限公司测序。

2、引物合成：

本发明构建出能扩增两种羊的COⅠ基因的1对引物，序列如表2。

表2PCR引物及其退火温度

两种羊毛样品的PCR扩增产物测序结果在NCBI的Nucleotide BLAST上进行比对，能有效鉴别出所属物种，序列如下(下划线部分为引物，5’端为正向引物，3’端为反向引物)

绵羊(Ovis aries)：

5’-ATCGGCACCCTCTACCTTCTATTTGGTGCCTGAGCTGGTATGGTAG GAACCGCCTTAAGCCTACTAATTCGCGCCGAACTAGGCCAACCCGGAACT CTACTCGGAGATGACCAAATCTACAACGTAATTGTAACCGCACATGCATT TGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCTATTATAATCGGTGGATTTGGCAA CTGACTAGTTCCTCTGATAATTGGAGCCCCTGATATAGCATTTCCTCGGAT AAATAACATAAGCTTTTGACTTCTTCCCCCATCCTTCTTGTTACTCCTAGC ATCCTCTATGGTTGAGGCCGGAGCAGGAACAGGTTGAACCGTATACCCTCCTCTAGCAGGCAATCTAGCCCATGCAGGAGC-3’(380bp)(SEQ ID NO.3) 山羊(Capra hircus)：

5’-ATCGGCACCCTCTACCTTCTGTTCGGTGCCTGAGCTGGCATAGTAG GGACCGCCTTGAGCTTACTAATTCGCGCCGAACTAGGTCAACCCGGAACC CTACTTGGAGATGACCAGATCTACAATGTAATTGTAACTGCACACGCATT CGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCTATTATGATTGGAGGGTTTGGCGA CTGACTAGTCCCTCTAATAATTGGAGCCCCCGATATAGCATTTCCTCGGAT AAATAATATAAGCTTTTGACTCCTTCCCCCCTCTTTCCTATTACTTCTAGC ATCCTCTATAGTTGAAGCCGGAGCAGGAACAGGTTGAACCGTATATCCTCCTCTAGCAGGTAATCTAGCCCATGCAGGAGC-3’(380bp)(SEQ ID NO.4)

3、山羊毛与绵羊毛DNA的提取：

利用QiaGen公司的QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒进行山羊毛与绵羊毛DNA的提取。

4、DNA浓度测定：

样品DNA用Qubit荧光计测定其浓度。本实施例中提取到的山羊毛DNA 浓度为0.464ng/μl，绵羊毛DNA浓度为0.122ng/μl。

5、反应体系与条件：

PCR反应体系为：5μl模板DNA、0.5μl上游引物GS380-F(10μmol/L)、 0.5μl下游引物GS380-R(10μmol/L)、2μl TaKaRa 10x Ex Taq Buffer、2μl TaKaRa dNTP Mixture、0.5μl TaKaRa Ex Taq酶，用ddH2O将总体积补足至20μl；扩增条件为：94℃预变性1min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸5min；最后温度设置4℃时间设置∞以实现扩增结束后的暂时性低温保存。

6、结果分析

PCR产物琼脂糖凝胶电泳图如图1，从左到右三条电泳条带分别为绵羊、山羊和Marker，可见绵羊样品和山羊样品均扩增出PCR产物，检出PCR产物大小为380bp，图2为实施例所提取到的绵羊和山羊的COⅠ基因部分片段(380bp) 碱基配对图，可见，该方法对两种羊毛具有特异性。

本发明涉及的序列如下：

SEQ ID NO.1：

名称：COⅠ基因引物GS380-F核苷酸序列

来源：人工序列(Artificial Sequence)

序列：ATCGGCACCCTCTACCTTCT

SEQ ID NO.2：

名称：COⅠ基因引物GS380-R核苷酸序列

来源：人工序列(Artificial Sequence)

GCTCCTGCATGGGCTAGATT

SEQ ID NO.3：

名称：绵羊PCR扩增产物基因序列

来源：绵羊(Ovis aries)

序列：ATCGGCACCCTCTACCTTCTATTTGGTGCCTGAGCTGGTATGGT AGGAACCGCCTTAAGCCTACTAATTCGCGCCGAACTAGGCCAACCCGGAA CTCTACTCGGAGATGACCAAATCTACAACGTAATTGTAACCGCACATGCA TTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCTATTATAATCGGTGGATTTGGC AACTGACTAGTTCCTCTGATAATTGGAGCCCCTGATATAGCATTTCCTCGG ATAAATAACATAAGCTTTTGACTTCTTCCCCCATCCTTCTTGTTACTCCTA GCATCCTCTATGGTTGAGGCCGGAGCAGGAACAGGTTGAACCGTATACCC TCCTCTAGCAGGCAATCTAGCCCATGCAGGAGC

SEQ ID NO.4：

名称：山羊PCR扩增产物基因序列

来源：山羊(Capra hircus)

序列：ATCGGCACCCTCTACCTTCTGTTCGGTGCCTGAGCTGGCATAGT AGGGACCGCCTTGAGCTTACTAATTCGCGCCGAACTAGGTCAACCCGGAA CCCTACTTGGAGATGACCAGATCTACAATGTAATTGTAACTGCACACGCA TTCGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCTATTATGATTGGAGGGTTTGGC GACTGACTAGTCCCTCTAATAATTGGAGCCCCCGATATAGCATTTCCTCG GATAAATAATATAAGCTTTTGACTCCTTCCCCCCTCTTTCCTATTACTTCTA GCATCCTCTATAGTTGAAGCCGGAGCAGGAACAGGTTGAACCGTATATCC TCCTCTAGCAGGTAATCTAGCCCATGCAGGAGC。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种基于COⅠ基因鉴别绵羊毛与山羊毛的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atcggcaccc tctaccttct 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctcctgcat gggctagatt 20

<210> 3

<211> 380

<212> DNA

<213> Ovis aries

<400> 3

atcggcaccc tctaccttct atttggtgcc tgagctggta tggtaggaac cgccttaagc 60

ctactaattc gcgccgaact aggccaaccc ggaactctac tcggagatga ccaaatctac 120

aacgtaattg taaccgcaca tgcatttgta ataattttct ttatagtaat gcctattata 180

atcggtggat ttggcaactg actagttcct ctgataattg gagcccctga tatagcattt 240

cctcggataa ataacataag cttttgactt cttcccccat ccttcttgtt actcctagca 300

tcctctatgg ttgaggccgg agcaggaaca ggttgaaccg tataccctcc tctagcaggc 360

aatctagccc atgcaggagc 380

<210> 4

<211> 380

<212> DNA

<213> Capra hircus

<400> 4

atcggcaccc tctaccttct gttcggtgcc tgagctggca tagtagggac cgccttgagc 60

ttactaattc gcgccgaact aggtcaaccc ggaaccctac ttggagatga ccagatctac 120

aatgtaattg taactgcaca cgcattcgta ataattttct ttatagtaat acctattatg 180

attggagggt ttggcgactg actagtccct ctaataattg gagcccccga tatagcattt 240

cctcggataa ataatataag cttttgactc cttcccccct ctttcctatt acttctagca 300

tcctctatag ttgaagccgg agcaggaaca ggttgaaccg tatatcctcc tctagcaggt 360

aatctagccc atgcaggagc 380

Claims

1.一种基于COⅠ基因鉴别绵羊毛与山羊毛的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

(1)提取羊毛的DNA；

(2)利用COⅠ基因引物对提取到的DNA进行PCR扩增，扩增出380bp长度的PCR扩增产物；

2.根据权利要求1所述的一种基于COⅠ基因鉴别绵羊毛与山羊毛的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，COⅠ基因引物包括GS380-F核苷酸序列和GS380-R核苷酸序列，GS380-F核苷酸序列如SEQ ID NO.1，GS380-R核苷酸序列如SEQ ID NO.2。

3.根据权利要求1所述的一种基于COⅠ基因鉴别绵羊毛与山羊毛的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，PCR扩增的反应体系为：加入5μl羊毛DNA、0.5μl的浓度为10μmol/L的上游引物GS380-F、0.5μl的浓度为10μmol/L的下游引物GS380-R、2μl Taq酶缓冲液、2μl dNTP混合液、0.5μl Taq酶溶液，用ddH₂O将总体积补足至20μl；扩增条件为：94℃预变性1min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸5min；最后温度设置4℃保存。

4.根据权利要求1所述的一种基于COⅠ基因鉴别绵羊毛与山羊毛的方法，其特征在于：所述步骤(3)中：

根据以上表格的绵羊和山羊之间的核苷酸序列特征变异位点进行绵羊毛和山羊毛的物种鉴别。