CN112899389B - 一种交趾黄檀的鉴定引物和分子鉴定方法 - Google Patents

一种交趾黄檀的鉴定引物和分子鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种交趾黄檀的鉴定引物和分子鉴定方法。本发明通过对交趾黄檀和其常见冒充种奥氏黄檀和中美洲黄檀的质体基因组进行测序分析，从中筛选出交趾黄檀与其常见冒充种具有显著差异的长度在300bp内的三个序列片段(Dc‑6080、Dc‑2054和Dc‑19410)，并针对这些片段设计出相应的引物。本发明的方法可在10个工作日内获得其质体基因Dc‑6080、Dc‑2054和Dc‑19410序列，通过与交趾黄檀标准样品的序列进行比较，可有效鉴别待鉴定样品。本发明首次解决了依靠传统木材解剖手段无法鉴别交趾黄檀和冒充种的难题，为木材市场等提供一种高效可靠的交趾黄檀鉴别方法，具有较高的应用价值。

Description

一种交趾黄檀的鉴定引物和分子鉴定方法
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种交趾黄檀(Dalbergiacochinchinensis Pierre ex Laness.)的鉴定引物和分子鉴定方法。
背景技术
红木作为高档艺术品或昂贵家具的主要原材料，具有极高的收藏和观赏价值。而交趾黄檀属于红木中重要的酸枝木类。交趾黄檀又名大红酸枝，是豆科蝶形花亚科黄檀族黄檀属(Dalbergia L.)植物，为高大乔木，原产于中南半岛，主产于越南、老挝、柬埔寨和泰国。
目前交趾黄檀在野外极难找到，是珍稀名贵物种，属于国际贸易管制范围。在利益驱动和贸易管制的冲突下，市场上出现大量的冒名顶替，以假乱真，以次充好等乱象及不法行为。其中冒充交趾黄檀最多的物种为奥氏黄檀(D.oliveri Gamble ex Prain)和中美洲黄檀(D.granadillo Pittier)。假冒现象如此普遍的原因在于，传统的木材解剖等鉴定手段原则上只能鉴定到大类，难以鉴定到具体的物种。例如，对于一个样品，利用传统的木材鉴定方法，可将其鉴定为酸枝木类木材，而很难准确鉴定为交趾黄檀或者别的物种。而后续发展出来的稳定同位素，气相色谱法等则受环境因素影响很大，使得鉴定结果具有很大的不确定性，在红木的鉴定运用上尚不成熟，不能进行大范围推广使用。
生物的DNA含有大量的遗传密码信息，这些遗传密码信息可以用于物种之间甚至同一个物种不同个体之间的鉴定，广为人知的人类亲子鉴定便是其中一例。因此，针对性地开发特殊的植物质体DNA测序引物，测得目标物种特异的DNA序列，通过和标准样品进行DNA比对，能够更准确地进行木材样品的原生树种鉴定。这是因为(1)质体DNA为植物所特有，在进行DNA序列测序和比对分析的时候方便排除木材中附带的木材内生真菌DNA的影响；(2)质体DNA在植物中的含量远远高于核DNA，对一些保存状况不甚理想的木材样品，也方便获得足够的DNA进行样品分析；(3)植物质体DNA为环状结构，其中的每个基因仅有一个拷贝，避免了核基因多个拷贝的存在而产生的假阳性现象。
因此，如果能开发一种利用交趾黄檀和其他近缘冒充种质体DNA序列的差异而对二者进行准确鉴定方法，将能弥补传统鉴定方法的不足，为甄别交趾黄檀提供一种有效的鉴定手段。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种交趾黄檀(Dalbergiacochinchinensis Pierre ex Laness.)的鉴定引物和分子鉴定方法。
本发明的第一个目的是提供一种交趾黄檀的鉴定引物组，包括以下引物：
针对Dc-6080序列：
Dc-6080-Tu1F：5’-AAACGGTCTCTCCAACGCAT-3’，Dc-6080-Tu1R：5’-CGCCCTACGTCTGGAAGATT-3’；
针对Dc-2054序列：
Dc-2054-Tu1F：5’-TTGCACACGGCTTTCCCTAT-3’，Dc-2054-Tu1R：5’-TGGATATTCTTTTCAGCAACGATCT-3’；
针对Dc-19410序列：
Dc-19410-Tu1F：5’-TTGTTTGTTGTCTCCATCAGT-3’，Dc-19410-Tu1R：5’-GACGTGAGCAGTCATTAGCA-3’。
本发明的第二个目的是提供一种交趾黄檀的鉴定试剂盒，包括上述的鉴定引物组。
所述的交趾黄檀的鉴定试剂盒，还包括5×PCR Buffer、dNTP Mixture和DNA聚合酶。
本发明的第三个目的是提供一种交趾黄檀的分子鉴定方法，包括以下步骤：提取待测黄檀样品的总DNA作为模板，分别用权利要求1所述的引物对Dc-6080-Tu1F/Dc-6080-Tu1R、Dc-2054-Tu1F/Dc-2054-Tu1R、Dc-19410-Tu1F/Dc-19410-Tu1R作为扩增引物进行PCR扩增，将PCR产物纯化后进行测序，若测序结果分别与交趾黄檀标准样品Dc-6080、Dc-2054和Dc-19410序列一致，则说明该待测黄檀样品为交趾黄檀；若不一致，则说明该待测黄檀样品为其它种。
优选，所述的PCR扩增的反应体系为25μl，包括5×PrimeSTAR Buffer 5μl、dNTPMixture各0.2mM、正向引物0.2μM、反向引物0.2μM、模板DNA 1μl、2.5U/μl DNA聚合酶0.25μl，余量为灭菌蒸馏水。
优选，所述的PCR扩增的PCR程序为95℃预变性3分钟；95℃变性30秒、50-52℃退火30秒、72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。
本发明的第四个目的是提供上述的鉴定引物组或上述的鉴定试剂盒在鉴定交趾黄檀中的应用。
本发明通过对交趾黄檀和其常见冒充种奥氏黄檀和中美洲黄檀的质体基因组进行测序分析，从中筛选出交趾黄檀与其常见冒充种具有显著差异的长度在300bp内的三个序列片段(Dc-6080、Dc-2054和Dc-19410)，并针对这些片段设计出相应的引物。利用这一特性，用这三个序列片段的正/反向引物分别对未知木材样品的总DNA进行PCR扩增，然后对扩增产物进行测序，分别将扩增得到的未知样品的Dc-6080、Dc-2054、Dc-19410序列与标准样品的Dc-6080、Dc-2054、Dc-19410序列进行比对，根据比对的序列一致性结果即可判断该未知样品是否为交趾黄檀。
对于DNA未降解的木材样品，本发明的方法可在10个工作日内获得其质体基因Dc-6080、Dc-2054和Dc-19410序列，通过与交趾黄檀标准样品的序列进行比较，可有效鉴别待鉴定样品。本发明首次解决了依靠传统木材解剖手段无法鉴别交趾黄檀和冒充种的难题，为木材市场、商家、消费者、公安机关、海关和科研机构提供一种高效可靠的交趾黄檀鉴别方法，具有较高的应用价值。
附图说明
图1是交趾黄檀(Dalbergia cochinchinensis)和两个冒充种：奥氏黄檀(D.oliveri)和中美洲黄檀(D.granadillo)的Dc-6080序列比对结果。
图2是交趾黄檀(Dalbergia cochinchinensis)和两个冒充种：奥氏黄檀(D.oliveri)和中美洲黄檀(D.granadillo)的Dc-2054序列比对结果。
图3是交趾黄檀(Dalbergia cochinchinensis)和两个冒充种：奥氏黄檀(D.oliveri)和中美洲黄檀(D.granadillo)的Dc-19410序列比对结果。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：待鉴定木材样品的总DNA提取、纯化，PCR扩增和PCR产物纯化
具体步骤如下：
1.1总DNA提取
(1)利用锯片将2g样品锯成碎末，装入2ml离心管，加入适量的液氮，在自动研磨机中充分研磨成粉末状。
(2)将研磨成粉末状的样品置于50ml离心管中，采用CTAB法提取总DNA。
(3)每管加入CTAB 16ml，β-巯基乙醇320μl，蛋白酶K 20μl，65℃水浴12-24h。
(4)水浴结束后取出离心管，冷却至室温。
(5)加入13ml氯仿/异戊醇(体积比为24:1)，颠倒混匀后，置于-20℃冷冻处理5～10min。
(6)将离心管置于冷冻离心机上4℃、12000rpm离心15min。
(7)将离心后的上清液转移至新的50ml离心管中，重复步骤(5)、(6)。
(8)加入与上清液等体积的异丙醇，置于-20℃，冷冻处理12-24h。
(9)将离心管置于冷冻离心机上4℃、10000rpm离心10min，弃上清液。
(10)3ml体积分数70％乙醇清洗DNA沉淀，并转入2ml离心管(分2管)，4℃、10000rpm离心10min，弃上清液，再加入体积分数70％乙醇重复清洗一次。
(11)将离心管置于真空干燥机中，50℃干燥5min，得到总DNA，加入80～120μl TE缓冲液溶解DNA，4℃或-20℃保存。
1.2总DNA纯化
(1)将还未纯化的总DNA转入1.5ml离心管中，加入等体积的PEG试剂混匀，该PEG浓度为20％，分子量为8000。
(2)将离心管置于水浴锅中37℃处理15min。
(3)12000rpm离心5min，弃上清液。
(4)重复步骤(1)～(3)两次。
(5)加入100μl预冷的体积分数80％乙醇，混匀。12000rpm离心15min，去上清液。
(6)重复步骤(5)。
(7)将离心管置于真空干燥机中，50℃干燥5min，加入5μl纯水溶解DNA。使用NanoDrop2000检测纯化后的DNA浓度，如果浓度低于50ng/μl，则不需再加纯水稀释DNA；如果浓度高于200ng/μl，则加纯水稀释至200ng/μl。
1.3总DNA的PCR扩增
选用大连宝生物公司(Takara)的高保真性PCR聚合酶
Figure GDA0003031709120000061
HS DNAPolymerase，以纯化后的总DNA为模板DNA、以单个目标基因(Dc-6080/Dc-2054/Dc-19410)的正/反向引物进行PCR扩增。
(1)PCR反应体系如表1所示：
表1 PCR反应体系
Figure GDA0003031709120000062
(2)PCR反应条件设置
PCR扩增在东胜龙PCR仪上进行，PCR程序为：95℃3分钟；94℃30秒，50-52℃30秒，72℃1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。由此得到PCR产物。
1.4PCR产物纯化与测序
取PCR产物进行凝胶电泳检测，将有目标条带的PCR产物样品按照上述的总DNA纯化步骤进行纯化。纯化后样品送测序公司进行测序，测序引物用对应基因的PCR反应的正/反向引物，对PCR产物进行双向测序。
实施例2：交趾黄檀特征DNA片段的确定
本发明在多个不同地点采集了交趾黄檀和两个冒充种(中美洲黄檀和奥氏黄檀的3个有花或果、可进行植物学鉴定的样品。对上述采集鉴定好的样品按实施例1步骤1.1和1.2的方法提取和纯化总DNA，得到各样品的可以用于PCR扩增的总DNA。选取三个质体基因片段：Dc-6080、Dc-2054和Dc-19410，设计用于扩增Dc-6080的正/反向引物Dc-6080-Tu1F/Dc-6080-Tu1R，其序列为：5’-AAACGGTCTCTCCAACGCAT-3’/5’-CGCCCTACGTCTGGAAGATT-3’(如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)；设计用于扩增Dc-2054的正/反向引物Dc-2054-Tu1F/Dc-2054-Tu1R，其序列为：5’-TTGCACACGGCTTTCCCTAT-3’/5’-TGGATATTCTTTTCAGCAACGATCT-3’(如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示)，设计用于扩增Dc-19410的正/反向引物Dc-19410-Tu1F/Dc-19410-Tu1R，其序列为5’-TTGTTTGTTGTCTCCATCAGT-3’/5’-GACGTGAGCAGTCATTAGCA-3’(如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示)(见表2)。将这三个质体基因片段的正/反向引物分别以各样品的总DNA为模板，按实施例1步骤1.3的PCR反应体系和反应条件进行PCR扩增，将有目标条带的PCR产物纯化后进行测序。
表2 Dc-6080、Dc-2054和Dc-19410的引物序列表
Figure GDA0003031709120000071
Figure GDA0003031709120000081
分析测序结果发现，同一个种内的Dc-6080或Dc-2054或Dc-19410序列之间是完全一致的，但交趾黄檀和两个冒充种的三个序列间各自存在显著差异：交趾黄檀标准样品如SEQ ID NO.7所示的Dc-6080序列在第30位、第75位和第195位突变为碱基A，在第170位突变为碱基G(图1)；如SEQ ID NO.8所示的Dc-2054序列在第60位、第159位突变为碱基A，在第182位、第203位突变为碱基G(图2)；如SEQ ID NO.9所示的Dc-19410序列在第147位、第203位突变为碱基A，第161位、第226位突变为碱基C，第190位突变为碱基T，第209位突变为碱基G(图3)。这种差异在交趾黄檀和两个冒充种之间是稳定存在的，可以依据它们的Dc-6080、Dc-2054和Dc-19410序列的差异来区分样品是否为交趾黄檀。
交趾黄檀(Dalbergia cochinchinensis Pierre ex Laness.)Dc-6080序列
Figure GDA0003031709120000082
Figure GDA0003031709120000083
(如SEQ ID NO.7所示，下划线为引物位置，加粗、斜体加下划线为突变碱基)
交趾黄檀(Dalbergia cochinchinensis Pierre ex Laness.)Dc-2054序列
Figure GDA0003031709120000091
Figure GDA0003031709120000092
(如SEQID NO.8所示，下划线为引物位置，加粗、斜体加下划线为突变碱基)
交趾黄檀(Dalbergia cochinchinensis Pierre ex Laness.)Dc-19410序列
Figure GDA0003031709120000093
Figure GDA0003031709120000094
(如SEQ IDNO.9所示，下划线为引物位置，加粗、斜体加下划线为突变碱基)
利用交趾黄檀和两个冒充种之间的这种差异，对于未知黄檀样品，只需扩增出该样品的Dc-6080、Dc-2054和Dc-19410序列并进行测序，然后将测序结果分别与交趾黄檀标准样品的Dc-6080(如SEQ ID NO.7所示)、Dc-2054(如SEQ ID NO.8所示)和Dc-19410序列(如SEQ ID NO.9所示)进行DNA比对(即将测序得到的Dc-6080序列与SEQ ID NO.7进行比对，将测序得到的Dc-2054序列与SEQ ID NO.8进行比对，将测序得到的Dc-19410序列与SEQID NO.9进行比对)，若该未知黄檀样品的Dc-6080、Dc-2054和Dc-19410序列分别与SEQ IDNO.7，SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9一致，则说明该未知黄檀样品为交趾黄檀；若不一致，则说明是冒充种。
实施例3：鉴定未知黄檀样品
对于未知黄檀样品MN251247，传统鉴定方法无法确定其为交趾黄檀还是冒充种。因此，我们采用比较质体基因Dc-6080、Dc-2054和Dc-19410序列的方法进行鉴定。
具体实施步骤如下：先按实施例1步骤1.1和1.2的方法提取并纯化该样品总DNA，然后分别用Dc-6080的正/反向引物Dc-6080-Tu1F/Dc-6080-Tu1R，Dc-2054的正/反向引物Dc-2054-Tu1F/Dc-2054-Tu1R，Dc-19410的正/反向引物Dc-19410-Tu1F和Dc-19410-Tu1R按实施例1步骤1.3的PCR反应体系和条件进行扩增，将有目标条带的PCR产物纯化后进行测序，将测得的序列结果分别与交趾黄檀标准样品的Dc-6080、Dc-2054和Dc-19410序列进行比对，结果表明该未知黄檀样品Dc-6080、Dc-2054和Dc-19410序列与交趾黄檀标准样品Dc-6080、Dc-2054和Dc-19410序列一致的支持率均大于99.95％，不支持与其它黄檀种类聚为一支，由此，精确地鉴定了所检测的未知黄檀样品为交趾黄檀，该鉴定结果较传统木材鉴定方法更稳定可靠。
序列表
<110> 中国科学院华南植物园
<120> 一种交趾黄檀的鉴定引物和分子鉴定方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaacggtctc tccaacgcat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgccctacgt ctggaagatt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttgcacacgg ctttccctat 20
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggatattct tttcagcaac gatct 25
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttgtttgttg tctccatcag t 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gacgtgagca gtcattagca 20
<210> 7
<211> 261
<212> DNA
<213> 交趾黄檀(Dalbergia cochinchinensis Pierre ex Laness.)
<400> 7
aaacggtctc tccaacgcat aaatggttga gaattcacat tttcatcatc tttggtaaaa 60
tcaagtccac cgcgaagaca ttcataaact gctcgaccgt aattcttagc ggataacccc 120
aatttcggtt taatagtaca tcccaatagg ggacggccat acttgtttag tttatctctt 180
tcaacttgga taccatgagg cggaccttgg aaagttttaa tataagaagt agggattcgc 240
aaatcttcca gacgtagggc g 261
<210> 8
<211> 235
<212> DNA
<213> 交趾黄檀(Dalbergia cochinchinensis Pierre ex Laness.)
<400> 8
ttgcacacgg ctttccctat gtatacatct aaacccgagt aacttaccca gaacaacaaa 60
actctacgaa agttaaatac tcagttgatg aatcccgaat cctccctttt atcttactac 120
ataaacattt cagaatccta tagatataga atactaataa aaatgaattc attttttagg 180
agaatttcta tttatccatt tagattgacc agatcgttgc tgaaaagaat atcca 235
<210> 9
<211> 292
<212> DNA
<213> 交趾黄檀(Dalbergia cochinchinensis Pierre ex Laness.)
<400> 9
ttgtttgttg tctccatcag taaaataaaa cagatcattt ctaatttcta taggaacagc 60
caatcaaaaa caaaaaattt cattatatcc cttctaaaat gaaaatcgtt ctattttatt 120
tcgtctggta tttcgtagag ataaacaata tgtggataca ctagagtaga gaattccccc 180
cctttttttt tgttattcaa acaaaaatgg aaactaaaaa aaaaacgaga ccctaaaaaa 240
ctaaatagaa ataccagtat gtcctctagc aatgctaatg actgctcacg tc 292

Claims (7)

1.一种交趾黄檀的鉴定引物组，其特征在于，包括以下引物：
针对Dc-6080引物序列：
Dc-6080-Tu1F：5’-AAACGGTCTCTCCAACGCAT-3’，Dc-6080-Tu1R：5’-CGCCCTACGTCTGGAAGATT-3’；
针对Dc-2054引物序列：
Dc-2054-Tu1F：5’-TTGCACACGGCTTTCCCTAT-3’，Dc-2054-Tu1R：5’-TGGATATTCTTTTCAGCAACGATCT-3’；
针对Dc-19410引物序列：
Dc-19410-Tu1F：5’-TTGTTTGTTGTCTCCATCAGT-3’，Dc-19410-Tu1R：5’-GACGTGAGCAGTCATTAGCA-3。
2.一种交趾黄檀的鉴定试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的鉴定引物组。
3. 根据权利要求2所述的交趾黄檀的鉴定试剂盒，其特征在于，还包括5×PCR 缓冲液、dNTP 混合液和DNA聚合酶。
4.一种交趾黄檀的分子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测黄檀样品的总DNA作为模板，分别用权利要求1所述的引物对Dc-6080-Tu1F/Dc-6080-Tu1R、Dc-2054-Tu1F/Dc-2054-Tu1R和Dc-19410-Tu1F/Dc-19410-Tu1R作为扩增引物进行PCR扩增，将PCR产物纯化后进行测序，若三者的测序结果分别与交趾黄檀标准样品Dc-6080、Dc-2054和Dc- 19410序列一致，则说明该待测黄檀样品为交趾黄檀；若任一测序结果不一致，则说明该待测黄檀样品为其它种。
5. 根据权利要求4所述的交趾黄檀的分子鉴定方法，其特征在于，所述的PCR扩增的反应体系为25μl，包括5×PrimerSTAR 缓冲液 5μl、dNTP 混合液各0.2mM、正向引物0.2μM、反向引物0.2μM、模板DNA 1μl、2.5U/μl DNA聚合酶0.25μl，余量为灭菌蒸馏水。
6.根据权利要求4所述的交趾黄檀的分子鉴定方法，其特征在于，所述的PCR扩增的PCR程序为95℃预变性3分钟；95℃变性30秒、50-52℃退火30秒、72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。
7.权利要求1所述的鉴定引物组或权利要求2所述的鉴定试剂盒在鉴定交趾黄檀中的应用。
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