CN110066880A - 一种快速定性检测四大家鱼鱼肉制品的方法 - Google Patents

一种快速定性检测四大家鱼鱼肉制品的方法 Download PDF

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张�林
何力
甘金华
周剑光
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Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
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Abstract

本发明公开了一种快速定性检测四大家鱼鱼肉制品的方法，包括如下步骤：1、待测鱼肉样品中DNA的提取；2、设计引物组合物：3、PCR扩增：4、根据特征条带的长度判断待测鱼肉样品的种类。本发明通过对已报到的四大家鱼基因组序列进行比对，筛选青鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼四大家鱼鉴别基因、设计了4对特异性引物，采用多重PCR方法，运用基因克隆技术和生物信息学技术，建立同时针对青鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼的准确、快速、高效的多重PCR检测方法。

Description

一种快速定性检测四大家鱼鱼肉制品的方法
技术领域
本发明属于水产品质量安全检测技术领域，具体涉及一种快速定性检测四大家鱼鱼肉制品的方法。
背景技术
我国是水产品生产大国，也是水产品加工、出口大国，水产品及其加工品在我国经济与对外贸易中均占有举足轻重的地位。随着国内国际贸易的增加，世界范围内水产品及其加工品消费量的增长，不同物种但无明显形态学特征的水产加工品之间价格的差异，往往导致掺杂使假等商业欺诈事件的发生，不仅损害了公平贸易，也给食品安全带来了挑战，因此建立方便快捷的水产品品种真伪鉴别方法势在必行。
鱼肉制品由于种类、营养及品质等方面的不同，导致其经济价值差异很大。据报道，近年来我国鱼肉制品的标签存在标识错误的问题或不法商贩为追求利润，以次充好，如油鱼冒充鳕鱼[1]，或掺入廉价鱼肉品种，一方面会影响产品的保藏，出现老化，劣化等现象，影响鱼糜制品生产企业的后续加工；另一方面，这种掺假行为严重扰乱了行业正常秩序，严重侵犯了消费者的知情权，严重损害了消费者的利益，并且存在一定的食品安全[2]。为了维护鱼肉制品尤其是鱼糜产业的健康发展，迫切需要建立鱼肉制品成分的快速检测方法。
四大家鱼(青鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼)鱼肉制品(鱼片、鱼丸、鱼糕、鱼排等)的消费量逐年增大，超市、餐厅随处可见。由于不能从外观等形态学方面来鉴定其品种，因此就有不法商家以低值品种的鱼假冒高值的鱼。而对于青鱼、草鱼、鲢、鳙4种鱼肉制品的快速检测方法还未有相关报道，因此急需针对四大家鱼鱼肉制品建立快速、准确、高效的鉴定方法。
发明内容
基于上述现有技术，本发明提供了一种快速定性检测四大家鱼鱼肉制品的方法，本发明通过对已报到的四大家鱼基因组序列进行比对，筛选青鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼四大家鱼鉴别基因、设计了4对特异性引物，采用多重PCR方法，运用基因克隆技术和生物信息学技术，建立同时针对青鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼的准确、快速、高效的多重PCR检测方法。
实现本发明上述目的所采用的技术方案为：
一种快速定性检测四大家鱼鱼肉制品的方法，包括如下步骤：
1、待测鱼肉样品中DNA的提取；
2、设计引物组合物：
所述的引物组合包括：
以青鱼D-LOOP基因为靶基因设计的一对引物：
上游引物D-LOOP-F：5’-TGTAGTAAGAGACCACCAACTGATT-3’，
下游引物D-LOOP-R：5’-CAACCTTGATTTTTATTTGAGCCTG-3’；
以草鱼COI基因为靶基因设计的一对引物：
上游引物COI-F：5’-TGGGAACCGCTCTAAGCCTTCTCAT-3’，
下游引物COI-R：5’-TAATAGTAGGAGGAAAGAAGGGGGT-3’；
以鲢鱼16SrRNA基因为靶基因设计的一对引物：
上游引物16SrRNA-F：5’-ATTTTTTTACCTGAGTATGGGAGAC-3，
下游引物16SrRNA-R：5’-TCACCAGGTTCGGTAGGTCTGTCAC-3’；
以鳙鱼12SrRNA基因为靶基因设计的一对引物：
上游引物12SrRNA-F：5’-TAGTTGATAAAACCACGGCGTAAAG-3，
下游引物12SrRNA-R：5’-TTGTCAGTGCTTTAGTGTTATGTAT-3’。
3、进行PCR扩增，将所得的PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，以无PCR扩增产物作为阴性对照；
4、根据特征条带的长度判断待测鱼肉样品的种类：
青鱼D-LOOP基因扩增片段在298bp处出现特异性条带，草鱼COI基因扩增片段在210bp处出现特异性条带，鲢鱼16SrRNA基因扩增片段在306bp处出现特异性条带，鳙鱼12SrRNA基因扩增片段在639bp处出现特异性条带；
若在298bp、210bp、306bp、639bp处分别出现预期特异性条带，则表明所检测的鱼肉制品中含有青鱼、草鱼、鲢鱼或鳙鱼；若在298bp和210bp处均出现预期特异性条带，则表明所检测的鱼肉制品中含有青鱼和草鱼；若在298bp和306bp处均出现预期特异性条带，则表明所检测的鱼肉制品中含有青鱼和鲢鱼；若在298bp和639bp处均出现预期特异性条带，则表明所检测的鱼肉制品中含有青鱼和鳙鱼；若在210bp和306bp处均出现预期特异性条带，则表明所检测的鱼肉制品中含有草鱼和鲢鱼；若在210bp和639bp处均出现预期特异性条带，则表明所检测的鱼肉制品中含有草鱼和鳙鱼；若在306bp和639bp处均出现预期特异性条带，则表明所检测的鱼肉制品中含有鲢鱼和鳙鱼；若在298bp、210bp和306bp处均出现预期特异性条带，则表明所检测的鱼肉制品中含有青鱼、草鱼和鲢鱼；若在298bp、210bp和639bp处均出现预期特异性条带，则表明所检测的鱼肉制品中含有青鱼、草鱼和鳙鱼；若在210bp、306bp和639bp处均出现预期特异性条带，则表明所检测的鱼肉制品中含有草鱼、鲢鱼和鳙鱼；若在298bp、210bp、306bp和639bp处均出现预期特异性条带，则表明所检测的鱼肉制品中含有青鱼、草鱼、鲢鱼和鳙鱼。
进一步，PCR反应体系25.0μL，包括：
PCR反应条件：
95℃预变性3min；95℃预变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，循环35次；72℃延伸8min。
与现有技术相比，本发明的有益效果和优点在于：
1、本发明针对四大家鱼鱼肉制品，通过对已经报道的青鱼、草鱼、鲢、鳙基因组序列的比对分析，选取青鱼D-LOOP基因、草鱼的COI基因、鲢鱼16SrRNA基因和鳙鱼12SrRNA基因作为目的基因，自行设计上述基因序列的种属特异性引物，利用该4种引物进行种属特异性PCR和多重PCR技术，通过琼脂糖凝胶电泳图谱分析，建立了四大家鱼鱼肉制品的快速定性检测方法。
2、本发明在选取目的基因时，避开四大家鱼间重复序列区域，以免扩增多重产物时互相干扰，造成特异性不高的问题。
3、本发明利用设计的组合引物对常见的四大家鱼鱼肉制品进行检测，具有简便、快速和成本低的特点，而且检测效率高，准确性好，灵敏度高，最低检测标准要比传统的方法低的多，分别将纯化后的PCR产物构建到T载体，提取质粒，再进行多重PCR检测，最低检测标准分别为：0.5、50、50、0.5pg质粒，重复性好。
附图说明
图1为单重PCR扩增4种鱼肉加工制品的凝胶电泳图：
其中，1为青鱼肉加工制品对应的泳道，2为草鱼肉加工制品对应的泳道、3为鲢鱼肉加工制品对应的泳道、4-鳙鱼肉加工制品对应的泳道。
图2为青鱼肉制品单重PCR扩增及不同组合的鱼肉加工的多重PCR扩增的凝胶电泳图：
其中，1为青鱼肉加工制品对应的泳道，2为草、鳙鱼肉的混合鱼肉加工制品对应的泳道，3为青、鳙鱼肉的混合鱼肉加工制品对应的泳道，4为鲢、鳙鱼肉的混合鱼肉加工制品对应的泳道。
图3为青鱼肉制品单重PCR扩增及不同组合的鱼肉加工的多重PCR扩增的凝胶电泳图：
其中，1为草、青鱼肉的混合鱼肉加工制品对应的泳道，2为青、鲢鱼肉的混合鱼肉加工制品对应的泳道，3为草、鳙鱼肉的混合鱼肉加工制品对应的泳道，4为草、鲢鱼肉的混合鱼肉加工制品对应的泳道，5为草鱼肉加工制品对应的泳道，6为阴性对照的无菌水的对应的泳道。
图4为鲢鱼肉制品单重PCR扩增及不同组合的鱼肉加工的多重PCR扩增的凝胶电泳图：
其中，1为阴性对照的无菌水的对应的泳道，2为青、鲢鱼肉的混合鱼肉加工制品对应的泳道，3为青、鲢、鳙鱼肉的混合鱼肉加工制品对应的泳道，4为鲢、鳙鱼肉的混合鱼肉加工制品对应的泳道，5为草、鲢鱼肉的混合鱼肉加工制品对应的泳道，6为鲢鱼肉加工制品对应的泳道。
图5为不同组合的鱼肉加工的多重PCR扩增的凝胶电泳图：
其中，1为青、草、鲢、鳙鱼肉的混合鱼肉加工制品对应的泳道，2为青、草、鳙鱼肉的混合鱼肉加工制品对应的泳道，3为青、草、鲢鱼肉的混合鱼肉加工制品对应的泳道。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
1、实验材料
1.1实验材料：2017年5月，从市场上随机采集标签为青鱼、草鱼、鲢、鳙等鱼肉加工制品以及冷冻鱼、鱼排、鱼丸、鱼糕、鱼片等待测鱼肉样品，置于－20℃冰箱保存备用；
1.2、试验试剂：
Taq DNA聚合酶、MgCl2、dNTPs(2.5mmol/L)、10×PCR Buffer、100bp DNA ladder均购自Takara公司；无水乙醇、氯仿、异戊醇、异丙醇购自上海国药集团；Tris-平衡酚(pH8.0)购自北京索莱宝科技有限公司；Top10感受态、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、TIANampGenomic DNAKit基因组DNA提取试剂盒(以下简称试剂盒)均购自天根生化科技(北京)有限公司。
1.3、仪器和设备：
高速冷冻离心机购自德国Hettich公司；凝胶成像系统购自美国伯乐公司；Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白测定仪、PCR仪均购自Thermo公司，DYCP-31E琼脂糖水平电泳槽、DYY-12型均购自电泳仪北京六一仪器厂。
2、试验方法：
2.1、鱼肉制品DNA提取的方法
采用TIANamp Genomic DNAKit基因组DNA提取试剂盒提取基因组：
1、称取待测鱼肉样品100mg研磨处理为细胞悬液，10000rpm离心1min，倒尽上清液，加200μl缓冲液GA，震荡至彻底悬浮，加20μl Proteinase K溶液，混匀，在56℃放置直至组织溶解；
2、加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置5min，接着加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec；
3、将上一步所得的上清液和絮状沉淀都加入试剂盒的吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500μl缓冲液GD，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中，将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置3min，12000rpm离心2min，所得的滤液即为待测鱼肉样品的DNA模板，将所得的滤液转入离心管中，-20℃储存备用。
2.2、DNA纯度及质量浓度的测定：
吸取稀释后的DNA模板2μL，以不含DNA的去离子水作为空白对照，使用微量核酸蛋白测定仪测定DNA模板的质量浓度及A260nm/A280nm，其中A260nm/A280nm用于估测DNA的纯度，然后根据DNA的质量浓度，计算样品DNA得率，DNA的质量浓度与DNA得率分别根据以下公式计算：
DNA的质量浓度/(ng/μL)＝A260nm×50×稀释倍数；
DNA得率[6]＝DNA(μg)/组织(mg)；
2.3、扩增目的基因及引物设计
以青鱼D-LOOP、草鱼COI、鲢16SrRNA、鳙12SrRNA基因为研究对象，根据GenBank中已发表的基因序列，应用DNAStar中MEGALIGN程序找出各基因的保守区，运用Primer 5.0引物设计软件，设计4对特异性引物，引物均由上海生物科技有限公司合成，具体如表1所示：
表1目的基因名称及引物序列
Table 1 Primers information in this study
2.4单一PCR扩增及特异性分析：
先对4种鱼肉制品(青鱼、草鱼、鲢、鳙)进行单独扩增，反应体系为25μL，10×PCRbuffer(含Mg2+)2.5μL、上、下游引物各0.5μL(10umol/L)、dNTPs 2μL、模板DNA 2μL、Taq酶0.3μL(5U/μL)，其余用去离子水补足。
PCR扩增条件：预变性95℃3min；94m变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；72延伸8min，PCR产物于1.5％琼脂糖凝胶中电泳，阴性对照均无扩增产物的灭菌水，阳性克隆送往上海生物科技有限公司测序，与GenBank中相应序列进行比对。
2.5、模板质粒的构建：
构建含有特异基因片段的质粒作为优化多重PCR的模板以及检测单重或多重PCR灵敏度，纯化试剂盒纯化PCR产物后分别克隆至pMD18T载体，重组质粒用质粒抽提试剂盒进行提取，重组质粒分别经PCR和DNA测序验证。
2.6、单管多重PCR的优化：
为优化多重PCR的反应条件，根据多次试验，对引物浓度、模板量、MgCl2浓度、退火温度初步确定范围，引物浓度初步确定(0.2-1mmol/L)，模板量(0.02-70pg)、MgCl2浓度(1-2mmol/L)、退火温度(50-62℃)，采取固定其它因子，改变某一因子的方式，设计L16(43)正交试验，确定最佳反应条件，分别对4种鱼肉制品进行检测，多重PCR产物于2.0％琼脂糖电泳，观察产物条带。
2.7、多重PCR特异性和敏感性测定：
2.7.1、多重PCR特异性和敏感性测定：
为进一步验证多重PCR的特异性，分别以4种含目标片段的单一质粒为模板，同时加入4对引物进行扩增；另外，选取其它含目标片段的重组质粒，随机组合，同时加入4对引物进行扩增；
2.7.2、多重PCR敏感性测定：
用分光光度计测定质粒的DNA浓度，每种鱼肉制品检测灵敏度通过检测一系列连续稀释(1:10)靶序列质粒中的最高稀释倍数确定，按已优化的多重PCR反应条件分别进行扩增，测定多重PCR的灵敏性。
2.8、人工模拟样品的检测和市售水产品的验证：
为验证多重PCR对青鱼、草鱼、鲢、鳙成分检测的准确性，利用建立的多重PCR方法对50份人工模拟样品和60份市售水产品样本进行了检测，通过对特异性引物进行单重PCR检测以及阳性样本的PCR产物DNA测序进行验证，具体方法如下：
将4种鱼肉制成鱼糜，任意2种、3种或4种随机混合，制成人工模拟鱼糜混合样品，每种鱼糜成分不低于2％，分别取人工模拟的混合鱼糜样品1g，提取DNA，构建重组质粒，进行PCR检测。
在市场上随机采集标签为以上4种无形态特征的鱼片、鱼丸、鱼糕、鱼排各15份(共60份)，在4℃冰箱里贮藏2d，然后无菌操作取样品各25g均质成鱼糜，然后各取1g鱼糜，提取DNA，构建重组质粒，进行多重PCR检测，同时用常规方法和单一PCR检测，以验证建立的多重PCR检测方法的可行性与准确性。
3、结果：
3.1、单一PCR扩增和核苷酸序列分析：
青鱼、草鱼、鲢和鳙模板DNA在加入各自的特异性引物扩增时，分别得到预计的PCR产物片段，其凝胶电泳图如图1所示，由图1可知，青鱼肉加工制品(核苷酸序列如SEQ IDNO：9)在298bp处出现特异性条带，草鱼肉加工制品(核苷酸序列如SEQ ID NO：10)在210bp处出现特异性条带，鲢鱼肉加工制品(核苷酸序列如SEQ ID NO：11)在306bp处出现特异性条带，鳙鱼肉加工制品(核苷酸序列如SEQ ID NO：12)在639bp处出现特异性条带。而且经克隆测序，所扩增目的片段分别与GenBank中相应基因序列同源性为98.1％～99.5％。
3.2、单管多重PCR的扩增及其条件的优化：
对不同的反应组分和不同反应条件下的多重PCR，通过检测含有4种鱼肉目标片段的质粒进行条件优化。初步条件下在单管中未同时扩增出4种目的基因片段，只能扩增2条目的片段，另外1条目的片段模糊，经试验优化后，2.5％琼脂糖凝胶电泳显示在210、298、306和639bp处有4条明显的目的条带存在。
优化后的多重PCR反应条件：1.5mmol/L MgCl2、模板质粒4μL(青鱼、草鱼、鲢、鳙各1μL)、组合引物3.2μL(青鱼上下游引物各0.5μL(10umol/L)、草鱼上下游引物0.5μL(10umol/L)、鲢上下游引物0.3μL(10umol/L)、鳙上下游引物0.3μL(10umol/L))、dNTPs 2.5μL(2.5mmol/L)、Taq酶0.5μL(5U/μL)、10×PCR buffer 2.5μL，其余用去离子水补足，总体积25μL。
多重PCR扩增条件：预变性95℃3min；94m变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；72延伸8min。
3.3、多重PCR的特异性：
当不同组合的鱼肉加工制品(1种、2种、3种或4种)进行多重PCR时，可以扩增各自的目的基因产物，并且能通过琼脂糖凝胶电泳鉴定区分，阴性对照均无扩增产物的灭菌水，结果如图2-图5所示。
图2为青鱼肉制品单重PCR扩增及不同组合的鱼肉加工的多重PCR扩增的凝胶电泳图，由图2可知，青鱼肉加工制品在298bp处出现特异性条带，草鱼肉和鳙鱼肉的混合鱼肉加工制品在210bp和639bp处出现特异性条带，青鱼肉和鳙鱼肉的混合鱼肉加工制品在298bp和639bp处出现特异性条带，鲢鱼肉和鳙鱼肉的混合鱼肉加工制品在306bp和639bp处出现特异性条带。
图3为青鱼肉制品单重PCR扩增及不同组合的鱼肉加工的多重PCR扩增的凝胶电泳图，由图3可知，草鱼肉和青鱼肉的混合鱼肉加工制品在210bp和298bp处出现特异性条带，青鱼肉和鲢鱼肉的混合鱼肉加工制品在298bp和306bp处出现特异性条带，草鱼肉和鳙鱼肉的混合鱼肉加工制品在210bp和639bp处出现特异性条带，草鱼肉和鲢鱼肉的混合鱼肉加工制品在210bp和306bp处出现特异性条带，青鱼肉加工制品在298bp处出现特异性条带。
图4为鲢鱼肉制品单重PCR扩增及不同组合的鱼肉加工的多重PCR扩增的凝胶电泳图，由图4可知，青鱼肉和鲢鱼肉的混合鱼肉加工制品在298bp和306bp处出现特异性条带，草鱼肉、鲢鱼肉和鳙鱼肉的混合鱼肉加工制品在210bp、306bp和639bp处出现特异性条带，鲢鱼肉和鳙鱼肉的混合鱼肉加工制品在306bp和639bp处出现特异性条带，草鱼肉和鲢鱼肉的混合鱼肉加工制品在210bp和306bp处出现特异性条带，鲢鱼肉加工制品在306bp处出现特异性条带。
图5为不同组合的鱼肉加工的多重PCR扩增的凝胶电泳图，由图5可知，青鱼肉、草鱼肉、鲢鱼肉和鳙鱼肉的混合鱼肉加工制品在298bp、210bp、306bp和639bp处出现特异性条带，青鱼肉、草鱼肉和鳙鱼肉的混合鱼肉加工制品在298bp、210bp和639bp处出现特异性条带，青鱼肉、草鱼肉和鲢鱼肉的混合鱼肉加工制品在298bp、210bp和306bp处出现特异性条带。
3.4、多重PCR的灵敏度检测：
对含目标片段的青鱼、草鱼、鲢、鳙重组质粒的多重PCR检测，灵敏度分别是0.5、50、50、0.5pg；而单重PCR检测灵敏度分别是0.5、0.5、0.5、0.05pg，结果表明多重PCR具有和单重PCR相同或稍微弱的灵敏度，差1-2个数量级，差异不显著(P>0.05)。
3.5、人工制作鱼糜样品和市售水产品验证结果
50份人工制作鱼糜样品，运用优化后的多重PCR反应体系，能够扩增出相应的特异性条带。试验证明4种随机混合后的鱼糜样品能够同时检测出成份，并且无非特异性扩增，说明该多重PCR检测方法对青鱼、草鱼、鲢、鳙有很好的特异性和敏感性。
多重PCR对随机采集的60份市售鱼肉样品检测结果：
22份市售鱼肉样品检测为鲢鱼肉样品、20份市售鱼肉样品检测为草鱼肉制品、5份市售鱼肉样品检测为青鱼肉制品、5份市售鱼肉样品检测为鳙鱼肉制品，5份市售鱼肉样品检测为草鱼和鲢鱼的混合鱼肉制品，2份市售鱼肉样品检测为青鱼、草鱼和鲢鱼的混合鱼肉制品，1份市售鱼肉样品检测为鲢鱼和鳙鱼的混合鱼肉制品，与单一PCR检测结果一致。
结果表明，该多重PCR检测结果准确可靠，无漏检。
序列表
<110> 中国水产科学研究院长江水产研究所
<120> 一种快速定性检测四大家鱼鱼肉制品的方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtagtaaga gaccaccaac tgatt 25
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<212> DNA
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tgggaaccgc tctaagcctt ctcat 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
taatagtagg aggaaagaag ggggt 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atttttttac ctgagtatgg gagac 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcaccaggtt cggtaggtct gtcac 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tagttgataa aaccacggcg taaag 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttgtcagtgc tttagtgtta tgtat 25
<210> 9
<211> 298
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgtagtaaga gaccaccaac tgatttatat taatgtatat tattaatgat agaatcaggg 60
acaaaaattg tagacgggta tggagtgaat tattccttgc atctggttcc tatttcaggg 120
acatgactgt agaattccac cctcggaaaa tcttaactgg catttgatta atgatatgag 180
tacatactct tcattaaccc aacatgccga gcattctttt atatgcatag gggttctcct 240
tttggtttcc tttcatttta catctcagag tgcagactca aataacaaat caaggttg 298
<210> 10
<211> 210
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgggaaccgc tctaagcctt ctcattcgag ccgaactaag ccaacccgga tcacttctgg 60
gcgatgatca aatttataat gttattgtca ctgcccatgc cttcgtaata attttcttta 120
tagtaatacc aattcttatt ggagggtttg gaaattgact cgtaccatta ataattggag 180
cacccgacat agcattccca cgaataaaca 210
<210> 11
<211> 306
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atttttttac ctgagtatgg gagacagaaa aggttcaacc taaaagcaat agagaaagta 60
ccgcaaggga aagctgaaag agaaatgaaa caacccatat aagcactaaa aaacaaagac 120
taaaccttgt accttttgca tcatgattta gccagcaccc tcaagcaaag agacctttag 180
tttgaaaccc cgaaaccagg tgagctaccc cgagacagcc tattaaaatt tagggctaac 240
ccgtctctgt ggcaaaagag tgggaagagc tccgggtaga agtgacagac ctaccgaacc 300
tggtga 306
<210> 12
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tagttgataa aaccacggcg taaagggtgg ttaaggaaag caaaacaaat taaagccaaa 60
tggccctttg gccgtcatac gcttctaggt gtccgaagcc caattatacg aaagtagctt 120
tattaaagcc caccctgacc ccacgaaagc tgagaaacaa actgggatta gataccccca 180
ctatgctcag ccataaacct agacatccaa ctacaattag acgtccgcct gggtactacg 240
agcattagct tgaaacccaa aggactgacg gtgccttaga cccccctaga ggagcctgtt 300
ctagaaccga taacccccgt taaacctcac cacttctagc catcccagcc tatataccgc 360
cgtcgtcagc ttaccctgtg aaggcaataa aagtaagcaa aatgggcaca acccagaacg 420
tcaggtcgag gtgtagcgta cgaagtggga agaaatgggc tacattttct atcacagaac 480
actacgaaca tgcaacatga aatagtgctt gaaggaggat ttagtagtaa aaaggaagca 540
gagtgtcctt ttgaactcgg ctctgaggcg cgtacacacc gcccgtcact ctcccctgtc 600
aaaacgcaac aaagatacat aacactaaag cactgacaa 639

Claims (2)

1.一种快速定性检测四大家鱼鱼肉制品的方法，其特征在于包括如下步骤：
1.1、待测鱼肉样品中DNA的提取；
1.2、设计引物组合物：
所述的引物组合包括：
以青鱼D-LOOP基因为靶基因设计的一对引物：
上游引物D-LOOP-F：5’-TGTAGTAAGAGACCACCAACTGATT-3’，
下游引物D-LOOP-R：5’-CAACCTTGATTTTTATTTGAGCCTG-3’；
以草鱼COI基因为靶基因设计的一对引物：
上游引物COI-F：5’-TGGGAACCGCTCTAAGCCTTCTCAT-3’，
下游引物COI-R：5’-TAATAGTAGGAGGAAAGAAGGGGGT-3’；
以鲢鱼16SrRNA基因为靶基因设计的一对引物：
上游引物16SrRNA-F：5’-ATTTTTTTACCTGAGTATGGGAGAC-3，
下游引物16SrRNA-R：5’-TCACCAGGTTCGGTAGGTCTGTCAC-3’；
以鳙鱼12SrRNA基因为靶基因设计的一对引物：
上游引物12SrRNA-F：5’-TAGTTGATAAAACCACGGCGTAAAG-3，
下游引物12SrRNA-R：5’-TTGTCAGTGCTTTAGTGTTATGTAT-3’。
1.3、进行PCR扩增，将所得的PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，以无PCR扩增产物作为阴性对照；
1.4、根据特征条带的长度判断待测鱼肉样品的种类：
青鱼D-LOOP基因扩增片段在298bp处出现特异性条带，草鱼COI基因扩增片段在210bp处出现特异性条带，鲢鱼16SrRNA基因扩增片段在306bp处出现特异性条带，鳙鱼12SrRNA基因扩增片段在639bp处出现特异性条带。
2.根据权利要求1所述的快速定性检测四大家鱼鱼肉制品的方法，其特征在于：所述的PCR反应体系25.0μL，包括：
用ddH2O补足至25.0μL；
PCR反应条件：
95℃预变性3min；95℃预变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，循环35次；72℃延伸8min。
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