CN111748609A

CN111748609A - 鉴别鱼类源性成分的引物及鉴定方法

Info

Publication number: CN111748609A
Application number: CN202010586034.9A
Authority: CN
Inventors: 王守伟; 许随根; 李家鹏; 李金春; 熊苏玥; 韦忆萱; 刘睿茜; 杨君娜; 陈曦; 曲超; 乔晓玲
Original assignee: China Meat Research Centre
Current assignee: China Meat Research Centre
Priority date: 2020-06-23
Filing date: 2020-06-23
Publication date: 2020-10-09
Anticipated expiration: 2040-06-23
Also published as: CN111748609B

Abstract

本发明公开了鉴别鱼类源性成分的引物及鉴定方法。本发明提供三对特异性引物(SEQ ID NO:1‑6)，基于多重实时荧光PCR熔解曲线鉴别鱼类或鱼肉制品中是否含有蓝鳍金枪鱼、银鳕鱼、油鱼三种动物源性成分。本方法具有检测精准、特异性强、灵敏度高、简便快速的优点，能满足大批量、快速鉴别鱼类或鱼肉制品中是否含有蓝鳍金枪鱼、银鳕鱼、油鱼源性成分的要求，具有巨大市场需求和广阔的应用前景。

Description

鉴别鱼类源性成分的引物及鉴定方法

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，具体地说，涉及一种鉴别鱼类源性成分的引物及鉴定方法。

背景技术

随着人们生活水平日益提高，水产类食品越来越受消费者青睐，特别是营养价值较高的金枪鱼和银鳕鱼的消费需求在不断增长。金枪鱼以营养价值高、纯天然、无污染而享誉国际市场，享有“海洋黄金”之称，其中，蓝鳍金枪鱼(Thunnus thynnus)有“金枪鱼之王”的雅称；蓝鳍金枪鱼肉富含二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五稀酸(EPA)、酪胺酸、牛磺酸、核酸、铁、钙、钾、多种必须氨基酸和维生素B12等营养成分，多食可促进儿童大脑、骨骼、牙齿发育，能预防和辅助治疗缺铁性贫血；能促进新陈代谢延缓衰老，延缓记忆衰退，能预防和辅助治疗老年痴呆、动脉硬化、糖尿病、高血压、衰老。蓝鳍金枪鱼肉的热量低，且富含优质蛋白质和其他营养元素，深受女性喜欢，其肉质鲜美甘甜,口感滑腻,油脂丰富，肉色淡红，是餐客的最爱,也是生鱼片的上选材料，具有很高的经济价值。随着大量的捕捞，蓝鳍金枪鱼也变得越来越稀有，价格也越来越昂贵。银鳕鱼(Anoplopoma fimbria)含有大量的不饱和脂肪酸，含丰富蛋白质、多种必须氨基酸、维生素A、维生素D、B族维生素、钙、镁、硒等营养元素，营养丰富、肉味甘美，易于消化，深受婴幼儿喜好。油鱼(Lepidocybiumflavobrunneum)外形酷似银鳕鱼，常被用于冒充银鳕鱼，但其肌肉及内脏富含蜡质油脂，易导致腹泻，危害消费者健康。因此，亟需开发一种灵敏、特异的蓝鳍金枪鱼和银鳕鱼及其鱼肉制品的鉴定方法。

发明内容

本发明的目的是提供鉴别鱼类源性成分的引物及鉴定方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供鉴别蓝鳍金枪鱼(Thunnus thynnus)源性成分的引物，包括如SEQ ID NO:1所示的正向引物和如SEQ ID NO:2所示的反向引物。

第二方面，本发明提供鉴别银鳕鱼(Anoplopoma fimbria)源性成分的引物，包括如SEQ ID NO:3所示的正向引物和如SEQ ID NO:4所示的反向引物。

第三方面，本发明提供鉴别油鱼(Lepidocybium flavobrunneum)源性成分的引物，包括如SEQ ID NO:5所示的正向引物和如SEQ ID NO:6所示的反向引物。

第四方面，本发明提供鉴别鱼类源性成分的引物组合，所述鱼类选自蓝鳍金枪鱼、银鳕鱼和油鱼中的至少两种。

优选地，该引物组合由SEQ ID NO:1-2、SEQ ID NO:3-4和SEQ ID NO:5-6所示引物组成。

第五方面，本发明提供含有所述引物或其组合的检测试剂或试剂盒。

第六方面，本发明提供鱼类源性成分的鉴定方法，所述鱼类选自蓝鳍金枪鱼、银鳕鱼和油鱼中的至少一种，所述方法包括：利用上述引物组合对待测样本进行多重PCR检测。

具体方法包括：

1)提取待测鱼类或鱼肉制品的DNA；

2)以DNA为模板，利用SEQ ID NO:1-6所示引物进行多重实时荧光PCR(多重RT-PCR)扩增并绘制熔解曲线；

3)根据熔解曲线判定结果。可根据熔解曲线峰的高度值定量样品中各鱼类源性成分的含量，即实现定性检测的同时，还可达到定量检测的目的。

优选地，多重实时荧光PCR所使用反应体系为：

其中，蓝鳍金枪鱼引物F和蓝鳍金枪鱼引物R的序列如SEQ ID NO:1-2所示，银鳕鱼引物F和银鳕鱼引物R的序列如SEQ ID NO:3-4所示，油鱼引物F和油鱼引物R的序列如SEQID NO:5-6所示。

优选地，多重实时荧光PCR的反应条件为：95℃5min；95℃10～15s，55～60℃45～60s，35个循环。更优选地，PCR反应条件为：95℃5min；95℃10s，58℃45s，35个循环。

优选地，熔解曲线的制作条件为：95℃1min，65～70℃1min，以0.02～0.05℃/s速率升温至95℃。更优选地，熔解曲线的制作条件为：95℃1min，70℃1min，以0.02℃/s速率升温至95℃。

同时连续检测荧光强度；将温度降至40℃保持60s，以荧光信号对温度的一阶负导数为纵坐标，温度为横坐标，得到熔解峰值图。每种特异性扩增产物Tm值的熔解峰代表一种特定的鱼类源性成分。

前述的方法，根据熔解曲线中峰的个数和位置判定结果，具体为：在73.9～76.4℃温度范围内出现熔解峰为蓝鳍金枪鱼源性成分检出；在77.5～79.8℃温度范围内出现熔解峰为银鳕鱼源性成分检出；在81.8～83.1℃温度范围内出现熔解峰为油鱼源性成分检出。

第七方面，本发明提供上述方法在鱼类或鱼肉制品中蓝鳍金枪鱼、银鳕鱼、油鱼源性成分鉴别中的应用。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明针对蓝鳍金枪鱼、银鳕鱼和油鱼的市场检测需求，利用SYBR Green荧光定量PCR的熔解曲线分析法开发出可同时检测蓝鳍金枪鱼、银鳕鱼、油鱼三个物种的多重PCR检测方法，实现了多物种的同步快速检测，同时降低检测成本，能够满足多样品的快速检测需求，具有很好的应用前景。

(二)本发明提供的多重RT-PCR熔解曲线分析方法采用全密闭反应管检测与结果分析，无需进行后续PCR产物电泳检测与分析，简化操作流程、降低实验检测成本，提高检测效率、避免样品和环境的交叉污染。

(三)本发明提供的多重RT-PCR反应具有良好的特异性，保证该方法能够特异性的检出物种源性成分，避免了假阳性。本发明的多重RT-PCR熔解曲线分析方法还具有较高的灵敏度，对蓝鳍金枪鱼、银鳕鱼、油鱼源性成分检测灵敏度可达皮克级。本发明提供的多重PCR鱼类检测方法具有较低的检出限，待检鱼类或鱼肉制品中，蓝鳍金枪鱼源性成分检出限为0.5％，银鳕鱼源性成分检出限为1％，油鱼源性成分检出限为0.5％。

(四)本发明使低成本实现高通量多物种同步检测成为现实，大幅降低了检测成本，提高了检测效率和准确率，并能够实现定量检测，对加强鱼类市场监管、有效抵御鱼肉制品掺假，保护消费者和相关水产品企业利益尤为重要。本检测方法的推广应用为保障水产品的质量，保护消费者知情权和选择权，维护正常的社会秩序等提供了技术支持。该方法可以在渔业养殖、食品质量安全监督、国际贸易食品质量检测、食品加工企业原料保证等方面推广应用，具有巨大的市场需求和应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中部分不同引物浓度的配比体系的特异性验证结果。其中，A～F分别表示蓝鳍金枪鱼引物对(C-21-1-F/R)、银鳕鱼引物对(C-23-1-F/R)和油鱼引物对(C-22-4-F/R)引物浓度配比分别为0.6:2.0:0.8、1.1:2.0:0.8、1.0:2.0:1.6、1.1:2.0:1.6、1.1:2.0:1.5、1.1:2.0:1.1的RT-PCR体系的熔解峰值图谱。

图2为本发明较佳实施例中鉴别鱼类或鱼肉制品中3种鱼类源性成分的熔解峰值图谱。其中，1：蓝鳍金枪鱼源性成分熔解峰；2：银鳕鱼源性成分熔解峰；3：油鱼源性成分熔解峰。

图3为本发明较佳实施例中鉴别方法对蓝鳍金枪鱼或蓝鳍金枪鱼肉制品的灵敏度检验结果图。

图4为本发明较佳实施例中鉴别方法对银鳕鱼或银鳕鱼肉制品的灵敏度检验结果图。

图5为本发明较佳实施例中鉴别方法对油鱼或油鱼肉制品的灵敏度检验结果图。

具体实施方式

本发明为了弥补现有鱼类或鱼肉制品中物种来源鉴定方面的不足，提供一种基于多重RT-PCR熔解曲线分析的鉴别鱼类及鱼肉制品中物种源性成分的方法，特别是一种用于快速鉴别鱼类或鱼肉制品中蓝鳍金枪鱼、银鳕鱼、油鱼3种源性成分的多重RT-PCR熔解曲线分析方法，为确定金枪鱼、银鳕鱼、油鱼的物种来源提供技术手段，从而确保食品与标签的一致性。

本发明还提供一种鉴别鱼类或鱼肉制品中动物源性成分的特异性引物组合。

本发明的技术方案如下：

本发明以蓝鳍金枪鱼、银鳕鱼、油鱼线粒体DNA为靶序列分别设计3对特异性引物：蓝鳍金枪鱼F/蓝鳍金枪鱼R、银鳕鱼F/银鳕鱼R、油鱼F/油鱼R，其中，蓝鳍金枪鱼F/蓝鳍金枪鱼R可扩增蓝鳍金枪鱼源性成分；银鳕鱼F/银鳕鱼R可扩增银鳕鱼源性成分；油鱼F/油鱼R可扩增油鱼源性成分。各特异性引物扩增产物Tm值具有显著性差异，可通过熔解峰值图谱分析进行鉴别。各特异性引物序列如下：

对蓝鳍金枪鱼源性成分扩增时所采用的正向特异性引物为：

蓝鳍金枪鱼F：5’-TCAACATTCATTTCGAATTCAAGCG-3’(SEQ ID NO:1)

对蓝鳍金枪鱼源性成分扩增时所采用的反向特异性引物为：

蓝鳍金枪鱼R：5’-TTTACGAGATGTCAGAGATGAGGAG-3’(SEQ ID NO:2)

对银鳕鱼源性成分扩增时所采用的正向特异性引物为：

银鳕鱼F：5’-CCCCCTAAGTACACTAGAGTTTATT-3’(SEQ ID NO:3)

对银鳕鱼源性成分扩增时所采用的反向特异性引物为：

银鳕鱼R：5’-GTACTCTTTGCTTGGTATACACTCA-3’(SEQ ID NO:4)

对油鱼源性成分扩增时所采用的正向特异性引物为：

油鱼F：5’-AACCTTTACGCTGTTCATATTGG-3’(SEQ ID NO:5)

对油鱼源性成分扩增时所采用的反向特异性引物为：

油鱼R：5’-GGGTTTGTAAGTGATCGTTCCCA-3’(SEQ ID NO:6)

本发明首先提供了含有上述3对特异性引物对的引物组合，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-6所示。

本发明提供了含有上述引物组合的试剂盒或检测试剂。

本发明提供了上述引物组合在鉴别鱼类或鱼肉制品中物种源性成分中的用途，所述鱼类为蓝鳍金枪鱼、银鳕鱼和油鱼。

本发明提供了含有上述引物组合的试剂盒或检测试剂在鉴别鱼类或鱼肉制品中物种源性成分中的用途，所述鱼类为蓝鳍金枪鱼、银鳕鱼和油鱼。

本发明还提供了上述引物组合在保障鱼类食品安全中的应用。

本发明提供一种鉴别鱼类或鱼肉制品中物种源性成分的方法，应用本发明提供的含有核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-6所示的引物组合，以待测鱼类或鱼肉制品的DNA为模板，使用RT-PCR方法进行检测，根据熔解峰值图中峰的个数和位置判定结果。

模板的制备方法为：将鱼肉或鱼肉制品与灭菌去离子双蒸水以1∶3～1∶5的重量比混合，用组织匀浆机10000～14000r/min均质5～10min，制成组织匀浆液。使用组织DNA提取试剂盒提取样品基因组总DNA。

进一步地，RT-PCR方法中，PCR反应体系采用25μL，所含组分：

RT-PCR反应条件为：95℃5min；95℃10～15s，55～60℃45～60s，35个循环。

熔解曲线制作条件为：95℃1min，65～70℃1min，以0.02～0.05℃/s速率升温至95℃。同时连续检测荧光强度；将温度降至40℃保持60s，以荧光信号对温度的一阶负导数为纵坐标，温度为横坐标，得到熔解峰值图。每种特异性扩增产物Tm值的熔解峰代表一种特定的鱼类源性成分。

每一种特异性扩增产物Tm值的熔解峰代表一种特定的鱼类源性成分，其中，Tm值在73.9～76.4℃范围内出现熔解峰为蓝鳍金枪鱼源性成分检出；Tm值在77.5～79.8℃范围内出现熔解峰为银鳕鱼源性成分检出；Tm值在81.8～83.1℃范围内出现熔解峰为油鱼源性成分检出。

本发明提供了上述方法在鱼类或鱼肉制品物种源性成分鉴别中的应用。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中涉及的主要仪器设备：荧光定量PCR仪(Roche 480)、冷冻台式离心机(Eppendorf 5417R,德国)、微量移液器(2.5ul、10ul、100ul、1000ul)、均质仪(OmniPrep,美国)，荧光酶标仪(Bio tek Snergy H4,美国)等。主要试剂：Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit试剂盒购自Qiagen公司，SYBR Green I Master预混液购自罗氏中国有限公司，引物对由赛默飞世尔科技公司合成。

实施例1三重RT-PCR的引物体系的特异性

1、引物的设计与合成

测序结合NCBI数据库获取6种金枪鱼、8种鳕鱼、银鳕鱼、油鱼(异鳞蛇鲭)、三文鱼、黄鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼、鲤鱼、青鱼、燕鲅鱼、鲐鲅鱼、剑旗鱼等26种鱼类共260份样本的线粒体DNA序列信息，通过序列比对，找出种内保守性好、种间特异性好、具有较大Tm值差异的引物组合48组(蓝鳍金枪鱼特异性引物3对，银鳕鱼特异性引物4对，油鱼特异性引物4对)，经过Oligo 7.56引物体系评估，NCBI上BLAST对引物特异性进行验证，进一步筛选出8对候选组合(蓝鳍金枪鱼引物2对、银鳕鱼引物2对、油鱼引物2对)，通过试验对候选组合的性能指标进行进一步测定，最后筛选出来组合4(蓝鳍金枪鱼引物对C-21-1-F/R、银鳕鱼引物对C-23-1-F/R、油鱼引物对C-22-4-F/R)具有合适的熔解曲线区间，确定此组合体系为多重RT-PCR引物组合体系。最终，蓝鳍金枪鱼的特异性引物设计在线粒体DNA的D-loop区，银鳕鱼的特异性引物设计在线粒体DNA的16S rRNA基因，油鱼的特异性引物设计在线粒体DNA的nd4l基因。设计引物所依据的mtDNA基因组上的DNA区段的序列如下：

蓝鳍金枪鱼引物所在基因片段序列(D-loop区)，片段长度105bp：

tcaacattcatcctgaattcaggcgattaaacgagatttaagacctaacataaacctaaatcgtctaagccacaccaagtctcctcatctctgacatctcgtaaa

银鳕鱼引物所在基因片段序列(16S rRNA)，片段长度208bp：

ccccctaagtacactagagtttatttaaacaaaccatttttccccctaagtataggcgatagaaaagggcttacggcgcaatagagaaagtaccgcaagggaaagctgaaaaagaagtgaaagaaatcagtaaagcctagagaagcagagattaaagctcgtaccttttgcatcatgatttagtgagtgtataccaagcaaagagtac

油鱼引物所在基因片段序列(nd4l)，片段长度257bp：

aacctttacgctgttcatattggcactgacaggacttgcattccaccgcacccatctcctgtcagccctcctatgcctagaagcaataatactgtcactctttctaagcctatcaatctgaacactacaacaaaactcctccaactcatcaatccctcctataattgtcctatctttttcagcctgcgaagccagcgtggggctctccctaatagtagccactaaccgaacccatgggaacgatcacttacaaaccc

对蓝鳍金枪鱼源性成分扩增时所采用的正向特异性引物为：

蓝鳍金枪鱼F：5’-TCAACATTCATTTCGAATTCAAGCG-3’(SEQ ID NO:1)

对蓝鳍金枪鱼源性成分扩增时所采用的反向特异性引物为：

蓝鳍金枪鱼R：5’-TTTACGAGATGTCAGAGATGAGGAG-3’(SEQ ID NO:2)

对银鳕鱼源性成分扩增时所采用的正向特异性引物为：

银鳕鱼F：5’-CCCCCTAAGTACACTAGAGTTTATT-3’(SEQ ID NO:3)

对银鳕鱼源性成分扩增时所采用的反向特异性引物为：

银鳕鱼R：5’-GTACTCTTTGCTTGGTATACACTCA-3’(SEQ ID NO:4)

对油鱼源性成分扩增时所采用的正向特异性引物为：

油鱼F：5’-AACCTTTACGCTGTTCATATTGG-3’(SEQ ID NO:5)

对油鱼源性成分扩增时所采用的反向特异性引物为：

油鱼R：5’-GGGTTTGTAAGTGATCGTTCCCA-3’(SEQ ID NO:6)

2、样品处理方法

将鱼去鳞片，畜禽肉去筋膜，取肌肉剪碎，分别称取3g蓝鳍金枪鱼、黄鳍金枪鱼、马苏金枪鱼、大目金枪鱼、银鳕鱼、三文鱼、黄鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼、鲤鱼、青鱼、油鱼、燕鲅鱼、鲐鲅鱼、剑旗鱼、猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、驴、马24个物种样品至离心管。按照肉水重量比1∶4准确称取并进行匀浆，均质仪转速10000r/min，匀浆时间10min，吸取150μL匀浆液于1.5mL离心管中。

3、DNA提取方法

使用DNeasy动物组织的DNA提取试剂盒提取各物种DNA，按照试剂盒说明书进行操作。提取的DNA采用荧光酶标仪测定260nm和280nm处的吸光值，计算DNA浓度和纯度。

4、多重RT-PCR反应

(1)针对构建的RT-PCR体系(蓝鳍金枪鱼引物对C-21-1-F/R、银鳕鱼引物对C-23-1-F/R、油鱼引物对C-22-4-F/R)进行了引物浓度配比的优化。不同引物浓度的配比见表1。部分不同引物浓度的配比体系的特异性验证结果如图1所示，根据各物种源性的特异性及熔解峰高的不同，最终选定组合4(C-21-1-F/R、C-23-1-F/R、C-22-4-F/R)的体系18作为检测的最终体系。PCR反应体系采用25μl，包括：SYBR Green I Master预混液、模板2μl，蓝鳍金枪鱼、银鳕鱼、油鱼的特异性引物，具体添加量见表2。

表1特异性引物组合及引物浓度体系

注：引物C-21-1-F/R、引物C-23-1-F/R和引物C-22-4-F/R的序列分别如SEQ IDNO:1-2、SEQ ID NO:3-4和SEQ ID NO:5-6所示。

表2多重RT-PCR反应体系组分及配比

(2)多重RT-PCR扩增反应及熔解曲线制作条件为：95℃变性5min；95℃变性10s，58℃退火及延伸45s，35个循环。

熔解曲线制作：95℃1min，70℃1min，以0.02℃/s速率升温至95℃。同时连续检测荧光强度；将温度降至40℃保持60s。

三对引物混合体系的三重RT-PCR特异性检测结果如表3所示，反应体系含有模板DNA 10ng。从表3可以看出，利用本发明提供的3对特异性引物可特异性扩增出蓝鳍金枪鱼、银鳕鱼、油鱼源性成分，而对其他鱼类成分在35个循环内无典型扩增曲线出现。制作熔解曲线峰值图的结果见图2。

表3多重RT-PCR的引物特异性

注：“－”表示阴性样品。

由图2及表4的结果可知，每一种特异性扩增产物Tm值的熔解峰代表一种特定的动物源性成分，Tm值在73.9～76.4℃温度范围内出现熔解峰为蓝鳍金枪鱼源性成分检出；Tm值在77.5～79.8℃温度范围内出现熔解峰为银鳕鱼源性成分检出；Tm值在81.8～83.1℃温度范围内出现熔解峰为油鱼源性成分检出。

按照表4制作不同源性成分组合的混合样品(每种混合样品中各物种成分比例相同)，采用上述方法进行检测，结果如表4所示，样品熔解峰的出峰位置与混合样品中物种成分均一致，也说明本发明的多重RT-PCR体系具有良好的特异性。

表4不同源性成分组合的混合样品熔解峰图谱分析结果

注：“+”表示在相应温度范围内出现熔解峰，“－”表示在未出现熔解峰。

实施例2鉴别鱼类物种源性成分方法的灵敏度检验

取蓝鳍金枪鱼、银鳕鱼、油鱼肌肉，并分别提取3种肉的DNA，计算DNA浓度和纯度。将3种DNA样品浓度均稀释至5ng/μL，然后再10倍梯度稀释至10⁴，备用。参照实施例1的RT-PCR进行检测，并制备熔解曲线。结果见图3～图5。

由图3～图5可以看出，采用本发明的多重RT-PCR扩增方法并对熔解峰值图进行分析，蓝鳍金枪鱼DNA稀释10⁴倍后，油鱼DNA稀释10⁴倍后，银鳕鱼DNA稀释10⁴倍后，仍可出现熔解峰，因此，本方法对蓝鳍金枪鱼、银鳕鱼、油鱼源性成分检测灵敏度可达皮克级。

实施例3鉴别鱼肉中物种源性成分方法检出限检验

取蓝鳍金枪鱼、银鳕鱼、油鱼肌肉用绞肉机分别绞成肉馅，按照表5所示比例称取各肉种，制成20g混合肉样，加入80g灭菌去离子双蒸水，用均质仪12000r/min均质3min，14000r/min均质2min。制成混合肉样组织匀浆液。用100μL微量移液器吸取100μL匀浆液至1.5mL离心管中。

表5混合肉样中各肉种成分含量表(％为质量百分比)

参照实施例1的RT-PCR进行检测，并制备熔解曲线。结果如表5所示，采用本发明提供的方法检测混合鱼肉制品中物种源性成分时，蓝鳍金枪鱼源性成分检出限为0.5％，银鳕鱼源性成分检出限为1％，油鱼源性成分检出限为0.5％。

实施例4鉴别鱼肉中物种源性成分方法半定量检验

表6混合肉样中各肉种成分含量表(％为质量百分比)

按照表6所示比例制作不同物种源性成分含量的混合DNA样品，参照实施例1的RT-PCR进行检测，并制备熔解曲线。统计分析不同质量分数含量混合DNA的熔解曲线峰面积、峰高度和Tm值，发现各物种源性成分的DNA含量与其熔解曲线峰面积、峰高度、Tm值呈一定的数量关系，因此，测试样品时引入各物种浓度梯度样品，根据样品熔解峰面积、峰高度、峰位置(Tm值)能够估算混合肉样中各鱼类源性成分含量，各混合样品中各物种源性成分的回收率在80％～130％之间。

蓝鳍金枪鱼DNA含量与熔解曲线峰高度之间的关系式：

y＝0.001668x³–0.020524x²+0.12954x-0.002106

R²＝0.9961

其中，y:蓝鳍金枪鱼源性DNA的百分含量；

x:蓝鳍金枪鱼熔解曲线峰高度值。

银鳕鱼DNA含量与熔解曲线峰高度之间的关系式：

y＝0.001307x³–0.021754x²+0.16146x–0.01166

R²＝0.9999

其中，y:银鳕鱼源性DNA的百分含量；

x:银鳕鱼熔解曲线峰高度值。

油鱼DNA含量与熔解曲线峰高度之间的关系式：

y＝0.000975x³–0.020608x²+0.18526x+0.009415

R²＝0.999

其中，y:油鱼源性DNA的百分含量；

x:油鱼熔解曲线峰高度值。

实施例5鱼类样品/鱼肉制品的鉴定

采用本方法对40份鱼类样品及鱼肉制品进行了源性成分鉴定，具体操作参见实施例1。检测结果表明，Tm值在73.9～76.4℃温度范围内出现熔解峰(蓝鳍金枪鱼源性成分)的有4份样品；Tm值在77.5～79.8℃温度范围内出现熔解峰(银鳕鱼源性成分)的有8份样品；Tm值在81.8～83.1℃温度范围内出现熔解峰(油鱼源性成分)的有7份样品；Tm值在70～90℃温度范围内未出现任何熔解峰的有22份样品。

表7鱼类样品分类及检测结果

从表7可以看出，金枪鱼切块、银鳕鱼切块、烤鳕鱼片、金枪鱼罐头、鳕鱼罐头等各类鱼肉制品中均存在掺假情况，掺假率达22.5％，其中烤鳕鱼片食品掺假最为严重，掺假率高达37.5％，大多采用油鱼、鲶鱼等其他廉价鱼肉替代或掺假。表明该方法可以用于生鲜制品和热加工制品的检测(烤鳕鱼片、鳕鱼罐头、金枪鱼罐头为高温热加工制品)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国肉类食品综合研究中心

<120> 鉴别鱼类源性成分的引物及鉴定方法

<130> KHP201112680.1

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcaacattca tttcgaattc aagcg 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tttacgagat gtcagagatg aggag 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccccctaagt acactagagt ttatt 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtactctttg cttggtatac actca 25

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aacctttacg ctgttcatat tgg 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gggtttgtaa gtgatcgttc cca 23

Claims

1.鉴别蓝鳍金枪鱼(Thunnus thynnus)源性成分的引物，其特征在于，包括如SEQ IDNO:1所示的正向引物和如SEQ ID NO:2所示的反向引物。

2.鉴别银鳕鱼(Anoplopoma fimbria)源性成分的引物，其特征在于，包括如SEQ IDNO:3所示的正向引物和如SEQ ID NO:4所示的反向引物。

3.鉴别油鱼(Lepidocybium flavobrunneum)源性成分的引物，其特征在于，包括如SEQID NO:5所示的正向引物和如SEQ ID NO:6所示的反向引物。

4.鉴别鱼类源性成分的引物组合，其特征在于，所述鱼类选自蓝鳍金枪鱼、银鳕鱼和油鱼中的至少两种；

鉴别蓝鳍金枪鱼、银鳕鱼和油鱼源性成分的引物分别如SEQ ID NO:1-2、SEQ ID NO:3-4和SEQ ID NO:5-6所示。

5.根据权利要求4所述的引物组合，其特征在于，由SEQ ID NO:1-2、SEQ ID NO:3-4和SEQ ID NO:5-6所示引物组成。

6.含有权利要求1-3任一项所述引物或权利要求4或5所述引物组合的检测试剂或试剂盒。

7.鱼类源性成分的鉴定方法，其特征在于，所述鱼类选自蓝鳍金枪鱼、银鳕鱼和油鱼中的至少一种，所述方法包括：利用权利要求5所述引物组合对待测样本进行多重PCR检测。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括：

1)提取待测鱼类或鱼肉制品的DNA；

2)以DNA为模板，利用SEQ ID NO:1-6所示引物进行多重实时荧光PCR扩增并绘制熔解曲线；

3)根据熔解曲线判定结果。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，多重实时荧光PCR所使用反应体系为：

其中，蓝鳍金枪鱼引物F和蓝鳍金枪鱼引物R的序列如SEQ ID NO:1-2所示，银鳕鱼引物F和银鳕鱼引物R的序列如SEQ ID NO:3-4所示，油鱼引物F和油鱼引物R的序列如SEQ IDNO:5-6所示；和/或

多重实时荧光PCR的反应条件为：95℃5min；95℃10～15s，55～60℃45～60s，35个循环；和/或

熔解曲线的制作条件为：95℃1min，65～70℃1min，以0.02～0.05℃/s速率升温至95℃。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，根据熔解曲线中峰的个数和位置判定结果，具体为：在73.9～76.4℃温度范围内出现熔解峰为蓝鳍金枪鱼源性成分检出；在77.5～79.8℃温度范围内出现熔解峰为银鳕鱼源性成分检出；在81.8～83.1℃温度范围内出现熔解峰为油鱼源性成分检出。