KR101794634B1 - 원료육 판별을 위한 실시간 pcr 키트 및 방법 - Google Patents

원료육 판별을 위한 실시간 pcr 키트 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 소 특이적 검출용 프라이머 세트; 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 돼지 특이적 검출용 프라이머 세트; 및 서열번호 5로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 닭 특이적 검출용 프라이머 세트를 포함하는 판별 대상 육가공 제품 내에 소, 돼지 및 닭 원료육의 포함여부 판정용 실시간 PCR 키트를 제공한다.

Description

원료육 판별을 위한 실시간 PCR 키트 및 방법{A kit and method for detecting of raw meat using real-time PCR}
본 발명은 실시간 PCR 키트 및 방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 원료육 판별을 위한 실시간 PCR 키트 및 방법에 관한 것이다.
최근 우리나라는 국민소득의 향상과 더불어 핵가족화, 맞벌이 부부의 증가 등으로 인하여 식생활 문화가 경량화, 고급화되는 추세이며 이에 따라 가공식품의 수요도 증가하고 있다. 지금까지의 육가공제품 생산현황을 보면 1981년 4,587톤에 비해 2002년 157,230톤으로 약 40배가 증가하였으며 육가공산업이 크게 성장하고 있음을 알 수 있고 우리나라 주부를 대상으로 한 설문조사에서 육가공품에 대한 신뢰도는 54.1%으로 낮은 편에 속했다. 특히 그에 따른 이유로는 첨가물 및 위해요소가 44.1%로 높은 비율을 차지하였다. 이런 이유 중 하나는 소비자의 건강, 특히 햄과 소시지 같은 육가공품은 어린이기호품으로서 특정 동물 단백질에 알레르기가 있는 소비자에게는 제품 표기사항이 매우 중요하다. 또한 최근 식품위생과 안전에 소비자들의 관심이 커지면서 할랄(halal)이라는 이슬람의 식품규제인증도 이슈화되고 있다. 할랄식품 중 육가공품은 무슬림에서 허용된 식육 도살법으로 처리되어야 하며 제한된 종만 이용된 식품을 뜻하는 것으로 위생적으로 도축되며 돼지고기를 금하고 있기 때문에 최근 웰빙유행과도 잘 맞아 무슬림 소비자들 뿐 아니라 우리나라 소비자들에게도 영향을 끼치고 있는 것으로 보인다. 따라서 이러한 변화 역시 식품에서의 종식별이 중요한 이유 중 하나이다. 식육을 분석하는 이화학적방법으로는 단백질과 DNA를 이용하는데 단백질을 검사하는 방법은 열처리, 물리적 처리, 다양한 성분의 혼입에 따른 화학적 처리를 거치는 가공식품에 대한 검출방법으로서는 한계가 있다. 따라서 신속하고 간편하게 미량의 시료로도 증폭이 가능한 PCR(Polymerase Chain Reaction)분석법이 활용되고 있으며 특히 PCR은 극소량의 DNA로 특정 염기서열영역을 특이적으로 증폭함으로써 정확하고 감수성이 매우 좋은 종 판별법으로 알려져 있다. 예를 들어, 여러 가지 PCR 방법 중 기본이 되는 single PCR로 종 특이 primer를 이용하여 원료육을 분석하는 연구가 진행되어 왔고 두 가지 이상의 primer를 사용하여 다수의 target DNA를 동시에 증폭함으로써 혼합 된 시료에서 여러 종을 신속하고 간편하게 검출해 낼 수 있는 multiplex PCR로 원료육 분석을 한 연구도 진행되고 있다. 이처럼 여러 연구에 의해 종 판별법을 보고 하였으나 아직 그 수와 표기된 축종을 모두 식별한 경우는 많지 않다. 또한 연구 중 실제 판매하는 육가공품 분석에 절대정량과 상대정량을 이용하여 수행한 연구는 미비한 실정이다. 이와 관련하여 대한민국 공개특허 제2016-0058301호는 식품 내 원료육 검출 또는 정량용 프라이머 세트 및 이를 이용한 원료육 검출 또는 정량 방법에 대해 개시하고 있다.
그러나 상기선행기술의 경우, 여러 시료를 분석할 경우 과정이 복잡하여 신속하게 분석할 수 없는 문제점이 존재한다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 혼합된 시료로부터 증폭산물을 실시간으로 모니터링 하는 것이 가능하고, 그 산물의 확인과 정량화가 가능하여 여러 축종을 신속하고 간편하게 검출할 수 있는 원료육 판별을 위한 실시간 PCR 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 소 특이적 검출용 프라이머 세트; 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 돼지 특이적 검출용 프라이머 세트; 및 서열번호 5로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 닭 특이적 검출용 프라이머 세트를 포함하는 판별 대상 육가공 제품 내에 소, 돼지 및 닭 원료육의 포함여부 판정용 실시간 PCR 키트가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 판별 대상 육가공 제품으로부터 게놈 DNA를 추출하는 추출단계; 상기 추출된 게놈 DNA를 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 소 특이적 검출용 프라이머 세트; 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 돼지 특이적 검출용 프라이머 세트; 및 서열번호 5로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 닭 특이적 검출용 프라이머 세트를 사용하여 실시간 증폭하는 DNA 증폭 단계; 및 상기 실시간 증폭 과정을 모니터링하는 모니터링 단계를 포함하는, 실시간 PCR에 의한 육가공제품 내의 소, 돼지 또는 닭 원료육 포함 여부 판정방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 육가공품에 주로 이용되는 축종의 원료육 성분의 증폭산물을 실시간으로 모니터링하고 정량화하는 것이 가능하여 대체된 원료성분을 신속하고 간편하게 검출할 수 있어 육가공제품의 허위기재를 방지하는 효과가 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 소, 돼지 및 닭의 종 특이도(species specific)를 확인하기 위해 종 특이 프라이머를 이용하여 Real-time PCR을 수행한 결과 증폭 곡선 및 용융 곡선을 관찰한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 소, 돼지, 닭 DNA를 이용하여 절대정량 분석을 수행한 결과 각 축종별 표준곡선(standard curve)을 관찰한 그래프이다. (a), 소; (b), 돼지; (c), 닭 및 수직선 (d), 10번 반복 표적 프라이머; (e), 표적 프라이머; (f), 18S rRNA primer.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 "미토콘드리아(mitochondria)"는 세포 내 세포소기관의 하나로 자기복제가 가능한 mtDNA를 포함하고 있다. 개별 미토콘드리아는 3-4 개의 mtDNA 사본들을 내포하고 있으나, 세포의 위치와 분화정도에 따라 1 개의 세포 내에 존재하는 미토콘드리아의 수는 수십에서 수백에 이르며, 난자의 경우는 1만 개 이상의 미토콘드리아를 보유하고 있다.
본 문서에서 사용되는 "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산서열로 상보적인 핵산의 주형 (template)과 염기쌍 (base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을위한 시약(즉, DNA 폴리머라아제)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보올리고뉴클레오티드 또는 리보올리고뉴클레오티드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
본 문서에서 사용되는 "프라이머 세트(primer set)"는 특정 서열 DNA를 증폭하기 위한 프라이머의 조합을 의미하고 하나의 프라이머 세트에는 통상 2가지 프라이머가 포함되나 이를 초과하는 경우도 있다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 소 특이적 검출용 프라이머 세트; 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 돼지 특이적 검출용 프라이머 세트; 및 서열번호 5로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 닭 특이적 검출용 프라이머 세트를 포함하는 판별 대상 육가공 제품 내에 소, 돼지 및 닭 원료육의 포함여부 판정용 실시간 PCR 키트가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 판별 대상 육가공 제품으로부터 게놈 DNA를 추출하는 추출단계; 상기 추출된 게놈 DNA를 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 소 특이적 검출용 프라이머 세트; 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 돼지 특이적 검출용 프라이머 세트; 및 서열번호 5로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 닭 특이적 검출용 프라이머 세트를 사용하여 실시간 증폭하는 DNA 증폭 단계; 및 상기 실시간 증폭 과정을 모니터링하는 모니터링 단계를 포함하는, 실시간 PCR에 의한 육가공제품 내의 소, 돼지 또는 닭 원료육 포함 여부 판정방법이 제공된다.
상기 판정방법에 있어서, 상기 DNA 증폭 단계는 킬레이팅 형광물질의 존재하에 수행될 수 있고 상기 킬레이팅 형광물질은 사이버그린(SyBr Green)일 수 있다.
상기 판정방법에 있어서, 상기 DNA 증폭 단계는 육가공제품 게놈 DNA로부터 18S rDNA를 증폭할 수 있는 범용 프라이머 세트가 추가로 사용될 수 있고 상기 범용 프라이머 세트는 서열번호 7로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 8로 기재되는 핵산서열로 구성될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 샘플준비 및 DNA 추울
본 발명의 일 실시예에 따라 종 식별을 위한 식육원료는 소(Bos taurus), 돼지(Sus scrofa) 및 닭(Gallus gallus)이며 시중에서 판매되는 소고기 12개, 돼지고기 5개, 닭고기 7개 제품을 각각 구입하였다. 육가공품은 12개 브랜드의 햄류(8개), 소시지류(23개), 떡갈비류(7개), 패티류(7개), 캔류(7개) 등 5개 형태로 분류하여 총 52개의 제품을 사용하였다. 각 원료육과 육가공품에서의 genomic DNA 추출은 제조사의 방법에 따라 DNeasy Blood & Tissue kit(Qiagen, germany)를 이용하여 추출하였다. 상기 추출된 DNA는 NanoDrop ND-1000 분광광도계(Thermo, USA)로 흡광도를 측정하고 10 ng/㎕의 DNA를 PCR 증폭을 위한 주형으로 이용하였다.
실시예 2: 가열육 제조 및 DNA추출
본 발명의 일 실시예에 따라 원료육에서 열처리 하였을 때의 종 특이성을 평가하기 위하여 인위적으로 소, 돼지 및 닭 원료육 5 g을 식육가공품의 가공조건을 고려하여 70℃에서 30분간 열처리하였고 제조사의 방법에 따라 DNeasy Blood & Tissue kit(Qiagen, germany)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 상기 추출된 DNA는 NanoDrop ND-1000 분광광도계(Thermo, USA)로 흡광도를 측정하고 35 ng/㎕ DNA를 PCR 증폭을 위한 주형으로 이용하였다.
실시예 3: 프라이머 디자인
본 발명의 일 실시예에 따라 종 특이 프라이머(primer)는 clustal W(version 2.1)을 사용하여 NCBI GenBank database에서 제공된 각 축종의 mtDNA(D-loop, Cytochrome b)의 염기서열을 정렬한 뒤 primer3 프로그램(http://sourceforge.net/projects/primer3/)을 이용하였고 PCR 어닐링(annealing) 온도 차이를 최소화 시키면서 각각 다른 크기로 증폭되도록 하였으며 소, 돼지는 Cyt-b, 닭은 D-loop에서 설계하였다. 또한 유전자 보정을 위한 항존유전자(housekeeping gene)는 18S ribosomal RNA를 이용하였으며 소, 돼지 및 닭의 염기서열을 clustal W(version 2.1)로 정렬한 뒤 공통서열을 찾아 설계하였다(표 1 참조).
타겟 종 유전자 접근번호 프라이머 염기서열(5'→3') 증폭 크기(bp) 서열 번호
소
 Cyt -b
NC_006853.1
 Cattle-F CCATATATCACCATCGGACAACTA 387 1
Cattle-R GGTCTGTGTATGGGCGTGTT 2
돼지
 Cyt -b
NC_000845.1
 PIg- F TATTCGCTATCTACATGCAAACG 249 3
PIg-R ACGAGGTCTGTTCCGATATAAGG 4
닭 D-loop NC_001323.1 Chicken-F CCACATTTCTCCCAATGTCC 721 5
Chicken-R TATGTCCGACAAGCATTCAC 6
소 mt 18S
rRNA		 NC_006853 18S-F GACCTCGATGTTGGATCAGG 152 7
돼지 NC_000845 18S-R CTCCTAGTACGAAAGGA 8
닭 NC_001323
실시예 4: Real-time PCR 조건
본 발명의 일 실시예에 따라 소, 돼지 및 닭의 종 특이도(species specific)를 확인하기 위한 PCR은 종 특이 프라이머를 적용하였고 원료육 DNA 농도는 25 ng/㎕이며 PCR 반응액은 1ㅧ iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) 5 ㎕, 500 nM primer, 2 ㎕ DNA와 3차 증류수를 포함해 총 10 ㎕로 수행하였다.
한편, 육가공품 DNA는 10 ng/㎕로 희석하였고 PCR 반응조건은 95℃에서 3분간 가열하여 변성을 유도하고, 95℃ 10초, 61℃ 30초 및 72℃ 30초씩 28회 반복하였으며, 60-95℃에서 0.5℃씩 0.05초 차이로 용융곡선(melting curve)분석을 수행하였다. 증폭은 CFX 98 instrument(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 이용하였고 음성 대조군(negative control)은 각 프라이머 마다 수행하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 일반 PCR과 같이 다른 종과 교차반응 없이 특이적으로 증폭되었다. 각 축종의 주기정량(cycle quantification, Cq)값은 소 16.09, 돼지 15.41, 닭 16.24이었고, 프라이머 특이도를 확인하기 위한 융해 온도(melting temperature, TM)는 소 80.5℃, 돼지 81℃, 닭 85.5℃로 나타났다.
실시예 5: 가열육 검출한계
본 발명의 일 실시예에 따라 가열육에서의 검출한계를 관찰하기 위하여 상기 추출된 원료육 DNA를 5, 0.5, 0.05, 0.005 및 0.0005 ng/㎕으로 희석하여 각 축종별로 검출한계를 시험하였고 PCR 반응액과 조건은 상기와 동일하게 수행하였다.
그 결과, 소와 돼지는 0.1 ng/㎕까지 검출되었고 Cq값은 각각 25.3, 26.82이었다. 닭은 1 ng/㎕까지 검출되었고 Cq값은 24.78으로 확인되어 원료육보다는 소, 돼지는 10배, 닭은 100배 덜 민감한 것으로 확인되었다(표 2 참조). 이는 원료육보다 가열육에서 열처리로 인해 DNA 파괴가 이루어져 더 낮은 농도에서는 검출되지 못한 것으로 사료된다. 닭의 경우 다른 축종보다 검출한계가 높은데 그 이유로는 프라이머 크기가 700 bp가 넘어 증폭될 시에 다른 프라이머 보다 좀 더 많은 양의 SYBR Green Dye가 필요할 것으로 보이고 그만큼 Cq값이 높아질 수 있을 것으로 사료된다. 하지만 본 발명의 일 실시예에서 52개의 육가공품에서 증폭될 시에는 낮은 양의 닭 함유량까지 증폭이 되었으므로 효율성이 나쁘지 않은 것으로 사료된다.
사이클정량화
종 DNA 농도 10 1 0.1 0.01 aNTC
소 17.5 20.64 25.3 N/A bN/A
돼지 17.17 20.89 26.82 N/A N/A
닭 20.16 24.78 N/A N/A N/A
aNTC: No Template Control; bN/A: No Amplification.
실시예 6: 절대정량(absolute quantification)
본 발명의 일 실시예에 따라 절대정량 분석을 수행하기 위해서 각 축종의 표준곡선(standard curve)을 제작하였다. 소, 돼지 및 닭 DNA를 100, 50, 35, 25, 12.5, 5, 0.5, 0.05 ng/㎕으로 희석하였고 원료육의 genomic DNA를 이용하여 각 200, 100, 75, 50, 25, 10, 1, 0.1 ng/㎕까지 총 8개 농도로 기준을 정하였다. PCR 반응액과 조건은 상기와 동일하게 수행하였다.
그 결과, 각 축종별 표준곡선(standard curve)은 도 2와 같이 나타났고 각 축종 별로 10번 반복한 실험의 Cq값의 평균, 표준편차와 농도별 경사도(slope)를 고려하여 하나씩 추출한 검량선의 Cq값을 구하였고 이를 하기 표 3에 나타내었으며 기울기, PCR효율, 상관계수는 하기 표 4에 나타내었다. Genomic DNA의 경우 염색체의 형태를 띄고 있어 정제 또는 합성된 DNA보다 PCR 효율 허용치가 80-120%로 넓다. 이 중 10번 반복한 결과에 돼지의 경우는 R2값은 다른 프라이머와 비슷하게 잡혔지만 효율이 낮은 것은 농도 단계별로 Cq값이 높아지지 않고 50, 25 ng/㎕에서 비슷하게 나왔기 때문인 것으로 보인다. 또한 선택된 곡선에서 세 축종의 R2값은 한번만 반복한 것으로 조금 떨어진 것으로 보이며 3개 프라이머의 PCR 효율은 비슷하게 도출되었다.
주기 정량 평균
DNA 농도(ng/㎕) 200 100 75 50 25 10 1 0.1



타겟

A

 소 14.36
±4.37		 15.66
±0.76		 16.18
±0.14		 16.5
±0.38		 16.71
±0.3		 18.07
±0.43		 20.92
±0.23		 25.75
±0.96
돼지 12.98
±0.29		 14.64
±0.22		 16.27
±0.33		 15.46±0.35 15.33
±0.26		 19.26
±0.31		 24.08
±0.25		 27.80
±0.35
닭 14.53
±1.60		 17.64
±0.30		 17.85
±0.22		 18.81
±0.37		 20.84
±0.71		 21.81
±1.51		 23.48
±0.72		 28.72
±0.86

B		 소 12.84 14.15 14.09 15.24 15.32 16.25 19.55 24.10
돼지 13.23 15.89 16.18 16.52 16.43 17.24 24.79 27.10
닭 15.45 17.59 18.11 18.65 20.84 21.77 24.53 26.57
A, 10번 복제 표준곡선; B, 선택 표준곡선
종 경사도 효율(E) R2
A

 Cattle -3.007 115% 0.980
Pig -4.445 67.9% 0.985
Chicken -3.466 94.3% 0.981
B

 Cattle -3.231 104% 0.979
Pig -3.208 105% 0.968
Chicken -3.238 108% 0.935
C

 Cattle -3.378 97.7% 0.991
Pig -3.703 86.2% 0.952
Chicken -3.055 112.5% 0.984
A, 10번 복제 표준곡선(타겟 프라이머); B, 선택 표준곡선(타겟 프라이머), (C), 18S rRNA 프라이머.
상기 생성된 각 표준곡선에 샘플의 Cq값을 대입해서 나온 개시 정량(starting quantification, SQ)값으로 DNA의 양을 유추할 수 있었다. 육가공품 분석결과는 소, 돼지는 표기된 제품에서 모두 검출되었으며 닭의 경우 표기에 없지만 증폭된 것으로는 햄 2번, 5번, 소시지 2번, 6번 및 16번, 떡갈비 1번, 4번 총 7개 제품으로 13.46%를 차지하였고 표기에 있지만 검출되지 않은 것은 캔 7번이 존재하였다(표 5 참조). 닭에서 추가검출이 된 7가지 제품은 유형별로는 햄에서 2개, 소시지에서 3개, 떡갈비에서 2개였고 제조사별로 구분했을 때는 총 12개의 제조사로 구분되었고 A사에서 1개, C사에서 2개, D사에서1개, G사에서 2개, K사에서 1개로 확인되었다(표 6 참조). 육가공품 유형 중 캔 햄은 전체적으로 Cq값이 높게 나타났으며 캔 햄 7번은 돼지와 닭이 기재돼 있었지만 돼지만 검출되었다. 그 이유로는 햄에서의 DNA가 잘 추출되지 않았거나 캔 가공제품의 특성상 보존을 오래하기 위해 살균을 목적으로 방사선조사를 할 가능성도 있다. 방사능 물질이 붕괴할 때 나오는 γ선의 이온화 에너지를 식품에 쐬면 식품의 주형 DNA 구조가 파괴되고 이와 동시에 포름알데히드, 벤젠 등 PCR 저해 물질들이 생성되어 식품 중에 남게 되는데 이러한 것이 영향을 미칠 수 있다고 사료된다.
샘플 성분(%)
 18S rRNA Cq Mean jCq kSQ
Mean		 ΔΔC(t) P
-value
Mean Stdev. Mean Stdev.
aH2




 eT

gB
hS 91.35 15.87 16.29 0.31 60 1.04 0.64 0.035*
iG 23.32 0.97 2.26 0.005 0.003 0.026*
fH

 B
S
G
H5




 T

B 　
S 91.74 15.21 16.16 0.57 111 2.53 2.75 0.649
G 24.03 0.18 1.44 0.01 0.01 0.004*
H

 B
S 0.542
G 0.018*
bS2




 T

B
S 85.79 16.15 14.54 0.58 119.6 2.29 0.58 0.035*
G 　 21.31 0.48 12.2 0.011 0.005 0.026*
H

 B 　
S 0.207
G 0.009*
S6




 T

B 　
S 84.95 16.33 16.1 0.28 24.04 0.9 0.3 0.649
G 　 23.3 1.23 2.88 0.001 0.0004 0.004*
H

 B
S 0.018*
G 0.009*
S16




 T

B 　
S 90 17.53 16.8 0.52 80.02 2.62 1 0.649
G 25.94 0.91 0.723 0.001 0.001 0.74 　0.018*
H

 B
S 0.084
G 0.051
cT1




 T

cB 33.43 21.56 0.37 0.406 0.029 0.0195 0.005*
dS 50.35 17.71 19.16 0.54 33.47 0.67 0.56 0.024*
eG 21.85 0.25 10.88 0.03 0.01 0.092*
H

 B 0.057
S 0.058
G 0.053
T4




 T

 B 　
S 76.24 16.58 18.73 1.81 33.41 0.48 0.37 0.237
G 21.79 0.12 10.69 0.02 0.002 0.002*
H

 B
S 0.089
G 0.001*
dC7




 T

 B
S 28.8 25.95 0.12 1.5 0.23 0.04 23.5 0.001*
G 58 　
H

 B
S 0.003*
G
aH: 프레스 햄; bS: 소시지; cT: Tteokgalbi; dC: 캔 햄; eT: 표적 프라이머; fH: 하우스 키핑 프라이머; gB: 소; hS: 돼지; iG: 닭; jCq: 주기 정량; kSQ: gSQ: 개시 수량; * : p<0.05 by t-tests.
번호 회사 샘플 수 잠재적 오표시 제품
1 A 7 1
2 B 8
3 C 3 2
4 D 12 1
5 E 5
6 F 1
7 G 10 2
8 H 2
9 I 1
10 J 1
11 K 1 1
12 L 1
　 합계 52 　7
실시예 7: 상대정량(relative quantification)
본 발명의 일 실시예에 따라 상대정량 분석은 특이적인 PCR 산물을 확인한 뒤에 원료육과 가공육에 각각 하우스키핑 프라이머와 표적 프라이머가 적용된 Ct값을 비교하는 ΔΔC(t) 방법(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 이용해 각 샘플(sample)을 정량하였다. 또한 항존 유전자(housekeeping gene)의 PCR 효율을 조사하기 위한 표준 곡선(standard curve)을 제작하기 위해 소, 돼지 및 닭 DNA를 10, 5, 0.5, 0.05 ng/㎕으로 희석하여 상기와 동일한 조건으로 PCR을 수행하였다.
상기 추출된 DNA를 이용하여 18S rRNA 프라이머로 표준곡선을 그린 결과, 표적 프라이머의 표준곡선 PCR 효율과 비슷하게 나타났다(표 4 참조). 또한 소, 돼지의 검출한계는 0.1 ng/㎕였고 닭의 검출한계는 1 ng/㎕으로 나타났다(도 2 및 표 7 참조)
주기 정량화
DNA 농도(ng/㎕) 20 10 1 0.1
18S rRNA

 소 15.90 17.47 20.10 24.01
돼지 17.86 21.44 23.60 27.61
닭 24.63 25.60 27.88 N/A
상기 결과에 따라 소(Bos taurus), 돼지(Sus scrofa) 및 닭(Gallus gallus)의 성분이 혼합된 육가공제품으로 부터 증폭산물을 실시간으로 모니터링 하는 것이 가능하고, 그 산물의 확인과 정량화가 가능하여 여러 축종을 신속하고 간편하게 검출할 수 있는 원료육 판별을 위한 실시간 검출용 키트로 사용가능하다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> A kit and method for detecting of raw meat using real-time PCR <130> PD16-5391 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cattle-F <400> 1 ccatatatca ccatcggaca acta 24 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cattle-R <400> 2 ggtctgtgta tgggcgtgtt 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIg- F <400> 3 tattcgctat ctacatgcaa acg 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIg-R <400> 4 acgaggtctg ttccgatata agg 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chicken-F <400> 5 ccacatttct cccaatgtcc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chicken-R <400> 6 tatgtccgac aagcattcac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18S-F <400> 7 gacctcgatg ttggatcagg 20 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18S-R <400> 8 ctcctagtac gaaagga 17

Claims (6)

  1. 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 소 특이적 검출용 프라이머 세트;
    서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 돼지 특이적 검출용 프라이머 세트;
    서열번호 5로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 닭 특이적 검출용 프라이머 세트 및
    서열번호 7로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 8로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머로 구성되는 범용 프라이머 세트를 포함하는 판별 대상 육가공 제품 내에 소, 돼지 및 닭 원료육의 포함여부 판정용 실시간 PCR 키트.
  2. 판별 대상 육가공 제품으로부터 게놈 DNA를 추출하는 추출단계;
    상기 추출된 게놈 DNA를 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 소 특이적 검출용 프라이머 세트, 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 돼지 특이적 검출용 프라이머 세트, 서열번호 5로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 닭 특이적 검출용 프라이머 세트, 및 서열번호 7로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 8로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머로 구성되는 범용 프라이머 세트를 사용하여 육가공제품 게놈 DNA를 실시간 증폭하는 DNA 증폭 단계; 및
    상기 실시간 증폭 과정을 모니터링하는 모니터링 단계를 포함하는, 실시간 PCR에 의한 육가공제품 내의 소, 돼지 또는 닭 원료육 포함 여부 판정방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 DNA 증폭 단계는 킬레이팅 형광물질의 존재하에 수행되는, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 킬레이팅 형광물질은 사이버그린(SyBr Green)인, 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
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