KR101794633B1 - 육가공제품의 원료육 판별 마커 - Google Patents

육가공제품의 원료육 판별 마커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 소 특이적 검출용 프라이머 세트; 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 돼지 특이적 검출용 프라이머 세트; 및 서열번호 5로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 닭 특이적 검출용 프라이머 세트를 포함하는, 육가공제품 내의 소, 돼지 또는 닭 원료육 포함 여부 판정용 조성물을 제공한다.

Description

육가공제품의 원료육 판별 마커{Markers for raw meat of processed meat products}
본 발명은 원료육 판별 마커에 관한 것으로서, 더 상세하게는 육가공제품의 원료육 판별 마커에 관한 것이다.
분쇄 및 혼합육 제품(mixed meat products)이란 원료육(raw meat)에 식품첨가물을 가하거나 그 원형을 알아볼 수 없도록 분쇄 또는 절단 등의 방법으로 변형시킨 것을 혼합하거나 또는 다른 식품이나 첨가물을 사용하여 가공한 제품을 말한다. 우리나라는 식품공전 상 육가공품을 크게 햄류, 베이컨류, 프레스 햄과 혼합프레스 햄 및 소시지류로 분류할 수 있다. 사용되는 원료육은 매우 다양하며, 돼지와 닭 등이 일반적으로 많이 사용되고 있으며 2가지 이상의 식육의 종류를 제품에 사용할 때는 제품 표기란에 많이 사용한 원료부터 기재하여야 한다. 하지만 최근 원료육을 분쇄 또는 혼합하여 만든 제품인 혼합육제품에 이용되는 원료육 부정유통 및 둔갑 판매 등 식품원료를 의도적으로 혼입한 사례가 꾸준히 적발되어 오고 있다. 이러한 부정사례로는 제품의 수율향상, 원가절감 등을 목적으로 쇠고기에 값싼 가금류의 고기가 혼입되는 경우가 22%로 보고되었으며 돼지고기를 샤브용 양고기로 판매하거나, 일반 닭을 토종닭으로 판매하고, 소고기 분쇄육에 돼지고기를 혼합하여 사용한 예가 있다. 이러한 사례의 증가는 소비자를 기만하고 있다는 인식과 함께 대체된 원료의 성분을 확인하기 어려운 문제점으로 인해 혼합육제품에 대한 불신을 야기할 수 있다. 따라서 분쇄 및 혼합육제품에 사용되는 여러 종류의 원료육의 성분을 신속하고 간편하게 식별할 수 있는 종식별을 위한 마커의 개발이 시급하다. 이와 관련하여 대한민국 공개특허 제2016-0058301호는 식품 내 원료육 검출 또는 정량용 프라이머 세트 및 이를 이용한 원료육 검출 또는 정량 방법에 대해 개시하고 있다.
그러나 상기선행기술의 경우, 여러 시료를 분석할 경우 과정이 복잡하여 신속하게 분석할 수 없는 문제점이 존재한다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 혼합된 시료로부터 여러 축종을 신속하고 간편하게 검출할 수 있는 육가공제품의 원료육 판별 마커를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 소 특이적 검출용 프라이머 세트; 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 돼지 특이적 검출용 프라이머 세트; 및 서열번호 5로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 닭 특이적 검출용 프라이머 세트를 포함하는, 육가공제품 내의 소, 돼지 또는 닭 원료육 포함 여부 판정용 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 조성물 및 PCR 반응 혼합물을 포함하는, 육가공제품 내의 소, 돼지 또는 닭 원료육 포함여부 판정용 키트가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 조성물 또는 상기 키트로 판별 대상 육가공 제품으로부터 분리된 게놈 DNA를 증폭하는 DNA 증폭 단계; 상기 증폭된 DNA 단편을 전기영동하는 전기영동 단계; 및 상기 전기영동된 DNA 단편의 밴드 패턴을 분석하는 단계를 포함하는, 상기 육가공 제품 내에서의 소, 돼지 및 닭의 포함여부 판정방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 육가공품에 주로 이용되는 축종의 원료육 성분을 신속하고 간편하게 검출할 수 있어 대체된 원료성분을 쉽게 확인가능하고 육가공제품의 허위기재를 방지하는 효과가 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 프라이머를 이용하여 축종별 특이적 PCR 산물이 증폭되었음을 확인한 겔사진이다. M1, mixed DNA; B, cattle; S, pig; G, chicken. N; Negative control; Using primer set. M; 100 bp ladder (bioneer, Korea).
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 소, 돼지, 닭 원료육을 가열하고 DNA 추출 후 single PCR을 수행한 결과를 나타낸 겔사진이다. (a) Cattle primer; (b) Pig primer; (c) Chicken primer; (d) Each primer; (e) Primer mixture; M1, Mixed DNA; B, Cattle; S, Pig; G, Chicken. N; Negative control; Using primer set. M; 100 bp ladder (bioneer, Korea).
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 원료육 DNA를 이용하여 각 축종별로 검출한계를 관찰한 겔사진이다. (a), Raw meat DNA with lane 1, 100 ng/㎕; 2, 10 ng/㎕; 3, 1 ng/㎕; 4, 0.1 ng/㎕; 5, 0.01 ng/㎕; 6, 0.001 ng/㎕. (b), Heated meat DNA with lane 1, 10 ng/㎕; 2, 1 ng/㎕; 3, 0.1 ng/㎕; 4, 0.01 ng/㎕; 5, 0.001 ng/㎕; M; 100 bp ladder (bioneer, Korea).
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 가열육 DNA를 이용하여 각 축종별로 검출한계를 관찰한 겔사진이다. (a), Raw meat DNA with lane 1, 100 ng/㎕; 2, 10 ng/㎕; 3, 1 ng/㎕; 4, 0.1 ng/㎕; 5, 0.01 ng/㎕; 6, 0.001 ng/㎕. (b), Heated meat DNA with lane 1, 10 ng/㎕; 2, 1 ng/㎕; 3, 0.1 ng/㎕; 4, 0.01 ng/㎕; 5, 0.001 ng/㎕; M; 100 bp ladder (bioneer, Korea).
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 원료육과 가열육 DNA를 축종별로 각각 동량비율로 혼합한 뒤 검출한계를 관찰한 겔사진이다. (a), Raw meat DNA. (b), Heated meat DNA. with lane 1, 10 ng/㎕; 2, 1 ng/㎕; 3, 0.1 ng/㎕; 4, 0.01 ng/㎕; 5, 0.001 ng/㎕; M; 100 bp ladder (bioneer, Korea).
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 종 특이 프라이머 세트를 이용해 각 축종을 동시에 검출 가능한 multiplex PCR을 수행한 결과를 관찰한 겔사진이다. (a) Pressed ham 1~8; (b), Tteokgalbi 1~7; (c) Patties 1~7; (d) Canned ham 1~7; (e) sausage 1~23; N, Negative control. Using primer set. M, 100 bp ladder (bioneer, Korea).
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 육가공제품을 대상으로 single PCR 한 결과를 나타낸 겔사진이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 "미토콘드리아(mitochondria)"는 세포 내 세포소기관의 하나로 자기복제가 가능한 mtDNA를 포함하고 있다. 개별 미토콘드리아는 3-4 개의 mtDNA 사본들을 내포하고 있으나, 세포의 위치와 분화정도에 따라 1 개의 세포 내에 존재하는 미토콘드리아의 수는 수십에서 수백에 이르며, 난자의 경우는 1만 개 이상의 미토콘드리아를 보유하고 있다.
본 문서에서 사용되는 "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산서열로 상보적인 핵산의 주형 (template)과 염기쌍 (base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을위한 시약(즉, DNA 폴리머라아제)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보올리고뉴클레오티드 또는 리보올리고뉴클레오티드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
본 문서에서 사용되는 "프라이머 세트(primer set)"는 특정 서열 DNA를 증폭하기 위한 프라이머의 조합을 의미하고 하나의 프라이머 세트에는 통상 2가지 프라이머가 포함되나 이를 초과하는 경우도 있다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 소 특이적 검출용 프라이머 세트; 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 돼지 특이적 검출용 프라이머 세트; 및 서열번호 5로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 닭 특이적 검출용 프라이머 세트를 포함하는, 육가공제품 내의 소, 돼지 또는 닭 원료육 포함 여부 판정용 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 조성물 및 PCR 반응 혼합물을 포함하는, 육가공제품 내의 소, 돼지 또는 닭 원료육 포함여부 판정용 키트가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 조성물 또는 상기 키트로 판별 대상 육가공 제품으로부터 분리된 게놈 DNA를 증폭하는 DNA 증폭 단계; 상기 증폭된 DNA 단편을 전기영동하는 전기영동 단계; 및 상기 전기영동된 DNA 단편의 밴드 패턴을 분석하는 단계를 포함하는, 상기 육가공 제품 내에서의 소, 돼지 및 닭의 포함여부 판정방법이 제공된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 샘플준비
본 발명의 일 실시예에 따라 종 식별을 위한 식육원료는 소(Bos taurus), 돼지(Sus scrofa) 및 닭(Gallus gallus)이며 시중에서 판매되는 소고기 12개, 돼지고기 5개, 닭고기 7개 제품을 각각 구입하였다. 게놈(genomic) DNA 추출은 sucrose-proteinase K 방법(Birren et al., a laboratory manual, vol1, 1997)을 일부 수정하여 하기와 같이 추출하였다. 우선 각 원료육(raw meat)의 근육조직을 잘게 조각내어 SPK 버퍼(27% sucrose, 1 X SSC, 1 mM EDTA, 1% SDS) 5 ㎖, Proteinase K(25 ㎎/㎖), RNase (10 ㎎/㎖)를 첨가하여 인버팅(inverting) 시켜준 후 55℃로 맞춰진 항온수조(water bath)에 넣고 하룻밤 동안(overnight) 방치하였다. 그 후, 3 M NaCl 0.1 볼륨을 첨가한 뒤 인버팅 후 3,000 rpm에서 15 분 원심분리를 수행하여 상층액을 새 튜브로 옮기고 1 볼륨의 페놀(phenol) 첨가한 뒤 다시 인버팅 시켜 주고 3,000 rpm에 10분동안 원심분리를 수행하였다. 이어서 상층액을 새 튜브로 옮기고 1 볼륨의 100% 에탄올(EtOH) 첨가하고 인버팅 한 후 3,000 rpm에서 15 분간 원심분리하였으며 DNA 펠렛(pellet)을 새 튜브로 옮겨 70% 에탄올 1 ㎖ 첨가한 후 인버팅 한 뒤, 13,000 rpm에 1 분 원심분리하여 열풍건조기(dry oven)에서 건조 후 멸균된 3차 증류수 500 ㎕를 넣고 녹여주었다. 상기 추출된 DNA는 NanoDrop ND-1000 분광광도계(Thermo, USA)로 흡광도를 측정하였고 50 ng/㎕로 희석하여 PCR 증폭을 위한 주형(template)으로 이용하였다.
육가공품은 12개 브랜드의 햄류(8개), 소시지류(23개), 떡갈비류(7개), 패티류(7개), 캔류(7개) 등 5개 형태의 52개 제품을 사용하였다(표 1 참조). 상기 육가공품에서 DNeasy Blood & Tissue kit(Qiagen, germany)를 이용하여 제조사에서 제공하는 방법에 따라 DNA를 추출하였고 상기 추출된 DNA는 NanoDrop ND-1000 분광광도계(Thermo, USA)로 흡광도를 측정하고 10-50 ng/㎕사이의 DNA를 PCR증폭을 위한 주형으로 이용하였다.

샘플		 구성성분 (%)
샘플		 구성성분 (%)
소 돼지 닭 소 돼지 닭
aH1 　 91.73 　 S20 　 90.68 　
H2 　 91.35 　 S21 　 90.13 　
H3 　 89.28 　 S22 　 94.67 　
H4 　 90 　 S23 　 93.36 　
H5 　 91.74 　 cP1 - -
H6 　 90.02 　 P2 - - 　
H7 　 53.59 25.82 P3 　 - 　
H8 　 91.59 　 P4 　 　 -
bS1 　 93.1 　 P5 　 - 　
S2 　 85.79 　 P6 　 - 　
S3 　 50.72 30.6 P7 　 45.62 29.2
S4 　 93.07 　 dT1 33.43 45.59 4.76
S5 　 *- 　 T2 9.93 53.66 　
S6 　 84.95 　 T3 10.28 51.42 　
S7 　 90 　 T4 　 76.24 　
S8 　 - 　 T5 　 75.91 　
S9 　 91.73 　 T6 　 61.91 4.12
S10 　 91.13 　 T7 　 59.43 -
S11 　 94.66 　 eC1 　 95.08 　
S12 　 86.08 　 C2 　 91.11 　
S13 　 90.03 　 C3 　 95.76 　
S14 　 86.35 　 C4 　 95.7 　
S15 　 - 　 C5 　 87.48 　
S16 　 90 　 C6 　 95.2 　
S17 　 91.52 　 C7 28.8 58
S18 　 90.64 　
S19 　 92.09 　
aH: Pressed Ham; bS: Sausage; cP: Patties; dT: Tteokgalbi; eC: Caned ham. *- : 제품의 포장에 고기성분 비율이 표시되어 있지 않음
실시예 2: 가열육 제조 및 DNA추출
본 발명의 일 실시예에 따라 원료육에서 열처리 하였을 때의 종 특이성을 평가하기 위하여 인위적으로 소, 돼지, 닭 원료육 5 g을 식육가공품의 가공조건을 고려하여 70℃에서 30분간 열처리하였고 DNeasy Blood & Tissue kit(Qiagen, germany)를 이용하여 제조사에서 제공하는 방법에 따라 DNA를 추출하였다. 이 후 상기 추출된 DNA는 NanoDrop ND-1000 분광광도계(Thermo, USA)로 흡광도를 측정하고 35 ng/㎕ DNA를 PCR 증폭을 위한 주형으로 이용하였다.
실시예 3: 프라이머 디자인
본 발명의 일 실시예에 따라 종 특이 프라이머(primer)는 clustal W(version 2.1)을 사용하여 NCBI GenBank database에서 제공된 각 축종의 mtDNA(D-loop, Cytochrome b)의 염기서열을 정렬한 뒤 primer3 프로그램(http://sourceforge.net/projects/primer3/)을 이용하였고 PCR 어닐링(annealing) 온도 차이를 최소화 시키면서 각각 다른 크기로 증폭되도록 하였으며 소, 돼지는 Cyt-b, 닭은 D-loop에서 설계하였다(표 2 참조).
타겟 종 유전자 접근 번호 프라이머 염기서열 (5'→3') 증폭 크기(bp) 서열번호
소
 Cyt -b
NC_006853.1 Cattle-F CCATATATCACCATCGGACAACTA 387
 1
Cattle-R GGTCTGTGTATGGGCGTGTT 2
돼지
Cyt -b
NC_000845.1
 PIg- F TATTCGCTATCTACATGCAAACG 249
 3
PIg -R ACGAGGTCTGTTCCGATATAAGG 4
닭 D-loop
NC_001323.1
 Chicken-F CCACATTTCTCCCAATGTCC 721
 5
Chicken-R TATGTCCGACAAGCATTCAC 6
실시예 4: 종 특이 PCR
본 발명의 일 실시예에 따라 수행한 종 특이(species specific) PCR은 상기 각 원료육으로부터 추출된 DNA와 가열육에서 추출된 DNA를 이용하여 축종 별 제작된 프라이머의 특이성을 평가하기 위해 수행되었다. 구체적으로, PCR 반응액은 주형 DNA 50 ng, 10 x reaction buffer, 12 mM dNTP mixture, 0.5 unit prime Taq DNA polymerase(Genet bio, Korea), 10 pmol primer를 포함해 총 25 ㎕로 수행되었다. PCR 반응 조건은 95℃에서 5분간 가열하여 변성을 유도하고, 94℃ 1분, 66℃ 1분, 및 72℃ 1분씩 30회 반복하였으며, 최종적으로 72℃에서 5분간 신장(extension)시켰다. 증폭은 my genie thermal block(Bioneer, Korea)으로 수행하였다.
상기 3개 축종별 프라이머의 특이성을 확인하기 위하여 원료육에서 추출된 DNA를 PCR 수행한 결과 소 384 bp, 돼지 249 bp 및 닭 721 bp의 특이적 PCR 산물이 증폭되었으며 각 프라이머에 대한 교차반응 여부를 확인하기 위해 프라이머 세트와 다른 원료육 DNA로 PCR을 실시한 결과, 비 특이 증폭 산물은 나타나지 않았다(도 1). 또한, 소, 돼지, 닭 원료육을 육가공품의 가공조건을 참고하여 70℃에서 30분 동안 가열하고 DNA 추출 후 single PCR을 수행한 결과, 원료육의 특이도와 일치하였다. 아울러, 각 DNA를 동량 비율로 섞은 혼합물에 각 primer를 적용시켜 종 특이 PCR을 수행한 결과 마찬가지로 특이적으로 증폭된 것을 확인하였으며 프라이머 세트를 이용한 multiplex PCR 결과도 일치하였다(도 2).
실시예 5: 원료육 및 가열육 검출한계
본 발명의 일 실시예에 따라 상기 추출된 원료육 DNA를 100, 10, 1, 0.1, 0.01 및 0.001 ng/㎕으로 희석하였고 각 축종별로 검출한계(detection limit)를 시험하기 위하여 반응액과 조건은 종 특이 PCR과 multiplex PCR 조건 두 가지로 실시하였다. 또한, 상기 추출된 가열육 DNA를 10, 1, 0.1, 0.01 및 0.001 ng/㎕으로 희석하여 각 축종별로 검출한계를 시험하기위하여 마찬가지로 종 특이 PCR과 multiplex PCR 조건 두 가지를 수행하였다.
상기 추출된 원료육과 가열육 DNA를 이용하여 각 축종별로 검출한계를 시험한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 종 특이 PCR조건에서 모두 0.01 ng/㎕까지 검출되었다. 성분표에 표기된 육함량 중 소는 9.93%, 돼지는 28.8%, 닭은 4.12%이 최저함량이었으며 모두 증폭되었다. 또한 multiplex PCR 조건에서는 소는 0.01 ng/㎕까지 검출되었고 돼지와 닭은 0.1 ng/㎕까지 검출되어 종 특이 조건보다 multiplex PCR 조건에서 더 검출한계가 높으며 소 primer의 검출한계가 가장 낮다는 것을 확인할 수 있었다. 가열육도 마찬가지로 종 특이 PCR조건과 multiplex PCR조건에서 모두 소는 0.01 ng/㎕까지 검출되었고 돼지와 닭은 0.1 ng/㎕까지 검출되었다(도 4). 상기 결과로 가열육이 원료육보다 높은 검출한계를 나타낸 것을 확인하였으며 그 이유로는 DNA에 기장 큰 영향을 미치는게 가열이기 때문으로 사료된다. 따라서, 본 발명의 실시예에서는 원료육에서 추출한 DNA로 검출한계를 조사하였을 때 소, 돼지, 닭 모두 0.01 ng/㎕까지 검출가능 하였으며 이는 mtDNA의 높은 copy수로 인해 낮은 검출한계를 가진 특성으로 설명된다.
실시예 6: Multiplex PCR 검출한계
본 발명의 일 실시예에 따라 상기 각 추출된 원료육과 가열육 DNA를 축종별로 각각 동량비율로 혼합한 뒤 프라이머 세트를 이용해 검출한계를 시험하였다. 상기 혼합된 DNA는 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 ng/㎕으로 희석하였고 반응액과 조건은 multiplex PCR 조건으로 수행하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 원료육에서 소는 0.01 ng/㎕까지, 돼지와 닭은 0.1 ng/㎕까지 확인되었으며 가열육에서는 소 0.01 ng/㎕, 돼지 1 ng/㎕, 닭 0.1 ng/㎕까지 검출된 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7: Multiplex PCR
본 발명의 일 실시예에 따라 상기 종 특이 프라이머 세트를 이용해 각 축종을 동시에 검출 가능한 multiplex PCR을 수행하였다. 주형 DNA는 50 ng/㎕로 희석한 3가지(소, 돼지, 닭) 원료육 DNA를 동량 비율로 섞어 사용하였다. PCR 반응액은 주형 DNA 50 ng, 10 x reaction Buffer, 12 mM dNTP mixture, 1 unit Taq DNA polymerase(Genet bio, Korea), 10 pmol 프라이머 세트를 포함해 총 25 ㎕로 수행되었다. PCR 반응조건은 95℃에서 5분간 가열하여 변성을 유도하고, 94℃ 1분, 66℃ 1분, 및 72℃ 1분씩 30회 반복하였으며, 최종적으로 72℃에서 5분간 신장시켰다. 증폭은 my genie thermal block(Bioneer, Korea)으로 수행되었다.
상기 구축된 프라이머의 육가공품 적용 여부 가능성을 알아보기 위해 육가공품에서 추출한 DNA와 프라이머 세트를 이용하여 multiplex PCR을 실시하였다. PCR 반응액은 주형 DNA 10-50 ng, 10 x reaction Buffer, 12 mM dNTP mixture, 1 unit Taq DNA polymerase(Genet bio, Korea), 10 pmol 프라이머 세트를 포함해 총 25 ㎕로 수행되었다. PCR 반응조건은 상기와 동일하게 실시하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 떡갈비 1번, 4번은 소 또는 돼지를 포함하고 있다고 표기되어 있었으나 닭에도 특이적인 밴드가 함께 나타났고 캔 햄 7번은 돼지와 닭이 표기되어 있었으나 multiplex PCR 결과 돼지만 검출되었다(표 3 참조). 떡갈비 1번 같은 경우는 제품을 2번 구입하였는데 첫 번째는 소 33.4%, 돼지 50.35%였으나 두 번째는 소 33.4%, 돼지 45.45%, 닭 4.76%로 돼지의 함량이 줄고 닭이 추가된 것을 확인할 수 있었다. Multiplex PCR과 single PCR 결과는 전후가 같았으므로 닭고기가 원래 함유되어 있었지만 나중에 표기를 바꾼 가능성이 있는 것으로 사료되고 떡갈비 1번은 소가 33.43% 포함되었다고 표기되어 있었으나 소가 9.93% 포함된 떡갈비 2번보다 밴드가 흐릿하게 나타난 것으로 보아 다른 저해물질이 존재하거나 실제 포함된 소고기의 함량이 표기된 함량보다 작은 것으로 유추할 수 있다.
번호 라벨 결과 번호 라벨 결과
aH1 gP P S20 P P
H2 P P S21 P P
H3 P P S22 P P
H4 P P S23 P P
H5 P P cP1 fC, P C, P
H6 P P P2 C, P C, P
H7 P, hK P, K P3 P P
H8 P P P4 K K
bS1 P P P5 P P
S2 P P P6 P P
S3 P, K P, K P7 P, K P, K
S4 P P dT1 C, P C, P, K
S5 P P T2 C, P C, P
S6 P P T3 C, P C, P
S7 P P T4 P P, K
S8 P P T5 P P
S9 P P T6 P, K P, K
S10 P P T7 P, K P, K
S11 P P eC1 P P
S12 P P C2 P P
S13 P P C3 P P
S14 P P C4 P P
S15 P P C5 P P
S16 P P C6 P P
S17 P P C7 P, K P
S18 P P
S19 P P
a: 프레스햄; b: 소세지; c: 패티; d: 떡갈비; e: 캔햄 f: 소; g: 돼지; h: 닭.
또한, 상기 3가지 제품을 single PCR 한 결과 multiplex PCR 결과와 동일하게 검출되었다(도 7). 특히 떡갈비 1번 같은 경우는 구입 시기에 따라 닭고기가 추가된 것을 확인할 수 있었다(표 4 참조).
구입 육가공제품의 표기(%)
소 돼지 닭
4월 33.43 50.35
8월 33.43 45.59 4.75
상기결과에 따라 육가공제품 제조 시 주로 이용되는 소(Bos taurus), 돼지(Sus scrofa) 및 닭(Gallus gallus)의 성분을 동시에 식별하기 위한 multiplex PCR법을 구축하고 PCR 조건을 최적화하여 원료육 정량분석 방법을 확립함으로써 혼합율 또는 분쇄육제품으로 부터 여러 축종을 신속하고 간편하게 검출할 수 있는 원료육 판별 마커로 사용가능하다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Markers for raw meat of processed meat products <130> PD16-5390 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cattle-F <400> 1 ccatatatca ccatcggaca acta 24 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cattle-R <400> 2 ggtctgtgta tgggcgtgtt 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIg- F <400> 3 tattcgctat ctacatgcaa acg 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIg-R <400> 4 acgaggtctg ttccgatata agg 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chicken-F <400> 5 ccacatttct cccaatgtcc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chicken-R <400> 6 tatgtccgac aagcattcac 20

Claims (3)

  1. 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 소 특이적 검출용 프라이머 세트;
    서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 돼지 특이적 검출용 프라이머 세트; 및
    서열번호 5로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 닭 특이적 검출용 프라이머 세트를 포함하는, 육가공제품 내의 소, 돼지 또는 닭 원료육 포함 여부 판정용 조성물.
  2. 제1항의 조성물 및 PCR 반응 혼합물을 포함하는, 육가공제품 내의 소, 돼지 또는 닭 원료육 포함여부 판정용 키트.
  3. 제1항의 조성물 또는 제2항의 키트로 판별 대상 육가공 제품으로부터 분리된 게놈 DNA를 증폭하는 DNA 증폭 단계;
    상기 증폭된 DNA 단편을 전기영동하는 전기영동 단계; 및
    상기 전기영동된 DNA 단편의 밴드 패턴을 분석하는 단계를 포함하는, 상기 육가공 제품 내에서의 소, 돼지 및 닭의 포함여부 판정방법.
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