KR101318311B1 - 식품 중의 돼지고기 함량을 확인하는 방법 - Google Patents

식품 중의 돼지고기 함량을 확인하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는, 회교도식 도축 승인을 위한 돼지-특이적인 실시간 PCR 분석을 개발한다. 돼지, 소 및 닭의 3가지 육류 샘플을 이용한다. 이들 3가지 타입의 가축 육류는 말레이시아에서 일반적으로 소비되는 육류로, 시장에서 쉽게 구입가능하다. 각각의 무가공 육류 샘플로부터 DNA를 DNeasy® 혈액 및 조직 키트(Qiagen, Hilden, Germany)로 성공적으로 추출하였다. 추출한 DNA는, 실시간 PCR 반응 전에, 바이오포토미터(Eppendorf AG, Hamburg, Germany)를 이용하여 UV 흡광 스펙트로포토메트리로 그 농도를 추정한다. 프라이머의 어닐링 온도는 58 ℃이다. 설계한 프라이머의 특이성을 검증하기 위해, 다른 2종의 육류 샘플을 대상으로 프라이머를 테스트하기 위한 반응을 수행하여, 교차 반응 가능성을 확인한다. 이 반응에서 Ct + 22.83으로 돼지 DNA만 증폭되었다. 본원에 기술된 실시간 PCR 분석은 샘플을 테스트하였을 때 감도가 우수하며 검출 한계가 낮은 것으로 입증되었다. 본 분석은 100 ng의 DNA를 10배로 연속 희석하여 사용함으로써 반응의 감도를 확인하였다. 돼지 DNA에 대한 감도는 0.001 ng까지 였다. 기존 PCR에서의 돼지 DNA에 대한 검출 한계는 0.1 ng인 것으로 보고되어 있다. 이런 점에서, 본 발명의 방법은 식품 제품 중의 돼지 DNA를 검출하는데 유용할 것이다.

Description

식품 중의 돼지고기 함량을 확인하는 방법{A METHOD FOR IDENTIFYING A PORK CONTENT IN A FOOD}
본 발명은 특히 육류 가공 식품에서 식품 성분을 확인하기 위한 프라이머의 설계 방법에 관한 것이다. 특히, 이 방법은 회교도식 도축 승인(Halal authentication)을 위해 가공 식품내 돼지고기(Sus scrofa)의 존재를 확인하는 방법이다.
식품에 불순물 혼입(adulteration)은 전세계적으로 공통적으로 문제가 되고 있다. 예를 들어, 값싼 고기가 비싼 고기로 둔갑되고 있다. 가장 빈번하게는, 돼지 고기가 식품 제품에서 다른 고기 타입을 대체하는 용도로 사용되고 있다. 따라서, 식품 제품에서의 동물 종, 특히 돼지 고기의 확인은 소비자에게 중요한 이슈가 되고 있다. 식품의 허위 기재는 잠재적으로 비-회교도식 식품의 존재에 있어서 훨씬 더 중요할 수 있다. 이런 이유로, 날고기와 육류 제품의 원래 종을 확인하기 위한 몇가지 방법들이 개발되었다. 식품 제품에 있어서 불순물 혼입을 감시하기 위해, DNA 분석을 기반으로 한 다수의 방법들이 식품 산업에서 사용되고 있다. 동물 종을 확인하는 방법은 대부분 지질, 단백질 및 DNA를 기초로 한다. 그러나, DNA는 고온, 압력 및 식품 가공에서 사용되는 화학적 처리와 관련있는 조건 하에서 훨씬 안정적이기 때문에, DNA를 기초로한 방법이 특히 더 신뢰성이 있다.
육류 제품에서 동물 조직의 종을 확인하는 것은 예컨대 경제적, 종교적 및 건강상의 이유로, 법적으로 또는 바람직하지 않은 불순물 혼입으로부터 소비자를 보호하는 중요한 문제이다. 이를 위해, 단백질 및 DNA 분석을 기초로한 다양한 분석 방법들이 개발되었다. 종 확인을 위해 고도로 개발된 DNA 기반의 방법들 중에는 종-특이적인 통상적인 PCR 및 실시간 PCR이 있다. 돼지고기 특이적인 PCR용으로 개발된 타겟화된 유전자 단편들 중에는 12S rRNA, ND5, 미토콘드리아 치환 루프(D-Loop) 및 핵 멜라노코르틴 수용체 1(MCIR)로부터 유래된 단편들이 있다.
기존 PCR을 이용한 방법들은 성공적인 것으로 입증되기는 했지만, 분석 시간이 오래 걸리는 포스트-PCR 조작과 실험실 오염을 초래할 수 있는 유해 화합물의 취급을 수반한다. 반면, 실시간 PCR 방법은 기존의 PCR을 대체할 수 있는 우수한 잠재력을 가지고 있다. 그 이유는 주로 실시간 PCR 방법이 신속하고, 민감하며, 특이적이고, 자동화율이 높고, 타겟의 정량화가 가능하기 때문이다(Heid et al, 1996).
발명의 개요
본 발명은 식품에서 돼지고기의 함유량을 확인하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 샘플 돼지고기로부터 데옥시리보뉴클레익산(DNA)을 추출하는 단계, 돼지 고기의 ND5 미토콘드리아 유전자를 기초로 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 설계하는 단계, 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 중합효소 연쇄 반응(PCR) 테스트를 수행하는 단계를 포함하며, 상기 정방향 프라이머의 서열은 SUS-FWD:5'-AGC TGC ACT ACA AGC AAT CC-3')이고, 역방향 프라이머의 서열은 SUS-RVS:5'-ATG CGT TTG AGT GGG TTA GG-3'인 것을 특징으로 한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 회교도식 도축 승인을 위한 돼지고기-특이적인 실시간 PCR 분석을 개발하고 활용하는 것에 관한 것이다. 돼지의 ND5 미토콘드리아(ND5) 유전자의 89 bp 앰플리콘을 증폭하도록 프라이머를 설계하였으며, 이 프라이머는 상업적으로 이용되는 닭과 소 종에 대해서는 매칭되지 않는다. 본 분석 방법은 감도가 높고, DNA의 수중 희석물을 이용하여 분석하였을 때 돼지 주형 DNA가 0.001 ng 존재해도 검출한다. 회교도식 제품 검증용으로 개발된 프라이머 세트는 돼지의 ND5 미토콘드리아 유전자를 기반으로 하며, 프라이머의 서열은 다음과 같다:
정방향 프라이머 (SUS-FWD: 5'-AGC TGC ACT ACA AGC AAT CC-3')
역방향 프라이머 (SUS-RVS:5'-ATG CGT TTG AGT GGG TTA GG-3')
돼지 DNA를 검출하는 PCR은, 마스터사이클러 ep(Eppendorf AG, Hamburg, Germany)에서의 증폭에 의해 수행하였다. 각 반응 시험관에는, 2x Quantitect SYBR 그린 PCR 마스터 믹스(Qiagen, Hilden, Germany) 10 ㎕, 정방향 프라이머 1 ㎕, 역방향 프라이머 1 ㎕, dH20 3 ㎕ 및 DNA 샘플(20 ng/㎕) 5 ㎕로 이루어진 반응 혼합물 20 ㎕를 넣는다. 3-단계의 증폭 사이클 프로그램은 다음과 같다: 95 ℃에서 15분간의 최초 활성화, 94 ℃에서 15초간 변성, 58 ℃에서의 30초간 어닐링 및 72 ℃에서 30초간 연장. 최초 활성화 단계는 반응 혼합물에 존재하는 HotStarTaq DNA 중합효소를 활성화시키기 위한 단계이다. 사이클은 40회 반복하며, 용융 곡선 분석을 수행하여 증폭된 DNA의 특이성과 동일성을 검증하였다.
도 1은 다른 육류 종들(소 및 닭)과 비교하여, 설계한 돼지고기 프라이머의 특이성 테스트 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 10배 연속 희석시 돼지고기 프라이머의 특이성 테스트 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 프라이머의 농도 최적화를 나타낸 것이다.
도 4는 프라이머 어닐링 온도의 최적화를 나타낸 것이다.
샘플
본 실험에서는 돼지, 소 및 닭, 3가지 종을 사용한다. 육류 샘플은 지역 재래 시장인 세랑고르 도매시장에서 구입한다. 이 샘플은 DNA 추출하기 전까지 -20 ℃에 보관한다.
DNA 추출
DNeasy® 혈액 및 조직 키트(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 육류 샘플로부터 DNA를 추출한다. 샘플 25 mg을 1.5 ml 마이크로원심분리관에서 측정하여 넣는다. 완충액 ATL 180 ㎕와 프로테나제 K 20 ㎕를 첨가한다. 이 혼합물을 볼텍 스로 혼합한 다음 세포 용해를 위해 56 ℃의 수조내에서 밤새 인큐베이션한다. 샘플이 완전히 용해되면, RNase A (100 mg/ml) 4 ㎕을 넣어, 혼합한 다음 실온에서 2분 인큐베이션한다. 혼합물을 볼텍스로 혼합한 다음 완충액 AL 200 ㎕를 넣고, 다시 볼텍스 혼합하여 잘 혼합한다. 그런 후, 에탄올(96-100%) 200 ㎕을 첨가하여 볼텍스 혼합하여, 균질적인 용액을 만든다. 이 혼합물을 피펫을 이용하여 DNeasy 미니 스핀 컬럼 세트로 이동시켜, 1분간 8000rpm으로 원심분리한다. 통과(flow-through) 분획과 채집 시험관은 버린다. 그런 후, DNeasy 미니 스핀 컬럼을 새로운 2 ml의 채집 시험관 위에 장착한다. 여기에 완충액 AW2 500 ㎕을 첨가하여, 3분간 14,000 rpm으로 원심분리하여 컬럼이 건조한 상태가 되게 하고 에탄올이 남지 않게 한다. 그 후, DNeasy 미니 스핀 컬럼을 새로운 1.5 ml의 마이크로원심분리 시험관에 장착하고, 완충액 AF 100 ㎕을 용출을 위해 첨가한다. 시험관을 실온에서 1분간 인큐베이션한 다음, 8,000 rpm으로 1분간 원심분리한다. 추출된 DNA가 포함된 상층액은 다음에 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관한다.
프라이머 설계
프라이머3 소프트웨어(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)를 실시간 PCR에 사용할 프라이머 세트 설계에 사용한다. NCBI GenBank 데이타베이스(hhtp://www.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 수득한, 돼지(NC_000845), 소(NC_006853) 및 닭(NC_001323)의 ND5 유전자 서열을 정렬시켜 비교하였다. 돼지의 ND5 유전자의 89 bp 단편을 특이적으로 증폭시키는. 한가지 프라이머 세트(SUS-FWD:5'-AGC TGC ACT ACA AGC AAT CC-3' 및 SUS-RVS:5'-ATG CGT TTG AGT GGG TTA GG-3')를 합성하였다.
실시간 PCR 분석
돼지의 DNA 검출은 마스터사이클러 ep(Eppendorf AG, Hamburg, Germany)에서의 증폭에 의해 행하였다. 각 반응 시험관에는, 2x Quantitect SYBR 그린 PCR 마스터 믹스(Qiagen, Hilden, Germany) 10 ㎕, 정방향 프라이머 1 ㎕, 역방향 프라이머 1 ㎕, dH20 3 ㎕ 및 DNA 샘플(20 ng/㎕) 5 ㎕로 이루어진 반응 혼합물 20 ㎕를 넣는다. 3-단계의 증폭 사이클 프로그램은 다음과 같다: 95 ℃에서 15분간의 최초 활성화, 94 ℃에서 15초간 변성, 58 ℃에서의 30초간 어닐링 및 72 ℃에서 30초간 연장. 최초 활성화 단계는 반응 혼합물에 존재하는 HotStarTaq DNA 중합효소를 활성화시키기 위한 단계이다. 사이클은 40회 반복하며, 용융 곡선 분석을 수행하여 증폭된 DNA의 특이성과 동일성을 검증하였다. 달리 언급된 경우를 제외하고는, 모든 반응들은 3세트로 수행한다.

Claims (6)

  1. 식품 중의 돼지고기 함량을 확인하는 방법으로서,
    (a) 샘플 돼지고기로부터 데옥시리보뉴클레익산(DNA)을 추출하는 단계;
    (b) 돼지의 ND5 미토콘드리아 유전자를 기초로 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 설계하는 단계; 및
    (c) 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용하여 추출된 DNA에 실시간 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭을 수행하는 단계를 포함하며,
    상기 정방향 프라이머의 서열은 SUS-FWD: 5'-AGC TGC ACT ACA AGC AAT CC-3'이고, 역방향 프라이머의 서열은 SUS-RVS: 5'-ATG CGT TTG AGT GGG TTA GG-3'인 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 농도는 0.3 내지 0.9 μM인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 실시간 중합효소 연쇄 반응의 반응 온도는 50 내지 70 ℃인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 식품에서 돼지고기 함유를 확인하는 방법으로서,
    (a) 돼지의 ND5 미토콘드리아 유전자를 기초로 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 설계하는 단계; 및
    (b) 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용하여 추출된 DNA에 실시간 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭을 수행하는 단계를 포함하며,
    상기 정방향 프라이머의 서열은 SUS-FWD: 5'-AGC TGC ACT ACA AGC AAT CC-3'이고, 역방향 프라이머의 서열은 SUS-RVS: 5'-ATG CGT TTG AGT GGG TTA GG-3'인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 농도는 0.3 내지 0.9 μM인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 실시간 중합효소 연쇄 반응의 반응 온도는 50 내지 70 ℃인 것을 특징으로 하는 방법.
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