CN108624659B - 一种检测肉类制品成分的实时定量pcr方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种检测肉类制品成分的实时定量PCR方法，包括以下步骤：提取肉类制品试样和标准样品的基因组DNA；根据线粒体NADH氧化还原酶1的多态性差异设计肉类制品试样和标准样品的基因组DNA所需的PCR扩增引物，并对应配制PCR反应体系进行PCR扩增，读取扩增过程中的Ct值；根据PCR扩增产物中的NADH氧化还原酶1的Ct值与18S rRNA的Ct值的比较，判断PCR扩增的可靠性；根据肉类制品试样与标准样品的基因组DNA扩增产物的NADH氧化还原酶1的Ct值的差值ΔCt比较，判断肉类制品试样中是否含有该待检测成分。本发明可同时检测肉类制品中具有不同物种来源的成分中的一种或多种，检测结果准确、可靠。
Description
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域，特别涉及一种检测肉类制品成分的实时 定量PCR方法。
背景技术
对于肉制品行业而言，掺假现象时有发生，主要是加入一些低价肉类(例 如竹鼠肉、鸭肉、鹅肉等)代替部分高价肉类(例如牛肉、羊肉等)而制成 成品销售。现有常用的肉制品鉴定方法有蛋白质鉴定(包括聚丙烯酰胺凝胶 电泳、酶联免疫吸附测定、液相色谱等)以及DNA鉴定(包括聚合酶链式反 应PCR、RFLP标记法等)，其中，DNA鉴定具有对待鉴定材料的种类和纯 度要求较低的优点。然而，现有DNA鉴定方法中还存在着鉴定结果不准确的 问题。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种检测肉类制品成分的实时定量PCR方法， 旨在提高肉类制品成分检测的准确性和可靠性。
为实现上述目的，本发明提出一种检测肉类制品成分的实时定量PCR方 法，包括以下步骤：
S10、分别提取肉类制品试样的第一基因组DNA、以及与肉类制品试样 的物种来源对应的标准样品的第二基因组DNA；
S20、针对所述肉类制品试样中的预设检测成分，设计所述第一基因组 DNA和第二基因组DNA中的线粒体NADH氧化还原酶1基因(ND1，NADH oxidoreductase 1)进行PCR扩增所需的特异性引物序列，针对所述第一基因 组DNA和第二基因组DNA中的基因18S rRNA，设计所述基因18S rRNA进 行PCR扩增所需的18S rRNA引物序列，将所述第一基因组DNA与所述特异 性引物、18S rRNA引物配制成第一PCR反应体系，将所述第二基因组DNA 与所述特异性引物、18S rRNA引物配制成第二PCR反应体系；
S30、对所述第一PCR反应体系和第二PCR反应体系分别进行实时定量 PCR扩增，对应获得第一PCR扩增产物和第二PCR扩增产物，分别读取所 述第一PCR扩增产物中的NADH氧化还原酶1的Ct值和18S rRNA的Ct值、 以及所述第二PCR扩增产物中的NADH氧化还原酶1的Ct值和18S rRNA 的Ct值；
S40、当所述第一PCR扩增产物与所述第二扩增产物的NADH氧化还原 酶1的Ct值的差值小于或等于2.0，并且所述第一扩增产物与所述第二扩增 产物的18S rRNA的Ct值的差值小于或等于1.0时，判定为对应获得PCR扩 增产物所进行的实时定量PCR扩增反应正常；
S50、在判定获得所述第一PCR扩增产物所进行的实时定量PCR扩增反 应、以及获得所述第二PCR扩增产物所进行的实时定量PCR扩增反应均正常 时，计算所述第一PCR扩增产物与所述第二PCR扩增产物的NADH氧化还 原酶1的Ct值的差值ΔCt，当ΔCt大于6.5时，判定呈阴性，即所述肉类制品 试样中不含有所述预设检测成分；当ΔCt小于6.5时，判定呈阳性，即所述肉 类制品试样中含有所述预设检测成分。
优选地，步骤S10包括：
步骤S11、取肉类制品试样、以及与肉类制品试样的物种来源对应的标准 样品，对应放入裂解液中并剪碎，再加入蛋白酶K，于55℃反应2～4h后离心， 得到第一上清液；
步骤S12、将所述第一上清液用饱和酚抽提后离心，得到第二上清液；
步骤S13、将所述第二上清液用氯仿抽提后离心，得到第三上清液；
步骤S14、向所述第三上清液中加入NaCl溶液或者NaAc溶液进行混合， 然后加入无水乙醇或异丙醇进行混合，以沉淀所述肉类制品试样和标准样品 中的基因组DNA，离心获得DNA沉淀；
步骤S15、将DNA沉淀用乙醇溶液清洗后吹干，再溶解于无菌水中，对 应得到从所述肉类制品试样中提取的第一基因组DNA和从所述标准样品中 提取的第二基因组DNA。
优选地，步骤S11中，所述裂解液包括以下组分：摩尔浓度为1M、pH 值为7.5的Tris-HCl溶液，摩尔浓度为0.5M、pH值为8.0的EDTA溶液，摩 尔浓度为1M的NaCl溶液，质量浓度为5％的SDS溶液，以及水；其中，所 述Tris-HCl溶液、EDTA溶液、NaCl溶液、SDS溶液与水的体积比为1：2： 1：4：92。
优选地，在步骤S14之后、步骤S15之前，还包括：
向DNA沉淀中加入核糖核酸酶H，于37℃温度下培育30min，获得去除 RNA后的DNA沉淀。
优选地，在步骤S20中：
所述肉类制品试样中的预设检测成分包括猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭 肉和兔肉中的至少一种；
所述特异性引物序列包括猪、牛、羊、鸡、鸭和兔的线粒体NADH氧化 还原酶1基因进行PCR扩增所需的特异性引物序列中的至少一种。
优选地，所述猪、牛、羊、鸡、鸭或兔的线粒体NADH氧化还原酶1基 因进行PCR扩增所需的特异性引物序列，以及所述18S rRNA引物序列，对 应如下：
猪ND1上游引物：5’-CCGGACCTTTCGCCATATTC-3’，猪ND1下游引 物：5’-GCTAGTGTTAGGGGCAGGAA-3’，产物大小：246bp；
牛ND1上游引物：5‘-CACTACGACCCGCTACATCT-3‘，牛ND1下游引 物：5‘-AGTTGGAAGCTCAGCCTGAT-3’，产物大小：195bp；
羊ND1上游引物：5’-ACGTAGAATATGCTGCCGGA-3’，羊ND1下游引 物：5’-GGGTAGGATGCTCGGATTCA-3’，产物大小：199bp；
鸡ND1上游引物：5’-ATGTAGAATATGCCGCCGGA-3’，鸡ND1下游引 物：5’-GGATATGAGGCCCGGATTCA-3’，产物大小:199bp；
鸭ND1上游引物：5’-GAAACAAACCGAGCCCCATT-3’，鸭ND1下游 引物：5’-TAGGGCGCTTGGGTTTAAGA-3’，产物大小：171bp；
兔ND1上游引物：5’-ACCGGGCTCCATTTGACTTA-3’，兔ND1下游引 物：5’-TTCTGGGTTAGTGTGGCTGT-3’，产物大小：179bp；
18S rRNA上游引物：5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’，18S rRNA下游引物：5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’，产物大小： 142bp。
优选地，在步骤S20中，所述第一PCR反应体系和第二PCR反应体系均 为：2×SYBRPremix ExTaqⅡ10μL，上游引物2μL，下游引物2μL，DNA模 板2μL，H2O 4μL，共20μL；其中，所述DNA模板由步骤S10中所提取的所 述第一基因组DNA或所述第二基因组DNA稀释至0.5ng/mL获得。
优选地，在步骤S30中，所述实时定量PCR扩增的反应条件为：
预变性：95℃，5min；
PCR扩增：95℃，30s；60℃30s；35个循环。
优选地，在步骤S20中，所述第一PCR反应体系和第二PCR反应体系中 均包括荧光染料，所述荧光染料为SYBR Green荧光染料、Eva Green荧光染 料或LC Green荧光染料。
本发明提供的检测肉类制品成分的实时定量PCR方法，根据动物线粒体 基因NADH氧化还原酶1种间多态特性的特点，设计实时定量PCR所需的针 对各物种线粒体NADH氧化还原酶1基因的扩增引物序列，并将反应条件优 化到同一体系，则可以在同一个PCR反应体系中对不同物种来源的成分进行 鉴定；同时，通过设置参照组基因18S rRNA的PCR扩增试验，针对从肉类 制品试样中所提取的第一基因组DNA所进行的实时定量PCR扩增反应、以及从标准样品中所提取的第二基因组DNA所进行的实时定量PCR扩增反应， 均依据扩增产物中的NADH氧化还原酶1的Ct值及18S rRNA的Ct值，判 断所进行的实时定量PCR扩增反应正常与否，从而排除了假阳性和假阴性结 果；然后，在判定为对应的实时定量PCR扩增反应为正常进行的情况下，计 算第一PCR扩增产物和第二扩增产物的NADH氧化还原酶1的Ct值的差值 ΔCt，当ΔCt大于6.5时，判定呈阴性，即肉类制品试样中不含有该预设检测 成分，当ΔCt小于6.5时，判定呈阳性，即肉类制品试样中含有该预设检测成 分，检测结果更加准确、可靠。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实 施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面 描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提供的检测肉类制品成分的实时定量PCR方法的一实施例中 使用的特异性引物进行普通PCR扩增的条带结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明 实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者， 按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提出一种检测肉类制品成分的实时定量PCR方法，包括以下步骤：
S10、分别提取肉类制品试样的第一基因组DNA、以及与肉类制品试样 的物种来源对应的标准样品的第二基因组DNA；；
提取DNA的方法可采用常规方法进行，例如苯酚氯仿法抽提，采用苯酚 氯仿法抽提的方法如下：
步骤S11、取肉类制品试样和与肉类制品试样的物种来源对应的标准样 品，对应放入裂解液中并剪碎，再加入蛋白酶K，于55℃反应2～4h后离心， 得到第一上清液；
为便于理解，以所述肉类制品试样为羊肉串，羊肉串中的预设检测成分 为羊肉、鸭肉和鸡肉为例进行说明：取羊肉串试样、以及标准纯羊肉样品各 1g左右，分别放入400～500μL的裂解液中，并用无菌剪刀剪碎(可在1.5mL 的离心管中进行)，再加入40～60μL的蛋白酶K，于55℃反应2～4h后，反 复吹打几次，最后以5000rpm转速离心2min，使固液分离并收集滤液，得到 第一上清液。
其中，所述裂解液包括以下组分：摩尔浓度为1M、pH值为7.5的Tris-HCl 溶液，摩尔浓度为0.5M、pH值为8.0的EDTA溶液，摩尔浓度为1M的NaCl 溶液，质量浓度为5％的SDS溶液，以及水；其中，所述Tris-HCl溶液、EDTA 溶液、NaCl溶液、SDS溶液与水的体积比为1：2：1：4：92。
步骤S12、将所述第一上清液用饱和酚抽提后离心，得到第二上清液；
向第一上清液中加入适量的饱和酚，振荡混匀后，抽提2次，然后以 5000rpm转速离心2min，使固液分离并收集滤液，得到第二上清液。
步骤S13、将所述第二上清液用氯仿抽提后离心，得到第三上清液；
向第一上清液中加入150～250μL的氯仿，振荡混匀后，抽提1次，然后 以5000rpm转速离心2min，使固液分离并收集滤液，得到第三上清液。
步骤S14、向所述第三上清液中加入NaCl溶液或者NaAc溶液进行混合， 然后加入无水乙醇或异丙醇进行混合，以使基因组DNA沉淀，离心获得DNA 沉淀；
向第三上清液中加入0.1倍体积的浓度为5M的NaCl溶液或者0.05倍体 积的浓度为3M的NaAc溶液，混合均匀后，再向其中加入2倍体积的无水乙 醇或1倍体积的异丙醇，混合均匀以沉淀所述肉类制品试样和标准样品中的 基因组DNA，待DNA沉淀完全后，同样通过离心处理使固液分离，收集DNA 沉淀。
步骤S15、将DNA沉淀用乙醇溶液清洗后吹干，再溶解于无菌水中，对 应得到从所述肉类制品试样中提取的第一基因组DNA和从所述标准样品中 提取的第二基因组DNA。
将DNA沉淀用70％乙醇清洗两次后吹干，然后溶解于无菌水中，进行 DNA浓度测定，根据浓度测定结果确认所提取DNA的量，如果提取量偏少， 则再次按照上述步骤S11至S15进行重复提取，直至所提取的DNA量足够用 于后续的PCR扩增反应。
作为一种优选的方案，在步骤S14之后、步骤S15之前，还包括：
向DNA沉淀中加入核糖核酸酶H(剪碎)，于37℃温度下培育30min， 获得去除RNA后的DNA沉淀。通过加入核糖核酸酶H，除去所提取的DNA 样品中的RNA，获得纯度更高的DNA，更有利于进行后续的PCR扩增实验。
S20、针对所述肉类制品试样中的预设检测成分，设计所述第一基因组 DNA和第二基因组DNA中的线粒体NADH氧化还原酶1基因(ND1，NADH oxidoreductase 1)进行PCR扩增所需的特异性引物序列，针对所述第一基因 组DNA和第二基因组DNA中的基因18S rRNA，设计所述基因18S rRNA进 行PCR扩增所需的18S rRNA引物序列，将所述第一基因组DNA与所述特异 性引物、18S rRNA引物配制成第一PCR反应体系，将所述第二基因组DNA 与所述特异性引物、18S rRNA引物配制成第二PCR反应体系；
由于动物的线粒体基因NADH氧化还原酶1具有物种间的多态性特点， 针对所述肉类制品试样中的预设检测成分的来源物种，设计所提取的第一基 因组DNA和第二基因组DNA进行PCR扩增所需要的扩增引物，为便于理解， 同样以所述肉类制品试样为羊肉串，羊肉串中的预设检测成分为羊肉、鸭肉 和鸡肉为例进行说明：分别根据羊、鸭、鸡的动物线粒体基因NADH氧化还 原酶1的多态性特点，设计针对羊、鸭、鸡的动物线粒体NADH氧化还原酶1基因进行PCR扩增所需的特异性引物序列3对；另外，由于所述第二基因 组DNA和第二基因组DNA中均包含有基因18S rRNA，故，以此基因18S rRNA作为参照，设计基因18S rRNA的扩增引物序列1对，然后将羊肉串样 品中所提取的第一基因组DNA与3对特异性引物、1对18SrRNA引物配制 成第一PCR反应体系，同时将标准羊肉样品中提取的第二基因组DNA与3 对特异性引物、1对18S rRNA引物配制成第二PCR反应体系。
本发明提供的方案，针对预设检测成分的来源物种不同，设计线粒体 NADH氧化还原酶1基因进行PCR扩增所需的扩增引物序列，适用于同时检 测肉类制品中不同物种来源的肉类成分中的一种或多种。优选地，在本实施 例中，所述肉类制品试样中的预设检测成分包括猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、 鸭肉和兔肉中的至少一种；所述特异性引物序列包括猪、牛、羊、鸡、鸭和 兔的线粒体基因NADH氧化还原酶1进行PCR扩增所需的特异性引物序列中的至少一种。当然，在其他实施例中，还可以针对其他物种的动物线粒体基 因NADH氧化还原酶1的特性进行特异性引物序列设计，例如鼠、鹿、鱼等， 则可以通过本发明提供的方法检测肉类制品试样中是否含有鼠肉、鹿肉、鱼 肉等成分。
本实施例中，针对猪、牛、羊、鸡、鸭或兔的线粒体NADH氧化还原酶 1基因进行PCR扩增所需的6对特异性引物序列对应如下：
猪ND1上游引物：5’-CCGGACCTTTCGCCATATTC-3’，猪ND1下游引 物：5’-GCTAGTGTTAGGGGCAGGAA-3’，产物大小：246bp；
牛ND1上游引物：5‘-CACTACGACCCGCTACATCT-3‘，牛ND1下游引 物：5‘-AGTTGGAAGCTCAGCCTGAT-3’，产物大小：195bp；
羊ND1上游引物：5’-ACGTAGAATATGCTGCCGGA-3’，羊ND1下游引 物：5’-GGGTAGGATGCTCGGATTCA-3’，产物大小：199bp；
鸡ND1上游引物：5’-ATGTAGAATATGCCGCCGGA-3’，鸡ND1下游引 物：5’-GGATATGAGGCCCGGATTCA-3’，产物大小:199bp；
鸭ND1上游引物：5’-GAAACAAACCGAGCCCCATT-3’，鸭ND1下游 引物：5’-TAGGGCGCTTGGGTTTAAGA-3’，产物大小：171bp；
兔ND1上游引物：5’-ACCGGGCTCCATTTGACTTA-3’，兔ND1下游引 物：5’-TTCTGGGTTAGTGTGGCTGT-3’，产物大小：179bp；
本实施例中，所述18S rRNA引物序列为：18S rRNA上游引物： 5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’，18S rRNA下游引物： 5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’，产物大小：142bp。
针对本发明设计的6对特异性引物序列，以分别从猪、牛、羊、鸡、鸭、 兔对应的标准肉类样品中通过上述苯酚氯仿法提取的基因组DNA为PCR扩 增对象(例如，根据猪ND1基因设计PCR引物，对猪的标准样品中提取的基 因组DNA进行PCR扩增，以此类推)，进行普通PCR扩增(普通聚合酶链 式反应，结果可用于定性分析而不包括实时定量分析)鉴定其是否具有特异 性，普通PCR扩增体系为：2×Turbo Master Mix 15μL，上游引物1μL，下游 引物1μL，DNA模板1μL，H2O 12μL，共30μL；普通PCR反应条件为：
预变性：95℃，5min；
PCR扩增：95℃，30s；56℃45s；72℃30s；35个循环；
恒温：72℃10min；16℃forever。
普通PCR扩增的反应条带如图1所示，由图1可知，有对应的特异性引 物及肉类样品的基因组DNA扩增出的条带单一、清晰，说明所涉及的特异性 引物具有特异性，可用于进行实时定量PCR分析。
在步骤S20中，所述第一PCR反应体系和所述第二PCR反应体系相同， 均为：2×SYBR Premix ExTaqⅡ10μL，上游引物2μL，下游引物2μL，DNA 模板2μL，H2O 4μL，共20μL；其中，所述DNA模板由步骤S10中所提取的 的所述第一基因组DNA或所述第二基因组DNA稀释至0.5ng/mL获得。需要 说明的是，在配制所述PCR反应体系时，所述18S rRNA引物为必须添加的 组分，而对于肉类制品试样中的预设检测成分不同，上述6种特异性引物应 视预设检测成分的物种来源不同而选择性地加入，例如，所述预设检测组分 为猪肉和牛肉时，则需同时加入18S rRNA引物、猪ND1特异性引物或牛ND1 特异性引物。
S30、对所述第一PCR反应体系和第二PCR反应体系分别进行实时定量 PCR扩增，对应获得第一PCR扩增产物和第二PCR扩增产物，分别读取所 述第一PCR扩增产物中的NADH氧化还原酶1的Ct值和18S rRNA的Ct值、 以及所述第二PCR扩增产物中的NADH氧化还原酶1的Ct值和18S rRNA 的Ct值；
对应地，所述实时定量PCR扩增的反应条件为：
预变性：95℃，5min；
PCR扩增：95℃，30s；60℃30s；35个循环。
在PCR扩增反应进行的过程中，可以采用插入带有荧光标记的探针或者 掺杂荧光染料的方法，借助于荧光信号的强弱来检测PCR扩增的产物，在本 方案中，优选为在所述PCR反应体系中掺杂荧光染料的方法检测PCR扩增的 产物，所述荧光染料为SYBR Green荧光染料、Eva Green荧光染料或LC Green 荧光染料。该方法具有快速便捷的特点，有利于节约成本与时间，相比于掺 入带有荧光标记探针的方法，避免了需要针对不用的物种基因设计不同的荧 光标记探针并人工合成所带来的设计难度和成本的增加，而且本方法不需要酶切鉴定，也不需要琼脂糖凝胶电泳，减少了产物污染。另一方面，由于肉 类制品在加工过程中，DNA会出现降解从而产生小的片段，而本方法能够更 好地适用于DNA小片段的扩增，同时，DNA片段小了，其PCR扩增时间则 进一步缩短了，节约了扩增所需时间。
PCR扩增反应过程中的Ct值，即为循环阈值(Cycle threshold)，是指 PCR反应过程中，每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数， Ct值越小，说明PCR扩增反应所需的时间越短，而固定扩增时间时对应生成 的扩增产物含量越高。在本方案中，肉类制品试样中对应的预设检测成分的 NADH氧化还原酶1的Ct值越小，说明肉类制品试样中含有该预设检测成分 的含量越高。
较佳地，所述PCR扩增反应试验过程可使用96孔板进行，在孔板的各个 孔中预先配制好除DNA模板以外的PCR反应体系的所有组分，在检测时， 只需要将由所提取的基因组DNA稀释至预定浓度的DNA模板加入到相应的 孔中，然后放置于PCR反应条件下进行反应即可，操作方便，可同时检测多 个样品。
S40、当所述第一PCR扩增产物与所述第二扩增产物的NADH氧化还原 酶1的Ct值的差值小于或等于2.0，并且所述第一扩增产物与所述第二扩增 产物的18S rRNA的Ct值的差值小于或等于1.0时，判定为对应获得PCR扩 增产物所进行的实时定量PCR扩增反应正常；
S50、在判定获得所述第一PCR扩增产物所进行的实时定量PCR扩增反 应、以及获得所述第二PCR扩增产物所进行的实时定量PCR扩增反应均正常 时，计算所述第一PCR扩增产物与所述第二PCR扩增产物的NADH氧化还 原酶1的Ct值的差值ΔCt，当ΔCt大于6.5时，判定呈阴性，即所述肉类制品 试样中不含有所述预设检测成分，当ΔCt小于6.5时，判定呈阳性，即所述肉 类制品试样中含有所述预设检测成分。
在判断肉类制品试样中是否含有预设检测成分之前，首先需要排除假阳 性和假阴性的检测结果，可通过如下判定方式进行：读取PCR扩增反应过程 中，肉类制品试样和标准样品的基因组DNA扩增产物中的NADH氧化还原 酶1的Ct值和18S rRNA的Ct值后，对PCR扩增产物进行初步判定，对于 所述第一PCR扩增产物而言，当其NADH氧化还原酶1和18S rRNA的Ct 值与所述第二PCR扩增产物NADH氧化还原酶1和18S rRNA的Ct值满足 上述步骤S40中的预设条件时，判定为此次进行的PCR扩增反应正常，所读 取的数据可用，试验具有可靠性，可根据步骤S50中提供的方法，判断肉类 制品试样种是否含有预设检测成分；而当所述第一PCR扩增产物的NADH氧 化还原酶1和18S rRNA的Ct值不满足上述步骤S40中的预设条件时，说明 此次PCR扩增反应并不是正常进行，试验不具有可靠性，此时，若ΔCt大于 6.5，判定为试验结果呈假阴性，若ΔCt小于6.5，则判定为试验结果呈假阳性， 需要改变PCR扩增反应的基线或荧光信号的设定阈值等，并再次进行PCR扩 增试验。如此，则能够排除假阳性和假阴性结果，使试验结果更为准确、可 靠。
本发明提供的检测肉类制品成分的实时定量PCR方法，根据动物线粒体 基因NADH氧化还原酶1种间多态性的特点，设计实时定量PCR所需的针对 各物种线粒体NADH氧化还原酶1基因的扩增引物序列，并将反应条件优化 到同一体系，则可以在同一个PCR反应体系中对不同物种来源的成分进行鉴 定；同时，通过设置参照组基因18S rRNA的PCR扩增试验，针对从肉类制 品试样中所提取的第一基因组DNA所进行的实时定量PCR扩增反应、以及 对从标准样品中所提取的第二基因组DNA所进行的实时定量PCR扩增反应， 均依据扩增产物中的NADH氧化还原酶1的Ct值及18S rRNA的Ct值，判 断所进行的实时定量PCR扩增反应正常与否，从而排除了假阳性和假阴性结 果；然后，在判定为对应的实时定量PCR扩增反应为正常进行的情况下，计 算第一PCR扩增产物和第二扩增产物的NADH氧化还原酶1的Ct值的差值 ΔCt，当ΔCt大于6.5时，判定呈阴性，即肉类制品试样中不含有该预设检测 成分，当ΔCt小于6.5时，判定呈阳性，即肉类制品试样中含有该预设检测成 分，检测结果更加准确、可靠。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应 当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1标准样品的单一成分检测
(1)原材料准备：
取6种单一成分的肉类制品，作为与肉类制品的物种来源对应的标准样 品，编号为1#～6#，其来源种属分别为猪、牛、羊、鸡、鸭和兔，各取1g左 右。
(2)基因组DNA提取：
先将猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉和兔肉样品分别用无菌剪刀在1.5mL 的离心管及450μL的裂解液中剪碎，然后加入50μL蛋白酶K，于55℃反应 2～4h后，反复吹打几次，以5000rpm转速离心2min，取上清液；加入适量的 饱和酚，振荡混匀后，抽提2次，以5000rpm转速离心2min，取上清液；加 入200μL氯仿再抽提1次，以5000rpm转速离心2min，取上清液；加入0.1 倍体积的浓度为5M的NaCl溶液，混匀后再加入2倍体积的无水乙醇，混匀， 以沉淀基因组DNA，以5000rpm转速离心2min，取DNA沉淀；用70％的乙 醇清洗两次后吹干，用无菌水溶解DNA，测浓度，对应制得分别从猪肉、牛 肉、羊肉、鸡肉、鸭肉和兔肉样品提取的6组基因组DNA。
其中，所述裂解液包括以下组分：摩尔浓度为1M、pH值为7.5的Tris-HCl 溶液，摩尔浓度为0.5M、pH值为8.0的EDTA溶液，摩尔浓度为1M的NaCl 溶液，质量浓度为5％的SDS溶液，以及水；其中，所述Tris-HCl溶液、EDTA 溶液、NaCl溶液、SDS溶液与水的体积比为1：2：1：4：92。
(3)线粒体基因NADH氧化还原酶1(ND1)PCR扩增所需的6对特异 性引物序列，及1对18S rRNA引物序列如下：
猪ND1上游引物：5’-CCGGACCTTTCGCCATATTC-3’，猪ND1下游引 物：5’-GCTAGTGTTAGGGGCAGGAA-3’，产物大小：246bp；
牛ND1上游引物：5‘-CACTACGACCCGCTACATCT-3‘，牛ND1下游引 物：5‘-AGTTGGAAGCTCAGCCTGAT-3’，产物大小：195bp；
羊ND1上游引物：5’-ACGTAGAATATGCTGCCGGA-3’，羊ND1下游引 物：5’-GGGTAGGATGCTCGGATTCA-3’，产物大小：199bp；
鸡ND1上游引物：5’-ATGTAGAATATGCCGCCGGA-3’，鸡ND1下游引 物：5’-GGATATGAGGCCCGGATTCA-3’，产物大小:199bp；
鸭ND1上游引物：5’-GAAACAAACCGAGCCCCATT-3’，鸭ND1下游 引物：5’-TAGGGCGCTTGGGTTTAAGA-3’，产物大小：171bp；
兔ND1上游引物：5’-ACCGGGCTCCATTTGACTTA-3’，兔ND1下游引 物：5’-TTCTGGGTTAGTGTGGCTGT-3’，产物大小：179bp；
18S rRNA上游引物：5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’，18S rRNA下游引物：5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’，产物大小： 142bp。
(4)PCR扩增反应：
配制12组PCR反应体系：2×SYBR Premix ExTaqⅡ10μL，上游引物2μL， 下游引物2μL，DNA模板2μL，H2O 4μL，共20μL；其中6组的DNA模板 来自步骤(2)中提取的标准样品猪、牛、羊、鸡、鸭和兔基因组DNA，且 浓度已稀释至0.5mg/mL，每组PCR反应体系中均含有18SrRNA引物以扩增 18S rRNA；另外6组PCR反应体系中分别对应含有猪ND1引物、牛ND1引 物、羊ND1引物、鸡ND1引物、鸭ND1引物和兔ND1引物，以扩增各自的 线粒体基因NADH氧化还原酶1。
按如下条件进行PCR反应：
预变性：95℃，5min；
PCR扩增：95℃，30s；60℃30s；35个循环；
添加溶解曲线。
(4)读取PCR扩增产物ND1及18S rRNA的Ct值，如下表1所示。
表1实施例1中扩增产物ND1及18S rRNA的Ct值
由表1中的结果可知，对于不同标准样品的扩增产物而言，其18S rRNA Ct值的差值均小于1.0，证明此所进行的实时定量PCR扩增反应正常，数据 可用。各标准样品中的18SrRNA的含量基本相似，但是NADH氧化还原酶1 的量有差异，其中牛肉中的NADH氧化还原酶1的含量最高。以此标准样品 中的ND1的Ct值和18S rRNA Ct值作为标准值，来判断其他待检测的肉类制 品试样中有无掺杂的肉类成分。
实施例2含有混合成分的肉类制品检测
(1)原材料准备：
以标准羊肉、羊肉串1、羊肉串2和羊肉串3作为肉类制品试样，各取 1g左右，其中，肉类制品试样中的预设待检测成分均为羊肉、猪肉和鸭肉。
(2)按与实施例1中步骤(2)相同的方法，分别提取标准羊肉、羊肉 串1、羊肉串2和羊肉串3的基因组DNA共计4组。
(3)线粒体基因NADH氧化还原酶1(ND1)PCR扩增所需的3对特异 性引物序列，及1对18S rRNA引物序列如下：
猪ND1上游引物：5’-CCGGACCTTTCGCCATATTC-3’，猪ND1下游引 物：5’-GCTAGTGTTAGGGGCAGGAA-3’，产物大小：246bp；
羊ND1上游引物：5’-ACGTAGAATATGCTGCCGGA-3’，羊ND1下游引 物：5’-GGGTAGGATGCTCGGATTCA-3’，产物大小：199bp；
鸭ND1上游引物：5’-GAAACAAACCGAGCCCCATT-3’，鸭ND1下游 引物：5’-TAGGGCGCTTGGGTTTAAGA-3’，产物大小：171bp；
18S rRNA上游引物：5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’，18S rRNA下游引物：5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’，产物大小： 142bp。
(4)PCR扩增反应：
配制8组PCR反应体系：2×SYBR Premix ExTaqⅡ10μL，上游引物2μL， 下游引物2μL，DNA模板2μL，H2O 4μL，共20μL；其中4组PCR反应体系 中DNA模板来自步骤(2)中提取的基因组DNA，且浓度已稀释至0.5mg/mL， 这4组PCR反应体系中加入18S rRNA引物或猪ND1、羊ND1、鸭ND1特 异性引物，另外4组PCR反应体系中分别加入从标准羊肉、羊肉串1、羊肉 串2和羊肉串3中提取的基因组DNA及相应的18S rRNA或猪、羊、鸭ND1 特异性引物。
按如下条件进行PCR反应：
预变性：95℃，5min；
PCR扩增：95℃，30s；60℃30s；35个循环；
添加溶解曲线。
(4)读取PCR扩增产物ND1及18S rRNA的Ct值，如下表2所示。
表2实施例2中扩增产物ND1及18S rRNA的Ct值
由表2中的结果可知，标准羊肉样品的羊ND1Ct值与18S rRNA Ct值与 实施例1中测定的标准值都非常接近(差值小于1.0)，而检测的三个羊肉串 样品中的18S rRNA Ct值与标准值也非常接近(差值小于1.0)，证明此次实 时定量PCR扩增反应正常，数据可用。然后，分析羊肉串1、羊肉串2和羊 肉串3中依据线粒体NADH氧化还原酶1基因而扩增的产物Ct值与标准样品NADH氧化还原酶1基因扩增产物的Ct值的差值ΔCt，计算结果如下：
(1)羊肉串1
羊ND1Ct值与羊标准样品ND1Ct值(23.3)的差值为0，＜6.5，呈阳 性；猪ND1Ct值与猪标准样品ND1Ct值(26.1)的差值为5，＜6.5，呈阳 性；未检测出鸭ND1Ct值；说明羊肉串1中掺杂有猪肉；
(2)羊肉串2
羊ND1Ct值与羊标准样品ND1Ct值(23.3)的差值为0.3，＜6.5，呈阳 性；猪ND1Ct值与猪标准样品ND1Ct值(26.1)的差值为8.7，＞6.5，呈阴 性；鸭ND1Ct值与鸭标准样品ND1Ct值(33.2)的差值为1.4，＜6.5，呈阳 性；说明羊肉串2中掺杂有鸭肉；
(3)羊肉串3与标准羊肉
羊ND1Ct值与羊标准样品ND1Ct值(23.3)的差值为-0.3，＜6.5，呈阳 性；猪ND1Ct值与猪标准样品ND1Ct值(26.1)的差值为8.4，＞6.5，呈阴 性；未检测出鸭ND1Ct值；说明羊肉串3中没有掺杂猪肉或鸭肉。
综上所述，本发明提供的检测肉类制品成分的实时定量PCR方法，针对 预设检测成分的物种来源不同，设计线粒体NADH氧化还原酶1基因的扩增 引物序列，适用于同时检测肉类制品中不同物种来源的肉类成分中的一种或 多种，不需要酶切鉴定，也不需要琼脂糖凝胶电泳，减少了产物污染，还减 少了试验成本和时间，且检测结果更为准确、可靠。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于 本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神 和原则之类，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专 利保护范围内。
Claims (7)
1.一种检测肉类制品成分的实时定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
S10、分别提取肉类制品试样的第一基因组DNA、以及与肉类制品试样的物种来源对应的标准样品的第二基因组DNA；
S20、针对所述肉类制品试样中的预设检测成分，设计所述第一基因组DNA和第二基因组DNA中的线粒体NADH氧化还原酶1基因进行PCR扩增所需的特异性引物序列，针对所述第一基因组DNA和第二基因组DNA中的基因18S rRNA，设计所述基因18S rRNA进行PCR扩增所需的18S rRNA引物序列，将所述第一基因组DNA与所述特异性引物、18S rRNA引物配制成第一PCR反应体系，将所述第二基因组DNA与所述特异性引物、18S rRNA引物配制成第二PCR反应体系；
S30、对所述第一PCR反应体系和第二PCR反应体系分别进行实时定量PCR扩增，对应获得第一PCR扩增产物和第二PCR扩增产物，分别读取所述第一PCR扩增产物中的NADH氧化还原酶1的Ct值和18S rRNA的Ct值、以及所述第二PCR扩增产物中的NADH氧化还原酶1的Ct值和18S rRNA的Ct值；
S40、当所述第一PCR扩增产物与所述第二扩增产物的NADH氧化还原酶1的Ct值的差值小于或等于2.0，并且所述第一扩增产物与所述第二扩增产物的18S rRNA的Ct值的差值小于或等于1.0时，判定为对应获得PCR扩增产物所进行的实时定量PCR扩增反应正常；
S50、在判定获得所述第一PCR扩增产物所进行的实时定量PCR扩增反应、以及获得所述第二PCR扩增产物所进行的实时定量PCR扩增反应均正常时，计算所述第一PCR扩增产物与所述第二PCR扩增产物的NADH氧化还原酶1的Ct值的差值∆Ct，当∆Ct大于6.5时，判定呈阴性，即所述肉类制品试样中不含有所述预设检测成分；当∆Ct小于6.5时，判定呈阳性，即所述肉类制品试样中含有所述预设检测成分；
其中，在步骤S20中：
所述肉类制品试样中的预设检测成分包括猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉和兔肉；
所述特异性引物序列包括猪、牛、羊、鸡、鸭和兔的线粒体NADH氧化还原酶1基因进行PCR扩增所需的特异性引物序列，且所述猪、牛、羊、鸡、鸭或兔的线粒体NADH氧化还原酶1基因进行PCR扩增所需的特异性引物序列，以及所述18S rRNA引物序列，对应如下：
猪ND1上游引物：5’-CCGGACCTTTCGCCATATTC- 3’，猪ND1下游引物：5’-GCTAGTGTTAGGGGCAGGAA- 3’，产物大小：246 bp；
牛ND1上游引物：5‘-CACTACGACCCGCTACATCT-3‘，牛ND1下游引物：5‘-AGTTGGAAGCTCAGCCTGAT-3’，产物大小：195bp；
羊ND1上游引物：5’-ACGTAGAATATGCTGCCGGA-3’，羊ND1下游引物：5’-GGGTAGGATGCTCGGATTCA-3’，产物大小：199bp；
鸡ND1上游引物：5’-ATGTAGAATATGCCGCCGGA- 3’，鸡ND1下游引物：5’-GGATATGAGGCCCGGATTCA- 3’，产物大小:199bp；
鸭ND1上游引物：5’-GAAACAAACCGAGCCCCATT -3’，鸭ND1下游引物：5’-TAGGGCGCTTGGGTTTAAGA -3’，产物大小：171bp；
兔ND1上游引物：5’-ACCGGGCTCCATTTGACTTA-3’，兔ND1下游引物：5’-TTCTGGGTTAGTGTGGCTGT-3’ ，产物大小：179bp；
18S rRNA上游引物：5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’，18S rRNA下游引物：5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’，产物大小：142bp。
2.如权利要求1所述的检测肉类制品成分的实时定量PCR方法，其特征在于，步骤S10包括：
步骤S11、取肉类制品试样、以及与肉类制品试样的物种来源对应的标准样品，对应放入裂解液中并剪碎，再加入蛋白酶K，于55℃反应2~4h后离心，得到第一上清液；
步骤S12、将所述第一上清液用饱和酚抽提后离心，得到第二上清液；
步骤S13、将所述第二上清液用氯仿抽提后离心，得到第三上清液；
步骤S14、向所述第三上清液中加入NaCl溶液或者NaAc溶液进行混合，然后加入无水乙醇或异丙醇进行混合，以沉淀所述肉类制品试样和标准样品中的基因组DNA，离心获得DNA沉淀；
步骤S15、将DNA沉淀用乙醇溶液清洗后吹干，再溶解于无菌水中，对应得到从所述肉类制品试样中提取的第一基因组DNA和从所述标准样品中提取的第二基因组DNA。
3.如权利要求2所述的检测肉类制品成分的实时定量PCR方法，其特征在于，步骤S11中，所述裂解液包括以下组分：摩尔浓度为1M、pH值为7.5的Tris-HCl溶液，摩尔浓度为0.5M、pH值为8.0的EDTA溶液，摩尔浓度为1M的NaCl溶液，质量浓度为5%的SDS溶液，以及水；其中，所述Tris-HCl溶液、EDTA溶液、NaCl溶液、SDS溶液与水的体积比为1：2：1：4：92。
4.如权利要求2所述的检测肉类制品成分的实时定量PCR方法，其特征在于，在步骤S14之后、步骤S15之前，还包括：
向DNA沉淀中加入核糖核酸酶H，于37℃温度下培育30min，获得去除RNA后的DNA沉淀。
5.如权利要求1所述的检测肉类制品成分的实时定量PCR方法，其特征在于，在步骤S20中，所述第一PCR反应体系和第二PCR反应体系均为：2× SYBR Premix ExTaq Ⅱ 10µL，上游引物2µL，下游引物2µL，DNA模板2µL，H2O 4µL，共20µL；其中，所述DNA模板由步骤S10中所提取的所述第一基因组DNA或所述第二基因组DNA稀释至0.5ng/mL获得。
6.如权利要求5所述的检测肉类制品成分的实时定量PCR方法，其特征在于，在步骤S30中，所述实时定量PCR扩增的反应条件为：
预变性：95°C，5min；
PCR扩增：95°C，30s；60°C 30s；35个循环。
7.如权利要求1所述的检测肉类制品成分的实时定量PCR方法，其特征在于，在步骤S20中，所述第一PCR反应体系和第二PCR反应体系中均包括荧光染料，所述荧光染料为SYBRGreen荧光染料、Eva Green荧光染料或LC Green荧光染料。
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