CN108018360B - 一种基于dna微条形码技术的食用海参物种鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于DNA微条形码的食用海参物种鉴定方法。该方法通过海参基因组DNA提取，然后利用DNA微条形码引物进行PCR扩增，得到长度为257 bp的PCR产物，所述DNA微条形码引物为MiniCOI‑F:CATGGCTTTCCCTCGAATGAA；MiniCOI‑R:TAACTCCTGGGGTTCGCATCT。最后将测序所得的DNA微条形码片段序列在美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）进行比对，根据序列的匹配相似度进行物种鉴别。该方法操作简便，准确性高，能够鉴别经过加工的、形态学特征消失的市售海参，为维护企业与消费者利益以及正常的市场秩序提供技术支撑。

Description

一种基于DNA微条形码技术的食用海参物种鉴定方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体而言，本发明涉及一种基于DNA微条形码技术的食用海参物种鉴定方法。

背景技术

海参(sea cucumber)隶属棘皮动物门(Echinodermata)海参纲(Holothrioider)，共分为3亚纲、6目和25科。目前全球已知的海参共有1500 多种，其中具有较高经济和食用价值的海参约有60种。作为海参最大的消费市场，我国目前可供食用的海参共有20余种。海参在我国被认为是一种高蛋白、低脂肪的名贵海产品。其营养价值高且味道鲜美，富含蛋白质、氨基酸、多种维生素、必需脂肪酸以及微量元素等50多种营养成分，同时含有多糖、皂苷、胶原蛋白等重要的生物活性物质，在抗癌、抗肿瘤、免疫调节及抗凝血等方面可发挥显著功效。

在贸易中海参多以干海参、水发海参、精深加工的海参制品等形式流通，鲜活海参和冻品仅占一小部分。在加工过程中海参经过干制、切片、制粉等加工工艺，形态学特征基本消失，使得其种类和品质难以被消费者、经销商和监管部门鉴别。加之市场上海参种类繁多、产地不同、营养成分及其含量各异等因素导致海参的价格相差可高达10倍以上。受经济利益驱动，在贸易中海参掺假造假现象时有发生，例如海参产地的造假以及一些不规范厂家通过贴假标签用低值海参冒充高值海参等。

DNA条形码(DNA Barcoding)技术是利用一段标准的、较短的DNA序列作为分子标记，通过对生物体中一个或多个基因进行扫描，从而实现物种鉴定的技术。目前DNA条形码技术已经广泛应用于生物的分类和鉴定，是一种简便、高效、准确的物种鉴定技术。线粒体细胞色素c氧化酶亚基I(cytochrome oxidase subunit I，COI)基因是动物界中是最常用的DNA条形码。但是在一些加工食品中，由于其DNA遭到破坏，导致无法提取到完整的COI基因，此时提取到部分 COI基因(100bp-300bp)也可以准确鉴定物种。

本发明提供一种基于DNA微条形码技术的食用海参物种鉴定方法，有利于实现不同市售海参的准确鉴别。该方法与传统的形态学鉴定方法相比，可以解决形态学鉴定中因样品残缺不全无法准确鉴定的问题，而且鉴定准确性大大提高。此外，该方法可以为解决加工海参制品中的海参物种成分鉴定提供简单有效的科学手段。

发明内容

本发明的目的是建立一种基于DNA微条形码技术的食用海参物种鉴定方法，为海参市场的监管提供技术支持。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现:

一种基于DNA微条形码技术的食用海参物种鉴定方法，从NCBI网站上下载不同种类的食用海参的COI基因序列，利用MEGA6.0软件对序列进行多重比对，移除相同序列，找到保守区域。根据保守区域，利用primmer5.0软件设计DNA 微条形码引物，然后利用此引物对已知物种信息的海参的COI基因目的片段进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳确定PCR扩增结果，随后进行Sanger测序。将得到的基因序列利用DNASART软件中的SeqMan功能进行序列拼接，并删除拼接好的序列两端的引物序列。所得序列在NCBI网站上进行BLAST比对，根据相似度、覆盖度以及综合得分确定海参物种信息。将DNA微条形码鉴定结果与已知物种信息比较，评估DNA微条形码技术在海参物种鉴定中的有效性。

本发明以海参DNA为检测基础，根据COI基因序列在不同海参物种中具有差异性的特点，在海参COI基因序列的保守区域设计引物，通过PCR扩增出 257bp的DNA微条形码片段，将测序得到的序列在NCBI网站进行BLAST搜索，可实现海参物种的鉴定。

本发明是基于DNA微条形码技术的食用海参物种鉴定方法，具有操作简单、结果可靠和准确性高等优点。使用本发明的DNA微条形码鉴别方法，有利于实现对市售海参的物种鉴定。

附图说明

图1显示的是所设计的引物MiniCOI-F/R对已知海参样品DNA的COI 基因序列扩增电泳图。其中，M:Marker 2000bp；1-28依次为Holothuria leucospilota(玉足海参)、Holothuria scabra(糙海参)、Holothuria poli、Holothuria tubulosa、Holothuriatubulosa、Holothuria mexicana(墨西哥海参)、Holothuria mexicana(墨西哥海参)、Holothuria isuga、Holothuria atra(黑海参)、Holothuria fuscogilva(黄乳海参)、Holothuria forskali、Bohadschia marmorata(图纹白尼参)、Bohadschia argus(蛇目白尼参)、Actinopyga agassizi(茄辐肛参)、Apostichopus japonicus(仿刺参)、Apostichopus japonicus(仿刺参)、Apostichopus japonicus (仿刺参)、Apostichopusjaponicus(仿刺参)、Apostichopus japonicus(仿刺参)、Stichopus horrens(糙刺参)、Stichopus chloronotus(绿刺参)、Isostichopus badionotus(四边刺参)、Parastichopustremulus、Parastichopus californicus(加州拟刺参)、Thelenata ananas(梅花参)、Thelenata ananas(梅花参)、Athyonidium chilensis(智力瓜参)、Cucumaria frondosa(大西洋海参)；29：空白对照。

具体实施方式

通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。

本实施例为通过如下试验对海参的DNA微条形码扩增效率和鉴别进行准确度评价。

1.引物设计

从NCBI网站下载不同种类的食用海参的COI基因序列，利用

MEGA6.0软件对序列进行多重比对，移除相同序列，找到保守区域。利用保守区域结合primmer5.0软件设计一对DNA微条形码引物 MiniCOI-F:CATGGCTTTCCCTCGAATGAA，MiniCOI-R:TAACTCCTGGGGTTCGCATCT。

表1 PCR引物及其退火温度

2.样本基因组DNA的提取

对28个已知物种信息的海参样品采用改进的CTAB法提取海参DNA，干海参用无菌水50℃泡发过夜，取肌肉柱100mg冲洗干净，用滤纸吸干，切碎或液氮研碎。加入400μL CTAB提取缓冲液(50mM Tris-HCl，PH 7.5；1.5％CTAB； 1M NaCl；15mM EDTA)和12μL 20mg/mL的蛋白酶K，置于55℃水浴5-8h 至样品溶解。加入600μL氯仿，震荡混合3min，12000g离心10min。取上清，加入500μL氯仿，颠倒混合2min,12000g离心5min。重复上述步骤，至分层面无沉淀。取上清，加入5 00μL CTAB沉淀液(1％CTAB；50mM Tris-HCl，PH 7.5；10mM EDTA)混匀，静置2min，65℃水浴20min，12000g 离心15min，弃上清，留沉淀。加入200μL 1.2M的NaCl，轻轻混匀至DNA 完全溶解，再加入6μL RNase，置于37℃孵育30min。加入200μL氯仿，震荡混合，12000g离心5min。取上清，加入1mL冰乙醇和100μL 3M NaAc， -20℃静置l 0min，中间混匀一次，15000g离心10min,即得到DNA沉淀。弃上清，再加入1mL 70％冰乙醇清洗一次，12000g离心5min。将DNA沉淀晾干，加入20-30μL无菌水溶解，即可得到海参DNA原液。

使用紫外分光光度计检测DNA浓度及其在260nm和280nm处的吸光值 A260和A280，并以OD260/OD280比值判断DNA的纯度。OD260/OD280比值在1.7-2.0之间较为理想。

3.DNA微条形码基因片段的扩增、纯化与测序

(1)PCR扩增

以28个已知海参物种信息的海参样品DNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增的条件为:94℃预变性5min；94℃变性50s，54℃退火50s，72℃延伸1min；35 个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存。PCR反应体系：

2×PCR reaction mix 25μL，上、下游引物各2μL(引物浓度10μM)，DNA 模板5ng，用灭菌双蒸水补足体积至50μL。PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测条带。

(2)PCR产物纯化

用PCR产物纯化试剂ExoSAP-IT^TM纯化PCR产物：每5μL PCR产物加入2μ L ExoSAP-IT^TM试剂混匀，放入PCR仪，37℃15min，80℃15min。对于单一样品，纯化后直接进行测序反应。

(3)测序

将纯化后的PCR产物进行双向测序，测序反应体系总体积共10μL：5× Sequencingbuffer 1μL，Big Dye Terminator V3.1 1μL，引物0.16μL(10μM)， Nuclease-free water6.84μL，PCR纯化产物1μL。PCR扩增反应条件为：96℃2 min；96℃15s，54℃10s，60℃4min，30个循环；4℃保存。采用测序产物纯化试剂盒

XTerminatorTM Purification Kit进行纯化，每管吸取10 μL上清液于96孔板中测序。

(4)数据分析

将得到的序列利用DNASART软件中的SeqMan功能进行序列拼接，将拼接好的序列经过MEGA6.0软件进行多序列比对，去掉序列两端的低质量区。将处理好的序列在NCBI的GenBank数据库中进行BLAST搜索，根据相似度、覆盖度以及综合得分确定海参物种信息。将DNA微条形码鉴定结果与已知物种信息比较，评估DNA微条形码在海参物种鉴定的准确度。

4.结果分析

如图1所示，结果显示引物MiniCOI-F/R在28个海参样品中均扩增出257bp的目标片段，且条带单一明亮，说明设计的DNA微条形码扩增效果佳。表2为海参DNA微条形码的鉴定结果。28个样品的DNA微条形码测序成功率达到100％。 DNA微条形码的鉴定结果与已知物种信息一致，且物种相似度≥98％。因此，本发明设计的引物MiniCOI-F/R扩增出的DNA微条形码可分辨出不同物种的海参样品，本发明的方法可应用于市售海参的物种鉴定中。

虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在附属权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。

表2海参标准样品DNA微条形码鉴定结果

Claims (3)

1.一种基于DNA微条形码技术的食用海参物种鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)基于包括海参科、刺参科和瓜参科海参在内的不同食用海参的COI基因设计一对扩增产物长度小于300bp的PCR引物；

(2)从不同的已知物种信息的海参组织中分离提取DNA，然后将其DNA作为模板，采用步骤(1)利用设计的引物进行聚合酶链式反应扩增海参的COI基因片段，用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，PCR产物纯化后进行测序；

(3)将测序结果在NCBI(National Center for Biotechnology Information)网站上进行分析比对，确定物种信息，同时建立系统发育树，验证建立的DNA微条形码方法鉴定结果的可靠性；

DNA微条形码引物的核苷酸序列为：

MiniCOI-F:CATGGCTTTCCCTCGAATGAA；

MiniCOI-R:TAACTCCTGGGGTTCGCATCT。

2.根据权利要求1所述的基于DNA微条形码技术的食用海参物种鉴定方法，其特征在于，所述步骤(2)的PCR反应体系：2×PCR reaction mix 25μL，上、下游引物各2μL引物浓度10μM，DNA模板5ng，用灭菌双蒸水补足体积至50μL；PCR扩增条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性50秒，54℃退火50秒，72℃延伸1分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。

3.根据权利要求1所述的基于DNA微条形码技术的食用海参物种鉴定方法，其特征在于，扩增产物的扩增片段为257bp，用2％的琼脂糖电泳检测。

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