CN102559874A

CN102559874A - 一种蓝鳍、大目和黄鳍金枪鱼生鱼片的pcr鉴定方法

Info

Publication number: CN102559874A
Application number: CN2011104222498A
Authority: CN
Inventors: 王联珠; 姚琳; 江艳华; 朱文嘉; 翟毓秀; 宋春丽; 李烨; 李晓庆
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2011-12-16
Filing date: 2011-12-16
Publication date: 2012-07-11

Abstract

一种蓝鳍、大目和黄鳍金枪鱼生鱼片的PCR鉴定方法，属于食品检测技术领域，包括以下步骤：金枪鱼生鱼片DNA的提取，以提取DNA为模板，以F1/F2为引物，PCR扩增COI基因片段，电泳检测扩增片段，纯化后将PCR产物测序；PCR测序结果通过NCBI网站在线提供的BLSAT软件，确定生鱼片来源鱼的属；确定属后，再通过分析COI扩增片段的种特异性核酸位点确定金枪鱼生鱼片来源鱼的品种。本发明从分子水平上对金枪鱼生鱼片的来源鱼品种进行鉴定，能够准确区分金枪鱼生鱼片的来源，对规范金枪鱼生鱼片市场具有重要意义。

Description

一种蓝鳍、大目和黄鳍金枪鱼生鱼片的PCR鉴定方法

技术领域：

本发明属于食品检测技术领域，具体地涉及一种蓝鳍、大目和黄鳍金枪鱼生鱼片的PCR鉴定方法。

背景技术：

从生物学分类上讲，金枪鱼指鲈形目(Perciformes)鲭科(Scombridae)金枪鱼属(Thunnus)的共计8种鱼类。经济价值较大的种类包括蓝鳍金枪鱼(Thunnusmaccoyii)、大目金枪鱼(Thunnus obesus)、黄鳍金枪鱼(Thunnus albacares)、长鳍金枪鱼(Thunnus alalunga)等，其中蓝鳍金枪鱼、大目金枪鱼、黄鳍金枪鱼是国内生鱼片最常见的原料鱼。

金枪鱼肉质柔嫩鲜美，高蛋白低脂肪，含有多种人体必需的氨基酸，还含有微生素、丰富的铁、钾、钙、碘等多种矿物质和微量元素。金枪鱼中不饱和脂肪酸DHA(二十二碳六烯酸)和EPA(二十碳五烯酸)的含量居各种食物之首。DHA被人们称之谓脑黄金，是人类大脑和中枢神经系统发育必需的营养素。EPA又称OMEGA3，是金枪鱼所特有的营养物质，可抑制胆固醇增加和防止动脉硬化，对预防和治疗心脑血管疾病有着特殊的作用。鉴于金枪鱼的种种优点，目前金枪鱼的消费量逐年增大，其中生鱼片是金枪鱼的最重要的消费方式。蓝鳍金枪鱼由于捕捞量稀少，因而其经济价值较高，蓝鳍金枪鱼是黄鳍金枪鱼和大目金枪鱼价格的两倍之多，然而生鱼片缺乏外部形态学特征，不易鉴定其物种来源，不法商家以次充好，以低价值金枪鱼生鱼片冒充高价值金枪鱼生鱼片，以获取暴利，扰乱了市场秩序，破坏了商业诚信，损害了消费者利益，因此急需针对上述三种金枪鱼生鱼片建立快速、准确的鉴定方法。

生命条形码技术是物种鉴定常用的一项技术，该技术利用一段被称作DNA条形码(DNA Barcoding)的序列，通过PCR扩增、测序分析，进行物种鉴定。对于大多数物种而言，标准的DNA条形码是细胞色素C氧化酶亚基I基因(COI)的一个约650bp左右的片段，该片段在种内保守，在种间变异程度大，所以可以用来进行物种鉴别。但由于金枪鱼的分类比较复杂，该技术目前仅能对蓝鳍、黄鳍、大目金枪鱼生鱼片来源鱼进行属(Genus)的鉴定，不能准确进行种(Species)的鉴别。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是提供一种用于蓝鳍、大目和黄鳍金枪鱼生鱼片来源鱼品种的PCR鉴定方法，针对目前市场上以黄鳍金枪鱼和大目金枪鱼生鱼片假冒蓝鳍金枪鱼生鱼片的行为，解决金枪鱼生鱼片来源鱼的品种难以鉴别的问题。

本发明在DNA条形码技术的基础上，通过大量DNA序列数据模拟与实际样本分析，确定了上述三种金枪鱼COI基因中的种特异性核酸位点，从而为蓝鳍、黄鳍、大目三种金枪鱼生鱼片的鉴别提供了快速准确的技术方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种用于蓝鳍、大目和黄鳍金枪鱼生鱼片来源鱼品种的PCR鉴定方法，包括以下步骤：

1)提取金枪鱼生鱼片DNA；

2)以提取的DNA为模板，以F1/F2为引物，PCR扩增COI基因片段，其中F1：5-CACAAAGACATTGGCACCCT-3；

F2：5-CCTCCTGCAGGGTCAAAGAA-3；

3)琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段，将650bp的目的条带切下纯化，将纯化后的PCR产物测序；

4)PCR产物测序结果通过NCBI网站在线提供的BLSAT软件，确定金枪鱼生鱼片来源鱼的属(Genus)；

5)确定属(Genus)后，再通过分析COI扩增片段的种特异性核酸位点确定金枪鱼生鱼片来源鱼的品种(Species)，即蓝鳍金枪鱼的COI基因扩增片段的第337个碱基为胸腺嘧啶T，第508个碱基为鸟嘌呤G，大目金枪鱼和黄鳍金枪鱼在上述两个位点均为胞嘧啶C；大目金枪鱼COI基因扩增片段的第400个碱基为胞嘧啶C或者鸟嘌呤G，蓝鳍金枪鱼和黄鳍金枪鱼鱼在该位点均为胸腺嘧啶T。

进一步，所述的PCR反应条件为：

进一步，所述的琼脂糖凝胶电泳检测所用的凝胶浓度为0.8％。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明从分子水平对金枪鱼生鱼片来源鱼的品种进行鉴定，更加准确，为打击假冒伪劣行为，维护市场经营秩序提供了有力的技术支撑。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步解释。

针对蓝鳍、黄鳍和大目三种金枪鱼的生鱼片，采用本发明的技术方法进行鉴别。

一、提取生鱼片的DNA：

提取三种生鱼片的DNA并做好标记，具体操作步骤如下：

1)戴一次性医用薄膜手套，用去离子水清洗生鱼片表面，用灭菌眼科剪取0.05g肌肉(约半个绿豆大)放入1.5mL灭菌离心管中，加入0.5mL的细胞裂解液(10mM Tris-cl，0.1M EDTA，pH＝8.0；0.5％(m/v)SDS)，再加入终浓度为100μg/mL的蛋白酶K，涡旋混匀，50℃水浴，每隔20min轻轻混匀一次，至肌肉完全消化，肉眼见不到组织颗粒。为防止交叉污染，应一个样本使用一副手套和眼科剪，不得交叉使用。

2)加入等体积的酚-氯仿-异戊醇的混合液(25∶24∶1，v/v)，涡旋混匀1min。放入离心机，9000×g，室温离心10min，离心后，用移液器取上清液至另一1.5mL离心管中，重复步骤2一次。

3)取上清液至另一离心管中，加入1/10体积的10M乙酸铵、2.5倍体积冰预冷的无水乙醇混匀，放入-20℃冰箱中10min。

4)将离心管放入离心机，10000×g，4℃离心10min。

5)弃上清液，用冰预冷75％乙醇洗涤沉淀，弃上清液，将离心管放入离心机，10000×g、4℃离心15sec，用移液器吸掉残液，将离心管放入37℃烘箱10min，以促使残留的乙醇完全挥发。

6)向离心管中加0.5mL灭菌去离子水，同时加入终浓度为20μg/mL的RNase，56℃水浴30min，充分溶解DNA。

7)提取的DNA通过电泳或分光光度计分析，以确保满足PCR扩增的要求。

8)-20℃保存或立即用于下一步实验。

二、COI基因片段的PCR扩增及电泳分析

取上述DNA模板进行PCR扩增，PCR扩增体系如下：DNA模板2.0μL，10×Buffer 5.0μL，25mM Mgcl₂ 4.0μL，F1(10μM)1.0μL，F2(10μM)1.0μL，2.5mM dNTP 2.0μL，Pfu DNA聚合酶2.0U，最后用去离子水补足体积至50.0μL。每个样本设置3个平行，同时设置阴性对照(用去离子水代替DNA模板)。

PCR反应条件如下：

PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳(125V，电泳30min)及凝胶成像系统分析，将650bp的目的条带切下，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)纯化，将纯化后的PCR产物送测序公司测序。

三、序列分析

蓝鳍金枪鱼、大目金枪鱼和黄鳍金枪鱼的测序结果如下：

蓝鳍金枪鱼(T.maccoyii)：

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大目金枪鱼1(T.obesus)

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大目金枪鱼2(T.obesus)

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黄鳍金枪鱼(T.albacares)

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首先，将PCR产物的测序结果通过NCBI网站提供的在线BLAST工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，选择“Nucleotide BLAST”与网上序列数据库(在Nucleotide BLAST页面中，Database选择“Others(nr etc.)”)进行比对，根据比对结果，在“Description”栏目下可以明确判断是否属于金枪鱼属(Thunnus)，但该步骤的结果不能准确判断品种(Species)。

确定样本属于金枪鱼属后，需进一步分析PCR产物测序结果，蓝鳍金枪鱼的COI基因扩增片段的第337个碱基为胸腺嘧啶T，第508个碱基为鸟嘌呤G，而其它两种鱼在上述两个位点均为胞嘧啶C；大目金枪鱼COI基因扩增片段的第400个碱基为胞嘧啶C或者鸟嘌呤G，其它两种金枪鱼在该位点为胸腺嘧啶T。通过上述分析，可以将蓝鳍金枪鱼、黄鳍金枪鱼、大目金枪鱼这三种金枪鱼的生鱼片相互区别开。

Claims

1.一种蓝鳍、大目和黄鳍金枪鱼生鱼片的PCR鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：

1)提取金枪鱼生鱼片DNA；

F2：5-CCTCCTGCAGGGTCAAAGAA-3；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的PCR反应条件为：

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的琼脂糖凝胶电泳检测所用的凝胶浓度为0.8％。