CN105969893B - 一种榆黄蘑菌种鉴别的方法及专用dna条形码片段 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了榆黄蘑菌种鉴别的方法及专用DNA条形码片段。本发明提供了DNA条形码片段或与所述DNA条形码片段同源性大于99％的片段在鉴别或辅助鉴别榆黄蘑菌种中的应用；所述DNA条形码片段的核苷酸序列为序列3。本发明的实验证明，本发明提供的榆黄蘑DNA条形码片段，其可以用于鉴别榆黄蘑菌种，用该片段鉴别有利于缩短榆黄蘑菌种鉴定时间，提高鉴定准确性。

Description

一种榆黄蘑菌种鉴别的方法及专用DNA条形码片段
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种榆黄蘑菌种鉴别的方法及专用DNA条形码片段。
背景技术
我国是世界上最大的食用菌生产、消费大国，年产量约占世界食用菌产量75％。榆黄蘑味道鲜美，营养丰富，含蛋白质、维生素和矿物质等多种营养成分，其中氨基酸含量尤为丰富，且必需氨基酸含量高，属高营养、低热量食品。长期食用，有降低血压、降低胆固醇含量的功能，是老年人心血管疾病患者和肥胖症患者的理想保健食品。榆黄蘑还具有滋补强壮功效。不仅受国人喜爱，而且在国际市场较为抢手，生产和经营效益均显著高于一般农产品。菌种在榆黄蘑产业的发展中起着基础性的、重要的、不可替代的作用。一些假冒伪劣菌种充斥市场，严重损害产业发展。通过栽培试验检测榆黄蘑菌种，耗时较多。
因此，建立一种快速可靠的鉴定榆黄蘑菌种的方法迫在眉睫。DNA条形码技术应用一个标准的DNA序列，对物种进行快速准确鉴定，可实现对榆黄蘑菌种快速简便可靠的物种鉴定。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种DNA片段。
本发明提供的DNA片段，为如下1)或2)或3)：
1)、序列3所示的DNA片段；
2)、序列3第21-381位核苷酸所示的DNA片段；
3)、为与1)或2)所示片段的核苷酸序列同源性大于99％的片段。
本发明的另一个目的是提供所述DNA片段的新用途。
本发明提供了所述DNA片段在鉴别或辅助鉴别榆黄蘑菌种中的应用。
本发明第3个目的是提供检测榆黄蘑菌种基因组中是否含有所述DNA片段的物质的新用途。
本发明提供了检测榆黄蘑菌种基因组中是否含有所述DNA片段的物质在鉴别榆黄蘑菌种中的应用。
上述应用中，所述检测榆黄蘑菌种基因组中是否含有所述DNA片段的物质为如下1)或2)：
1)用于扩增所述DNA条形码片段的引物对；
2)含有所述引物对的PCR试剂或试剂盒。
上述应用中，所述引物对由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成。
或所述PCR试剂中，所述引物1和所述引物2的摩尔比为1:1。
或所述PCR试剂中，所述引物1和所述引物2的浓度均为10μmol/L。
本发明第4个目的是提供一种鉴别或辅助鉴别榆黄蘑菌种的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：检测待测样品中是否含有所述DNA片段；如果含有，则待测样品为或候选为榆黄蘑菌种；如果不含有，则待测样品不为或候选不为榆黄蘑菌种。
上述方法中，
所述检测待测样品中是否含有所述DNA片段的方法包括如下步骤：
1)用序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的引物对对待测样品进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
2)测序所述PCR扩增产物，将所述PCR扩增产物的序列与所述DNA片段进行比对，若同源性大于99％，则待测样品中含有所述DNA片段，若同源性小于等于99％，则待测样品中不含有所述DNA片段。
上述方法中，
所述PCR扩增的模板为待测样品的基因组DNA。
本发明第5个目的是提供检测榆黄蘑菌种基因组中是否含有所述DNA片段的物质。
本发明提供的检测榆黄蘑菌种基因组中是否含有所述DNA片段的物质，其为如下1)或2)：
1)用于扩增所述DNA条形码片段的引物对；
2)含有所述引物对的PCR试剂或试剂盒。
上述物质中，所述引物对由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成。
或所述PCR试剂中，所述引物1和所述引物2的摩尔比为1:1。
或所述PCR试剂中，所述引物1和所述引物2的浓度均为10μmol/L。
本发明的实验证明，为克服栽培试验鉴定榆黄蘑菌种的缺陷，本发明提供了一种榆黄蘑(Pleurotus citrinopileatus)菌种DNA条形码鉴定方法，可以快速准确地鉴别榆黄蘑菌种；采用榆黄蘑DNA条形码片段，其可以用于鉴别榆黄蘑菌种，用该片段鉴别有利于缩短榆黄蘑菌种鉴定时间，提高鉴定准确性。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、榆黄蘑菌种鉴别DNA条形码片段的获得及方法的建立
1、榆黄蘑菌种的基因组DNA获得
提取榆黄蘑菌种的基因组DNA。
2、PCR扩增
以上述1得到的基因组DNA为模板，用引物728F和引物1567R进行PCR扩增。
728F：5'-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3'(序列1)
1567R：5'-ACHGTRCCRATACCACCRATCTT-3’(序列2)
上述PCR扩增体系为如下表1：
表1 为PCR反应体系的组成(25μL)
上述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火55s，每个循环降低1℃，72℃延伸90s，10个循环；94℃变性30s，55℃退火55s，72℃延伸90s，36个循环；最后72℃7min。
得到大约850bp的PCR扩增产物。
将大约850bp的PCR扩增产物送去测序，测序引物为728F和Efjr；引物序列为：Efjr:5'-TGYTCNCGRGTYTGNCCRTCYTT-3'。
该PCR产物具有序列表中序列3所示的核苷酸，其中序列3第1-20位为上游引物728F，序列3第382-404位为下游引物Efjr的反向互补序列，该序列所示的片段或序列3第21-381为榆黄蘑菌种鉴别DNA条形码片段。
榆黄蘑菌种鉴别DNA条形码片段可用于鉴别榆黄蘑菌种，具体方法如下：
检测待测样品的基因组中是否含有榆黄蘑标准鉴别DNA条形码片段或含有与其同源性在99％以上的片段，若含有，则待测样品是榆黄蘑菌种，若不含有，则待测样品不是榆黄蘑菌种。
实施例2、鉴别榆黄蘑菌种
1、本发明方法特异性检测
分别提取已知品种的榆黄蘑菌种、鲍鱼菇(Pleurotus abalonus)菌种的基因组DNA。
以各品种的基因组DNA作为模板，用上述引物728F和1567R扩增，得到各品种的PCR产物。
将各品种的PCR产物送去测序，结果如下:
已知品种的榆黄蘑菌种的PCR产物的核苷酸序列为序列3(榆黄蘑菌种鉴别DNA条形码片段)。
已知品种的鲍鱼菇菌种的PCR产物的核苷酸序列为序列4(序列4第1-20位为上游引物728F，序列4第385-407位为下游引物Efjr的反向互补序列)；
已知品种的榆黄蘑菌种用本发明方法也鉴别为榆黄蘑菌种；
已知品种的鲍鱼菇菌种的PCR产物的序列4第21-384位核苷酸与榆黄蘑菌种鉴别DNA条形码片段序列3第21-381位核苷酸进行比对，同源性为75.1％，已知品种的鲍鱼菇菌种用本发明方法鉴别不为榆黄蘑菌种。
2、ITS鉴定与本发明方法比较
分别提取已知品种的榆黄蘑菌种、鲍鱼菇(Pleurotus abalonus)菌种的基因组DNA。
以各品种的基因组DNA作为模板，用上述引物ITS1和引物ITS4扩增，得到各品种的PCR产物。
ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’
ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
上述PCR扩增体系为表2：
表2 PCR反应体系的组成(25μL)
上述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃10min。
得到700bp左右的PCR扩增产物。
将700bp左右的PCR扩增产物送去测序，得到榆黄蘑菌种ITS序列(序列5，其中1-19位为引物ITS1，655-674位为引物ITS4反向互补序列)与鲍鱼菇菌种ITS序列(序列6，其中1-19位为引物ITS1，669-688位为引物ITS4反向互补序列)。
序列5第20-654位与序列6第20-668位同源性为：80.2％，异质性为19.8％，即榆黄蘑菌种与鲍鱼菇菌种ITS序列的异质性为19.8％。而本方法得到的两者同源性为75.1％，异质性为24.9％。灵敏度高于ITS序列。

Claims (10)

1.一种DNA片段，为序列3第21-381位核苷酸所示的DNA片段。
2.权利要求1所述的DNA片段在鉴别或辅助鉴别榆黄蘑菌种中的应用。
3.检测榆黄蘑菌种基因组中是否含有权利要求1所述DNA片段的物质在鉴别榆黄蘑菌种中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述物质为如下1）或2）：
1）用于扩增所述DNA片段的引物对；
2）含有所述引物对的PCR试剂或试剂盒。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述引物对由引物1和引物2组成，所述引物1为序列表中序列1所示的单链DNA分子；所述引物2为序列表中序列2所示的单链DNA分子；所述PCR试剂中，所述引物1和所述引物2的摩尔比为1:1；
所述PCR试剂中，所述引物1和所述引物2的浓度均为10 μmol/L。
6.一种鉴别或辅助鉴别榆黄蘑菌种的方法，包括如下步骤：检测待测样品中是否含有权利要求1所述DNA片段；如果含有，则待测样品为或候选为榆黄蘑菌种；如果不含有，则待测样品不为或候选不为榆黄蘑菌种。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述检测待测样品中是否含有权利要求1所述DNA片段的方法包括如下步骤：
1）用序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的引物对对待测样品进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
2）测序所述PCR扩增产物，将所述PCR扩增产物的序列与所述DNA片段进行比对，若同源性大于99%，则待测样品中含有所述DNA片段，若同源性小于等于99%，则待测样品中不含有所述DNA片段。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：
所述PCR扩增的模板为待测样品的基因组DNA。
9.检测榆黄蘑菌种基因组中是否含有权利要求1所述DNA片段的物质，其为如下1）或2）：
1）用于扩增所述DNA片段的引物对；
2）含有所述引物对的PCR试剂或试剂盒。
10.根据权利要求9所述的物质，其特征在于：所述引物对由引物1和引物2组成，所述引物1为序列表中序列1所示的单链DNA分子；所述引物2为序列表中序列2所示的单链DNA分子；
所述PCR试剂中，所述引物1和所述引物2的摩尔比为1:1；
所述PCR试剂中，所述引物1和所述引物2的浓度均为10 μmol/L。
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