CN107488736A - 一种鉴定鳗鲡种质的引物、试剂盒和方法 - Google Patents

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江兴龙
罗碧莲
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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Abstract

本发明披露了一种鉴定鳗鲡种质的引物，还披露了含有所述引物的试剂盒，以及使用所述引物或试剂盒进行鳗鲡种质鉴定的方法。使用本发明所述的引物、试剂盒或方法检测一次样品的时间仅为2‑3个小时，可同时检测很多个样品，具有高效便捷的特点。更方便的是，本方法不需要大型仪器，通电的情况下，可随时在现场进行检测，且操作简便，稳定性重复性好，实用性强。

Description

一种鉴定鳗鲡种质的引物、试剂盒和方法
技术领域
本发明用于鉴定或辅助鉴定鳗鲡种质，涉及分子标记技术领域，特别涉及对对鳗鲡的鉴别和检测技术。
背景技术
近二十多年来，鳗鲡养殖业在我国占有很大的市场，但目前，鳗鲡养殖苗种完全依赖天然鳗苗，而天然鳗苗因过度捕捞和水环境污染等原因，捕捞量在急剧减少，导致鳗苗价格持续上涨。由于自然或人为因素，容易导致不同种鳗苗混杂现象。另外，由于不同种鳗苗的市场价格差异较大，有商家将低价鳗苗参入高价鳗苗中，从而获取更大的利益。而白仔鳗苗在形态上十分相似，很难通过形态学进行辨别，这样就造成了我国鳗鲡养殖业苗种资源比较混乱的局面，而不同的鳗鲡种质具有不同的生物学特征和环境要求，盲目养殖会增加养殖风险。同时，自然保护国际联盟组织已将欧洲鳗列为极度濒危物种，将对其实施新的监管措施，我国鳗鱼产品(如烤鳗)出口日本，要提供检验检疫部门出具的鳗鱼物种鉴定报告。
目前鳗鲡的鉴定方法主要有以下几种：1，利用肉眼观察、镜检等技术观察鳗鲡的形态学特征，并结合药检对美洲鳗鲡、花鳗鲡、日本鳗鲡、欧洲鳗鲡等进行种质鉴定。但由于形态学标记技术不够准确、稳定，易受环境因素的影响，因此这种方法用来对鳗鲡的种质鉴定并不可靠，所以要结合分子生物学技术来进行更深入的研究。2，利用AFLP技术和线粒体DNA CO Ⅰ和CO Ⅱ分子标记技术成功的对美洲鳗鲡、日本鳗鲡、欧洲鳗鲡、非洲鳗鲡、印尼鳗鲡6种鳗鲡进行鉴定区分。然而，利用AFLP技术操作过程比较复杂，对DNA的质量以及操作人员技术水平要求较高，一般实验室开展此技术尚存在困难。而利用线粒体DNA CO Ⅰ和CO Ⅱ分子标记技术需要测序，步骤繁琐，耗时较长，成本高。
此外，目前用于鉴定鱼类的分子生物学技术还有许多，有限制性片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性分析(SSCP)和特异性PCR等。但RFLP这种方法操作繁琐，相对费时，要求DNA的量大，并且可能因为碱基突变而导致限制性酶切位点的丢失或获得。SSCP的结果易受多种因素影响，并且当单链DNA碱基序列自身的差异或者突变对单链立体构象无影响时，可能会因此产生假阴性结果而导致漏检。特异性PCR的方法需要测序，耗时长，无法满足现场检测的要求。
以上所述的几种方法均存在着或操作繁琐，耗时长，成本高，或对技术人员、设备要求高等问题，都不适用于生产应用。
发明内容
基于此，急需一种能够在现场快速、高效使用的鉴定鳗鲡种质的方法。
本发明提出一种鉴定鳗鲡种质的引物，包括以下4对引物中的一种或多种，所述4对引物序列为：
aj S1:TTATGGCTGATTCATCCGAAATT、aj A1 CCTGCTAATGGGTTGAGTACTAAA，片段大小889；
r-a S1 TGATGCTGACTTTGCCACTGAT；r-a A2 GTTCGTTCCCTTGAAAACCTTGT，片段大小341；
bp-m S5 TCCATACTTCTCATACAAAGACCTAT、bp-m A3CTAGTCAACCTACTAATGGGTTTAAT，片段大小457；
m-a S4 CCGCCGTCCCATACGTAGGAG、m-a A4 TATTTTGTTTTCTAGTCAACCTACTAAT，片段大小678。
本发明还提出了一种鉴定鳗鲡种质的试剂盒，包括以下4对引物中的一种或多种，所述4对引物序列为：
aj S1:TTATGGCTGATTCATCCGAAATT、aj A1 CCTGCTAATGGGTTGAGTACTAAA，片段大小889；
r-a S1 TGATGCTGACTTTGCCACTGAT ；r-a A2 GTTCGTTCCCTTGAAAACCTTGT，片段大小341；
bp-m S5 TCCATACTTCTCATACAAAGACCTAT、bp-m A3CTAGTCAACCTACTAATGGGTTTAAT，片段大小457；
m-a S4 CCGCCGTCCCATACGTAGGAG、m-a A4 TATTTTGTTTTCTAGTCAACCTACTAAT，片段大小678。
本发明还提出一种鉴定鳗鲡种质的方法，包括如下步骤：
提取日本鳗鲡、美洲鳗鲡、花鳗鲡、太平洋双色鳗鲡、欧洲鳗鲡中任一苗种或烤鳗产品的基因组DNA；
用如前所述的引物对鳗鲡DNA样品进行PCR扩增；
根据琼脂糖凝胶电泳检测条带的大小以及阴性或阳性结果判断鳗鲡种质。
进一步地，所述的鉴定鳗鲡种质的方法中，所述步骤“对鳗鲡DNA样品进行PCR扩增”中的PCR反应条件具体包括：
94℃预变性5分钟；
27个循环的94℃变性45秒、58℃退火45秒、72℃延伸45秒过程；
72℃延伸5分钟。
进一步地，所述的鉴定鳗鲡种质的方法中，所述“根据琼脂糖凝胶电泳检测条带的大小或阴性阳性结果判断鳗鲡种质”具体包括：
引物对ajS1/ajA1的PCR结果为阳性者，判断为日本鳗鲡；
引物对r-aS1/r-aA2的PCR结果为阳性者，判断为美洲鳗鲡；
引物对bp-mS5/bp-mA3和m-aS4/m-aA4的PCR结果为阳性者，判断为太平洋双色鳗鲡；
引物对m-aS4/m-aA4的PCR结果为阳性者，判断为花鳗鲡；
引物对ajS1/ajA1、r-aS1/r-aA2、bp-mS5/bp-mA3和m-aS4/m-aA4的PCR结果均为阴性者，判断为欧洲鳗鲡。
本发明所述的鉴定鳗鲡种质的方法检测一次样品的时间仅为2-3个小时，可同时检测很多个样品，具有高效便捷的特点。更方便的是，本方法不需要大型仪器，通电的情况下，可随时在现场进行检测，且操作简便，稳定性重复性好，实用性强。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式详予说明。
第1实施例
一种鉴定鳗鲡种质的引物，包括以下4对引物中的一种或多种，所述4对引物序列为：
aj S1:TTATGGCTGATTCATCCGAAATT、aj A1 CCTGCTAATGGGTTGAGTACTAAA，片段大小889；
r-a S1 TGATGCTGACTTTGCCACTGAT；r-a A2 GTTCGTTCCCTTGAAAACCTTGT，片段大小341；
bp-m S5 TCCATACTTCTCATACAAAGACCTAT、bp-m A3CTAGTCAACCTACTAATGGGTTTAAT，片段大小457；
m-a S4 CCGCCGTCCCATACGTAGGAG、m-a A4 TATTTTGTTTTCTAGTCAACCTACTAAT，片段大小678。
本实施例所述的引物在应用于鉴定鳗鲡种质的过程中，在一次PCR过程中用到多条引物进行扩增，避免了分次扩增造成的资源和时间浪费，可以有效提高效率，且引物间不会相互影响。
第2实施例
一种鉴定鳗鲡种质的试剂盒，所述试剂盒中包括以下4对引物中的一种或多种，所述4对引物序列为：
aj S1:TTATGGCTGATTCATCCGAAATT、aj A1 CCTGCTAATGGGTTGAGTACTAAA，片段大小889；
r-a S1 TGATGCTGACTTTGCCACTGAT；r-a A2 GTTCGTTCCCTTGAAAACCTTGT，片段大小341；
bp-m S5 TCCATACTTCTCATACAAAGACCTAT、bp-m A3CTAGTCAACCTACTAATGGGTTTAAT，片段大小457；
m-a S4 CCGCCGTCCCATACGTAGGAG、m-a A4 TATTTTGTTTTCTAGTCAACCTACTAAT，片段大小678。
本实施例所述的试剂盒在应用于鉴定鳗鲡种质的过程中，在一次PCR过程中用到多条引物进行扩增，避免了分次扩增造成的资源和时间浪费，可以有效提高效率，且引物间不会相互影响。
第3实施例
一种鉴定鳗鲡种质的方法，包括如下步骤：
1，提取日本鳗鲡、美洲鳗鲡、花鳗鲡、太平洋双色鳗鲡、欧洲鳗鲡中任一苗种或烤鳗产品的基因组DNA；
2，用引物对鳗鲡DNA样品进行PCR扩增，PCR反应条件具体包括：
94℃预变性5分钟；
27个循环的94℃变性45秒、58℃退火45秒、72℃延伸45秒过程；
72℃延伸5分钟。
3、用琼脂糖凝胶电泳检测条带的阴性和阳性以及大小可以快速鉴定鳗鲡种质，结果如下表：
表不同引物的PCR结果
注：+表示阳性，—表示阴性
使用本方法不同引物扩增出来的片段大小不同，日本鳗鲡为889bp，南美洲鳗鲡与北美洲鳗鲡均为341bp，吕宋鳗鲡与花鳗鲡均为678bp，其中太平洋双色鳗鲡扩增出来的有两条条带，一条为大小为678bp，另一条为457bp。因而，也可根据片段大小做判断。当然，同时根据片段大小和PCR结果的阴阳性判断是最准确的。本实施例所述的方法在鉴定鳗鲡种质的过程中，在一次PCR过程中用到多条引物进行扩增，避免了分次扩增造成的资源和时间浪费，可以有效提高效率，且引物间不会相互影响。
使用本发明所述的引物、试剂盒或方法检测一次样品的时间仅为2-3个小时，可同时检测很多个样品，具有高效便捷的特点。更方便的是，本方法不需要大型仪器，通电的情况下，可随时在现场进行检测，且操作简便，稳定性重复性好，实用性强。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (5)

1.一种鉴定鳗鲡种质的引物，其特征在于，包括以下4对引物中的一种或多种，所述4对引物序列为：
aj S1:TTATGGCTGATTCATCCGAAATT、aj A1 CCTGCTAATGGGTTGAGTACTAAA；
r-a S1 TGATGCTGACTTTGCCACTGAT；r-a A2 GTTCGTTCCCTTGAAAACCTTGT；
bp-m S5 TCCATACTTCTCATACAAAGACCTAT、bp-m A3 CTAGTCAACCTACTAATGGGTTTAAT；
m-a S4 CCGCCGTCCCATACGTAGGAG、m-a A4 TATTTTGTTTTCTAGTCAACCTACTAAT。
2.一种鉴定鳗鲡种质的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物。
3.一种鉴定鳗鲡种质的方法，其特征在于，包括如下步骤：
提取日本鳗鲡、美洲鳗鲡、花鳗鲡、太平洋双色鳗鲡、欧洲鳗鲡中任一苗种或烤鳗产品的基因组DNA；
用如权利要求1所述的引物对鳗鲡DNA样品进行PCR扩增；
根据琼脂糖凝胶电泳检测条带的大小或阴性阳性结果判断鳗鲡种质。
4.如权利要求3所述的鉴定鳗鲡种质的方法，其特征在于，所述步骤“对鳗鲡DNA样品进行PCR扩增”中的PCR反应条件具体包括：
94℃预变性5分钟；
27个循环的94℃变性45秒、58℃退火45秒、72℃延伸45秒过程；
72℃延伸5分钟。
5.如权利要求3或4所述的鉴定鳗鲡种质的方法，其特征在于，所述“根据琼脂糖凝胶电泳检测条带的大小或阴性阳性结果判断鳗鲡种质”具体包括：
引物对ajS1/ajA1的PCR结果为阳性者，判断为日本鳗鲡；
引物对r-aS1/r-aA2的PCR结果为阳性者，判断为美洲鳗鲡；
引物对bp-mS5/bp-mA3和m-aS4/m-aA4的PCR结果为阳性者，判断为太平洋双色鳗鲡；
引物对m-aS4/m-aA4的PCR结果为阳性者，判断为花鳗鲡；
引物对ajS1/ajA1、r-aS1/r-aA2、bp-mS5/bp-mA3和m-aS4/m-aA4的PCR结果均为阴性者，判断为欧洲鳗鲡。
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KR20100138208A (ko) * 2009-06-24 2010-12-31 대한민국(관리부서:국립수산과학원) 앵귈라 뱀장어 종들의 판별을 위한 ｄｎａ 마커

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