CN110791575A - 鉴定美洲鳗鲡南北地理种群的引物和方法 - Google Patents

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Abstract

为解决利用不同地理种群美洲鳗鲡D‑loop基因的差异序列进行引物设计和普通PCR方法无法达到鉴别的问题，发明人通过在引物中人为改变特定位置的碱基提高引物的特异性，提出了一种可有效鉴别美洲鳗鲡地理种群的引物，其具体特征如下：sAr F1的5’端到3’端序列为：TAACCAATAAAAAATGTAGAAAGGC；引物sAr R1的5’端到3’端序列为：AATACATTATGTTCTACCCTGGCCT。发明人同时还提出了利用上述引物进行鉴定美洲鳗鲡南北地理种群的方法，具有操作简便、快捷、耗时短、处理量大、试验成本低，以及鉴定结果准确可靠等优点。

Description

鉴定美洲鳗鲡南北地理种群的引物和方法
技术领域
本发明涉及农学领域，特别涉及一种鉴定美洲鳗鲡(Anguilla rostrata)南北地理种群的引物和方法。
背景技术
我国的鳗鲡养殖产量约占全世界的60％。，目前鳗鲡养殖苗种完全依赖天然鳗苗，全世界的鳗鲡总共有19种。在自然海区，同种类的鳗鲡分布有不同的地理种群，如美洲鳗鲡分为分布在美国的北美洲鳗鲡和分布在加勒比海等美洲中部地区的南美洲鳗鲡。由于南美洲鳗鲡和北美洲鳗鲡鳗苗的市场价格差异较大，有商家将低价鳗苗参入高价鳗苗中，从而获取更大的利益。另外，由于它们的养殖生态条件要求不同，盲目养殖会增加养殖风险。而南北美洲鳗鲡的白仔鳗苗在形态上十分相似，无法通过形态学进行辨别，这样就造成了我国美洲鳗鲡养殖业苗种资源比较混乱的局面。在2015年，美洲鳗鲡被列入世界自然保护联盟(IUCN)红皮书的濒危物种。如何更好的保护和利用美洲鳗鲡种质资源也是重要的研究课题。
目前鳗鲡的鉴定方法都集中在鳗鲡属的种间鉴定，主要有以下几种：1，利用肉眼观察、镜检等技术观察鳗鲡的形态学特征，并结合药检进行种质鉴定。但由于形态学标记技术不够准确、稳定，易受环境因素的影响，因此这种方法用来对鳗鲡的种质鉴定并不可靠。2，利用扩增片段长度多态性(AFLP)、限制性片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性分析(SSCP)等分子生物学技术进行鉴定。但这些方法操作繁琐，对DNA的质量以及操作人员技术水平要求较高，耗时长，无法满足现场检测的要求。3，多重PCR法，利用线粒体细胞色素B等基因严格的母性遗传的特性，通过不同种间的差异序列设计引物，进行多重PCR法进行鉴定。
由于南美洲鳗鲡和北美洲鳗鲡属于同种鳗鲡的不同地理种群，它们的细胞色素B基因的差异非常小，在1000bp左右的序列中仅有数个碱基的差异，无法利用它们来设计引物达到种内鉴别的要求。线粒体DNA控制区(D-loop)是mtDNA基因组中的序列和长度变异最大、进化速度最快的区域，常用于种群遗传研究。区别于现有技术，本发明技术方案在大量测定南美洲鳗鲡和北美洲鳗鲡不同种地理种群D-loop基因序列基础上，筛选出稳定的差异位点，发现变异位点约占总位点数5％，低于大多数物种的地理种群的变异位点，同时控制区的两侧未出现串连重复序列造成的长度变异。因此，利用不同地理种群美洲鳗鲡D-loop基因的差异序列进行引物设计和普通PCR方法无法达到鉴别的要求。
发明内容
基于此，需要提供一种可以有效区分美洲鳗鲡南北种群，结果准确可靠，同时兼具简便、快速、高效、处理量大、成本低等优点的技术方案。
发明人提出了一种鉴定美洲鳗鲡(Anguilla rostrata)南北地理种群的引物，引物sArF1的5’端到3’端序列为：TAACCAATAAAAAATGTAGAAAGGC；引物sAr R1的5’端到3’端序列为：AATACATTATGTTCTACCCTGGCCT。
进一步地，所述的鉴定美洲鳗鲡南北地理种群的引物中，使用该引物得到的产物片段大小为510。
发明人同时还提出了一种鉴定美洲鳗鲡南北地理种群的方法，包括如下步骤：
使用如上所述的鉴定美洲鳗鲡南北地理种群的引物，对待测定种群鳗鲡的DNA样品进行改良touch-down PCR扩增；进行琼脂糖凝胶电泳实验，检测条带显示阳性则判定待测定种群鳗鲡为南美洲鳗鲡，检测条带显示阴性则判定待测定种群鳗鲡为北美洲鳗鲡。
进一步地，所述的鉴定美洲鳗鲡南北地理种群的方法中，在步骤“使用如权利要求1或2所述的鉴定美洲鳗鲡南北地理种群的引物，对待测定种群鳗鲡的DNA样品进行改良touch-down PCR扩增”之前，还包括步骤：提取待测定种群鳗鲡的DNA，所述待测定种群鳗鲡为南美洲鳗鲡或北美洲鳗鲡。
进一步地，所述的鉴定美洲鳗鲡南北地理种群的方法中，所述改良touch-downPCR扩增的具体条件为：94℃预变性3分钟；10个循环的94℃变性30秒、65℃退火30秒、72℃延伸45秒过程；15个循环的94℃变性30秒、60℃退火30秒、72℃延伸45秒过程；72℃延伸5分钟
进一步地，所述的鉴定美洲鳗鲡南北地理种群的方法中，检测条带显示阳性且其条带大小为510时判定待测定种群鳗鲡为南美洲鳗鲡。
线粒体DNA控制区(D-loop)是mtDNA基因组中的序列和长度变异最大、进化速度最快的区域，常用于种群遗传研究。区别于现有技术，本方法在大量测定南美洲鳗鲡和北美洲鳗鲡地理种群D-loop基因序列基础上，筛选出稳定的差异位点，发现变异位点约占总位点数5％，低于大多数物种的地理种群的变异位点，同时控制区的两侧未出现串连重复序列造成的长度变异。因此，利用不同地理种群美洲鳗鲡D-loop基因的差异序列进行引物设计和普通PCR方法无法达到鉴别的要求。基于这些差异序列设计引物时，为提高引物特异性，发明人不完全根据D-loop序列，而是在引物中人为改变特定位置的碱基，并且结合touch-down PCR等方法，摸索适宜的反应条件，特异性的扩增相应地理种群的片段，经过批量试验，结果稳定可靠的区分出美洲鳗鲡的南北种群。上述技术方案具有操作简便、快捷、耗时短、处理量大(即每一次PCR最多可同时检测96尾美洲鳗鲡的地理种群)，试验成本低，以及鉴定结果准确可靠等优点，是一种高效率的美洲鳗鲡地理种群鉴定方法，在大量试验研究的基础上中具有很好的应用价值，为开发和应用美洲鳗鲡地理种群快速鉴定试剂盒提供坚实的基础。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式详予说明。
第一实施例
一种鉴定美洲鳗鲡南北地理种群的引物，引物sAr F1的5’端到3’端序列为：TAACCAATAAAAAATGTAGAAAGGC；引物sAr R1的5’端到3’端序列为：AATACATTATGTTCTACCCTGGCCT。使用该引物得到的产物片段大小为510。碱基序列中标红标粗的“G”与“C”为人为改变的特定位置碱基。
第二实施例
一种鉴定美洲鳗鲡南北地理种群的方法，包括如下步骤：
S1、提取待测定种群鳗鲡的DNA，所述待测定种群鳗鲡为南美洲鳗鲡或北美洲鳗鲡；
S2、使用鉴定美洲鳗鲡南北地理种群的引物对待测定种群鳗鲡的DNA样品进行改良touch-down PCR扩增；
所述引物特征如下：引物sAr F1的5’端到3’端序列为：TAACCAATAAAAAATGTAGAAAGGC；引物sAr R1的5’端到3’端序列为：AATACATTATGTTCTACCCTGGCCT；使用该引物得到的产物片段大小为510；碱基序列中标红标粗的“G”与“C”为人为改变的特定位置碱基。
所述改良touch-downPCR扩增的具体条件为：94℃预变性3分钟；10个循环的94℃变性30秒、65℃退火30秒、72℃延伸45秒过程；15个循环的94℃变性30秒、60℃退火30秒、72℃延伸45秒过程；72℃延伸5分钟；
S3、进行琼脂糖凝胶电泳实验，检测条带显示阳性则判定待测定种群鳗鲡为南美洲鳗鲡，检测条带显示阴性则判定待测定种群鳗鲡为北美洲鳗鲡。更进一步和更精确地，当检测条带为阳性且其条带大小为510时判定待测定种群鳗鲡为南美洲鳗鲡。
为了更好地说明本发明的技术效果，以下以经本发明改良前的传统引物的使用效果进行对比：
一种鉴定美洲鳗鲡南北地理种群的引物，引物sAr F1的5’端到3’端序列为：TAACCAATAAAAAATGTAGAAAGCC；引物sAr R1的5’端到3’端序列为：AATACATTATGTTCTACCCTGGCGT。使用该引物得到的产物片段大小为510。引物碱基序列能够与南美洲鳗鲡D-loop基因对应序列全部配对。
使用的PCR扩增的具体条件为：94℃预变性3分钟；25个循环的94℃变性30秒、62℃退火30秒、72℃延伸45秒过程；72℃延伸5分钟。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，南美洲鳗鲡(S1-S3)显示510bp阳性检测条带，部分北美洲鳗鲡也显示阳性条带(N2)，出现假阳性现象。检测结果不符合要求。
基于这些差异序列设计引物时，为提高引物特异性，发明人不完全根据D-loop序列，而是在引物中人为改变特定位置的碱基，并且结合touch-down PCR等方法，摸索适宜的反应条件，特异性的扩增相应地理种群的片段，经过批量试验，结果稳定可靠的区分出美洲鳗鲡的南北种群。上述技术方案检测一次样品的时间仅为2-3个小时，可同时检测很多个样品，效率高；不需要大型仪器，通电的情况下，可随时在现场进行检测；操作简便，稳定性重复性好，实用性强。简言之，具有操作简便、快捷、耗时短、处理量大(即每一次PCR最多可同时检测96尾美洲鳗鲡的地理种群)，试验成本低，以及鉴定结果准确可靠等优点，是一种高效率的美洲鳗鲡地理种群鉴定方法，在大量试验研究的基础上中具有很好的应用价值，为开发和应用美洲鳗鲡地理种群快速鉴定试剂盒提供坚实的基础。以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (6)

1.一种鉴定美洲鳗鲡南北地理种群的引物，其特征在于，引物sAr F1的5’端到3’端序列为：TAACCAATAAAAAATGTAGAAAGGC；引物sAr R1的5’端到3’端序列为：AATACATTATGTTCTACCCTGGCCT。
2.如权利要求1所述的鉴定美洲鳗鲡南北地理种群的引物，其特征在于，使用该引物得到的产物片段大小为510。
3.一种鉴定美洲鳗鲡南北地理种群的方法，其特征在于，包括如下步骤：
使用如权利要求1或2所述的鉴定美洲鳗鲡南北地理种群的引物，对待测定种群鳗鲡的DNA样品进行改良touch-down PCR扩增；进行琼脂糖凝胶电泳实验，检测条带显示阳性则判定待测定种群鳗鲡为南美洲鳗鲡，检测条带显示阴性则判定待测定种群鳗鲡为北美洲鳗鲡。
4.如权利要求3所述的鉴定美洲鳗鲡南北地理种群的方法，其特征在于，在步骤“使用如权利要求1或2所述的鉴定美洲鳗鲡南北地理种群的引物，对待测定种群鳗鲡的DNA样品进行改良touch-downPCR扩增”之前，还包括步骤：提取待测定种群鳗鲡的DNA，所述待测定种群鳗鲡为南美洲鳗鲡或北美洲鳗鲡。
5.如权利要求3或4所述的鉴定美洲鳗鲡南北地理种群的方法，其特征在于，所述改良touch-down PCR扩增的具体条件为：94℃预变性3分钟；10个循环的94℃变性30秒、65℃退火30秒、72℃延伸45秒过程；15个循环的94℃变性30秒、60℃退火30秒、72℃延伸45秒过程；72℃延伸5分钟。
6.如权利要求5所述的鉴定美洲鳗鲡南北地理种群的方法，其特征在于，检测条带显示阳性且其条带大小为510时判定待测定种群鳗鲡为南美洲鳗鲡。
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